Centro de Investigaciones del Ozono
Dr. Ricardo González, Dra. Cheyla Romay y Dra. Silvia Díaz-Llera
Se hizo una revisión, dado que existen evidencias contradictorias sobre la genotoxicidad del ozono y se analizó la bibliografía existente sobre este tópico importante de la toxicología y las valoraciones al respecto. El ozono es una especie reactiva de oxígeno y un constituyente natural importante de la atmósfera, existen numerosas evidencias y el consenso de sus efectos tóxicos para el ser humano y los animales, especialmente por vía inhalatoria que afecta los bronquios y pulmones. Sin embargo, también muchas evidencias se han acumulado de que este gas cuando es utilizado por otras vías de administración puede ejercer efectos beneficiosos como tratamiento de enfermedades diversas, lo que ha dado apoyo al desarrollo de la ozonoterapia, sobre la que hoy se investiga en numerosos países y entre estos Cuba.
Palabras clave: Ozono, genotoxicidad, actividad clastogénica, aberraciones cromosómicas.
El ozono (O3), es una especie de oxígeno reactivo y un importante constituyente de la atmósfera. La exposición aguda al gas por inhalación se ha reportado que produce inflamación pulmonar y daño celular al epitelio de la cavidad nasal, a los bronquios y bronquiolos, así como a los macrófagos alveolares, todo lo cual provoca la hiperreactividad bronquial y la inducción y el agravamiento de las crisis de asma.1-3 Sin embargo, la ozonoterapia utilizada por otras vías de administración se investiga en forma creciente en numerosos países y los institutos nacionales de salud de Alemania, Italia, Austria y Rusia, entre otros países, la aceptan como medicina alternativa.4,5 En Cuba el O3 también se ha investigado durante más de una década con resultados alentadores para el tratamiento de diversas enfermedades humanas6,7 y se trabaja con el objetivo de lograr su registro sanitario como agente terapéutico.
]]> Teniendo en cuenta que existen algunos reportes contradictorios sobre la genotoxicidad del O3 y dada la importancia de este tópico en los estudios sobre la toxicidad de fármacos y agentes terapéuticos potenciales se decidió realizar una revisión bibliográfica exhaustiva sobre este tema que se expondrá a continuación.El primer experimento sobre la genotoxicidad del ozono por vía inhalatoria fue realizado por Zelac y otros8 Estos autores utilizaron hamsters chinos hembras que fueron expuestos a dosis de ozono de 0,48 y 0,60 mg.m-3 durante 5 h. Los resultados fueron comparados con un grupo control no tratado. Se observó que la frecuencia de aberraciones cromosómicas en los linfocitos periféricos de los grupos tratados con O3 era significativamente mayor con respecto al grupo control inmediatamente después de la exposición al O3 y 15 d después del tratamiento. Sin embargo, Tice y otros9 expusieron a los hamsters chinos a una dosis mayor de O3 (0,8 mg.m-3) durante 5 h y no detectaron aberraciones cromosómicas en los linfocitos ni en las células de la médula ósea de los animales. Tampoco hubo incremento en la frecuencia de intercambio de cromátidas hermanas (ICH) en los linfocitos de los hamsters chinos ni en las células de la médula ósea de ratones C57B16 expuestos a 4 mg.m-3 de O3 durante 6 h al ser examinados inmediatamente y 1, 2 y 3 semanas después de la exposición al O3.
Gooch y otros10 no detectaron inducción de aberraciones cromosómicas y cromatídicas en linfocitos de hamsters chinos y ratones C3H expuestos a dosis de O3 de 2 mg.m-3 durante 2 h. Estos autores tampoco observaron translocaciones recíprocas en los espermatozoides de los animales tratados con O3.
Coincidiendo con los resultados anteriores, Zhurkov y otros11 tampoco observaron aberraciones cromosómicas y cromatídicas en las células de médula ósea de ratas expuestas a 0,15 mg.m-3 de O3 durante 8 h diarias por 7 d ó a 5,6 mg.m-3 por 5 d. Bajo estas últimas condiciones experimentales la actividad mitótica en la médula ósea se redujo significativamente.
En concordancia con los resultados de los estudios anteriores, en Cuba, Fernández y otros12 evaluaron la actividad citotóxica y clastogénica en la médula ósea de ratones tratados con O3 por las vías intraperitoneal (ip) e intramuscular (im) a las dosis de 460, 930, 1 400 y 2 300 mg/kg de peso corporal, realizando 15 aplicaciones de cada una. El O3 resultó citotóxico solo a la dosis de 2 300 mg/kg por vía ip; además presentó una actividad clastogénica débil a esta dosis y a la de 1 400 mg/kg. Estas dosis fueron 10 y 7 veces mayores respectivamente, que la máxima dosis terapéutica de O3 empleada para la autohemoterapia en humanos.
En los animales que recibieron el tratamiento con O3 por vía intramuscular se detectó un efecto citotóxico a partir de la dosis de 930 mg/kg, el cual es 66 veces superior que la máxima utilizada en humanos. La dosis inferior (460 mg/kg) no indujo incrementos significativos de aberraciones en los cromosomas de las células con respecto a los controles no tratados.
En otra investigación llevada a cabo por Fernández y otros13 se evaluó el efecto del O3 sobre la espermatogénesis en ratones. El O3 se administró en una mezcla con O2, por vía intratesticular en dosis de 35, 50 y 70 mg/kg. Como resultado se obtuvo que no hubo afectación en la relación peso del testículo/peso corporal en los animales tratados con O3 a ninguna de las dosis evaluadas. Sin embargo se detectó disminución del conteo de espermatozoides y alteraciones morfológicas con todas las dosis de O3 en la segunda semana posterior al tratamiento, efectos que desaparecieron en las semanas subsiguientes. El ensayo de síntesis no programada de ADN realizado utilizando timidina tritiada tuvo un resultado negativo.
Más reciente, Remigio y otros14 evaluaron la actividad citotóxica y clastogénica en roedores tratados con O3 por insuflación rectal, a través del análisis citogenético de la médula ósea en ratones CENP:NMRI mediante el ensayo de micronúcleos y en ratas CENP:SPRD mediante el análisis de las aberraciones cromosómicas, utilizando las dosis de O3 de 5 y 7,5 mg/kg en los ratones y 0,44 y 0,66 mg/kg en ratas. En este experimento se utilizaron controles negativos y positivos, respectivamente, realizándose en todos los casos una aplicación diaria durante 10 d consecutivos. Los autores no observaron evidencias de efectos citogenéticos en la médula ósea de los animales tratados con la mezcla O3/O2 por vía rectal una vez finalizado el tratamiento. No obstante las dosis de O3 ensayadas en este estudio en las ratas, son relativamente bajas, por lo cual el resultado en esta especie se considera no es concluyente.
En los estudios de genotoxicidad del O3 realizados en suspensiones de microorganismos (E. coli y Salmonella) a los que se les burbujeó el gas, los resultados han sido contradictorios.
Hamelin y Chung15 burbujearon suspensiones de E. coli con O3 en un intervalo de concentraciones entre 0,1 y 100 mg.m-3 por períodos que oscilaron entre 15 y 60 min y observaron la inducción de mutaciones hacia delante y reversas en sus genomas respectivos, así como roturas en la cadena del ADN.
]]> En contraste con lo anterior, en el ensayo de Ames en el que una mezcla de O3/aire se pasó sobre placas de agar contenidas en una cámara de exposición e inoculadas con Salmonella,16 no se detectaron efectos mutagénicos a concentraciones de O3 desde 1 hasta 4 mg.m-3 con la utilización de activación metabólica (S9) en el ensayo o sin esta. Las concentraciones de O3 mayores que 4 mg.m-3 resultaron tóxicas para la bacteria en este estudio. Sin embargo, en otro estudio Dillon y otros17 reportaron mutagenicidad del O3 en otra cepa de Salmonella.En relación con la evaluación de la genotoxicidad del O3 en insectos, se destaca el estudio realizado por Erdman y Hernández18 en el cual se expusieron moscas Drosophila viridis machos a una concentración de O3 de 60 mg.m-3 durante 3 h. Períodos de tiempo mayores fueron letales para las moscas. En este estudio el O3 indujo mutaciones del tipo dominante letales en la descendencia, calculadas por la proporción de huevos que fallaron en evolucionar a pupas.
En los estudios citogenéticos realizados en cultivos de células, Fetner19 fue el primero que demostró que el O3 produce daño en los cromosomas (aberraciones en cromátidas) utilizando líneas de células KB humanas que expuso a la concentración de 16 mg.m -3 durante 5 o 10 min.
Gooch y otros10 estudiaron el efecto del burbujeo de O3 a través de una suspensión de linfocitos humanos. Cuando las células fueron tratadas en fase S, la frecuencia en la pérdida de cromátidas se incrementó pero no se detectaron aberraciones en los cromosomas.
Resultados similares obtuvieron Guerrero y otros20 al exponer cultivos de 24 h de células de pulmón fetal humano (WI-38) a niveles de O3 de 0,5; 1; 1,5; y 2 mg.m-3 durante 1 h. En este estudio se observó un incremento en la pérdida de cromátidas solo a la mayor dosis de O3 empleada (2 mg.m-3). Sin embargo, se produjo un incremento dependiente de la concentración de O3 en el ICH, pero no se observó incremento de las aberraciones cromosómicas.
Shiraishi y Bandow 21 expusieron células de hamsters chinos V79 a concentraciones de O3 en el intervalo de 0,26 a 2 mg.m-3 durante 2 h. Bajo estas condiciones el O3 indujo ICH y produjo una inhibición dependiente de la concentración en el crecimiento celular.
Hsueh y Xiang22 reportaron que el O3 induce ICH en los linfocitos humanos a concentraciones entre 0,3 y 1,5 mg.m-3.
Díaz-Llera y González 23 realizaron un estudio en pacientes tratados con O3 por vía intrarrectal y endovenosa y determinaron la frecuencia de micronúcleos en reticulocitos de la sangre periférica, comparándolos con otro grupo de pacientes portadores de linfoma de Hodgkin tratados con el citostático bleomicina, con efecto genotóxico reconocido.
Los resultados de este estudio demostraron que la ozonoterapia (15 sesiones con una concentración de 50 mg/mL en un volumen de 100 mL) no incrementa la frecuencia de los reticulocitos micronucleados en los pacientes tratados, lo cual confirmó los resultados obtenidos en otros estudios en cuanto a que el O3 ni sus intermediarios tienen efecto clastogénico aparente.
Merz y otros24 estudiaron las aberraciones cromosómicas en linfocitos periféricos de 6 personas expuestas al O3 a una concentración de 1 mg.m-3 durante 6 y 10 h. Los sujetos sirvieron como sus propios controles, las muestras de sangre fueron tomadas antes y después del tratamiento. Los autores no observaron aberraciones en los cromosomas de ninguno de los sujetos. Sin embargo, la mayoría mostró pérdida de cromátidas después de la exposición.
]]> McKenzie y otros25 también realizaron estudios citogenéticos en 26 sujetos jóvenes saludables del sexo masculino y no fumadores expuestos a 0,8 mg.m-3 de O3 durante 4 h. Las muestras de sangre fueron tomadas inmediatamente antes y después de la exposición, así como 3 d, 2 y 4 semanas después, no encontrando incremento significativo en el número de linfocitos con aberraciones cromosómicas ni en las cromátidas como consecuencia de la exposición al O3.En cuanto a los efectos del O3 sobre el ADN, Rasmussen26 expuso células de hamster chino V79 al O3 (2 a 20 mg.m-3) durante 1 h y observó que la replicación del ADN, evaluada por la incorporación de timidina tritiada, se redujo en dependencia de la concentración del gas utilizada. Las concentraciones superiores a 4 mg.m-3 fueron citotóxicas. El autor concluyó a partir de sus resultados que el O3 interactúa con el ADN provocando la inhibición de la replicación.
Borek y otros27 expusieron una línea de células epidérmicas humanas RHEK a la concentración de O3 de 10 mg.m-3 durante 10 min. Se evaluó la rotura de la cadena de ADN por la técnica de elusión alcalina y centrifugación en gradiente de sacarosa alcalina. En este estudio no se pudo detectar un aumento significativo en la rotura de la cadena de ADN inducida por el O3.
Kozumbo y Agarwal28 realizaron experimentos con un tampón ozonizado. Ellos utilizaron fibroblastos de pulmón humano CCD-18 y células A549 epiteliales tipo II transformadas, también de pulmón. El tampón que había sido pretratado con una concentración de O3 de 2 mg.m-3, no indujo rotura en la cadena de ADN de estos tipos celulares.
Muy recientemente Díaz-Llera y otros29 estudiaron mediante el ensayo Cometa el efecto genotóxico del O3 y del H2O2 en leucocitos de sangre periférica extraída de 6 voluntarios saludables, no fumadores y con edad comprendida entre 22 y 48 años. Las concentraciones de O3 utilizadas estuvieron en un rango entre 0,875 y 5,25 mM con un período de incubación de las muestras de 1 h a 37 °C. Controles positivos expuestos al H2O2 (4-40 mM) fueron también incluidos en el estudio. Los autores observaron incrementos en los porcentajes de células dañadas tanto por el O3 como por el H2O2, los cuales fueron dependientes de la concentración de ambos agentes, así como en las mediciones de la migración del ADN (longitud del cometa). La preincubación de las células con catalasa durante 15 min disminuyó significativamente los porcentajes de células dañadas y la longitud del cometa, esto sugiere que el H2O2 es el principal mediador de esos efectos y que la catalasa ejerce un efecto protector eficiente.
Los autores demostraron que el O3 induce daño en el ADN en leucocitos humanos de sangre periférica in vitro y que el daño fundamental es por rotura de la cadena del ADN mediada por la formación de H2O2, pero es reversible debido al importante papel que desempeñan los mecanismos de reparación.
En resumen, los estudios citogenéticos realizados in vivo en animales de laboratorio a los que se les administró el O3 por las vías inhalatoria, intramuscular, intraperitoneal, intratesticular e intrarrectal, en su mayoría han mostrado resultados negativos. Aberraciones cromosómicas y en las cromátidas de los linfocitos de sangre periférica se han detectado en los hamsters chinos expuestos al O3, pero no se han observado en los ratones y las ratas. Tampoco se han reportado efectos citogenéticos del O3 en las células de la médula ósea ni en espermatozoides de los animales tratados.
Se ha demostrado que el O3 es genotóxico in vitro. Mutaciones y rotura en la cadena del ADN ocurren en bacterias, principalmente en experimentos en los cuales el O3 fue burbujeado a través de suspensiones de microorganismos en cultivo, en cuyo caso también se forman radicales OH· y H2O2 En los cultivos de células animales y humanas tratadas con O3 se han detectado aberraciones en las cromátidas, e intercambio de cromátidas hermanas. Este último efecto puede producirse a concentraciones que oscilan entre 0,3 y 2 mg.m-3.
Se han aportado evidencias sólidas de que el daño inducido por el O3 en el ADN (rotura de la cadena) en leucocitos humanos de sangre periférica es un efecto reversible, esto indica que las células se recuperan rápidamente del efecto genotóxico inducido por el tratamiento con el gas.
Key words: Ozone, genotoxicity, clastogenic activity, chromosomal aberrations.
Recibido: 23 de febrero de 2004. Aprobado: 22 de abril de 2004.
Dr. Ricardo González. Centro de Investigaciones del Ozono. Departamento de Biomedicina, Centro Nacional de Investigaciones Científicas, Apartado 6412, Ciudad de La Habana, Cuba.