Estos criterios, aunque han sido modificados (AC-II)19 para introducir otras características del síndrome como son los cánceres extracolónicos, resultan aún muy restrictivos e insuficientes para considerar algunas características patológicas de HNPCC, como la distribución proximal de algunos hallazgos histológicos, así como para el caso de familias pequeñas.
En consecuencia, se han propuesto otras variantes y hoy la más conocida es la de los criterios de Bethesda (BC)20 que comprenden y amplían los AC, reduciendo los requerimientos para las familias de 2 generaciones.
Los criterios de Bethesda15 dan más peso a los adenomas colorrectales (menos de 40 años) o cáncer (menos de 45 años) de inicio temprano, reconocen los tumores asociados a HNPCC fuera del colon-recto que puedan ser indicadores de HNPCC y resaltan las características histopatológicas de los tumores que tienen defectos en la reparación de apareamientos incorrectos de nucleótidos en el ADN.
Estas recomendaciones permiten que un individuo sea considerado para el diagnóstico molecular en presencia de 1 o más de las características clínicas o histopatológicas siguientes:
- Individuos con cáncer en familias que cumplen los criterios de Ámsterdam.
- Individuos con 2 cánceres asociados a HNPCC, incluidos CCR sincrónicos y metacrónicos o cánceres extracolónicos asociados.
- Individuos con CCR y un familiar de primer grado con CCR y/o cáncer extracolónico asociado a HNPCC y/o un adenoma colorrectal, uno de los cánceres diagnosticado antes de los 45 años y el adenoma diagnosticado antes de los 40 años.
- Individuos con CCR o cáncer de endometrio diagnosticado antes de los 45 años.
- Individuos con CCR localizado en el lado derecho, con patrón no diferenciado, diagnosticado antes de los 45 años.
- Individuos con CCR del tipo célula en estampilla de sello de anillo, diagnosticado antes de los 45 años.
- Individuos con adenomas colorrectales diagnosticados antes de los 40 años.
La longitud de los microsatélites puede cambiar. La inestabilidad en microsatélites (MSI)
Los microsatélites son segmentos de ADN en los cuales un pequeño motivo (usualmente de 1 a 5 nucleótidos de longitud) se repite varias veces a lo largo del genoma. El microsatélite más común en los humanos es una repetición del dinucleótido adenina-citosina, (CA)n, que está distribuido en varios miles de sitios en el genoma de la línea germinal.21
Cuando el número de repeticiones de un microsatélite determinado muestra diferencias estables y heredables dentro de la población, se dice que este microsatélite es polimórfico. Por ejemplo, un microsatélite CA puede tener 4 alelos: (CA)11, (CA)14, (CA)15 o (CA)20, de acuerdo con el número de repeticiones del dinucleótido. Los microsatélites polimórficos de este tipo son excelentes marcadores genéticos y constituyen valiosas herramientas para los estudios de genes relacionados con diversas patologías mediante el análisis de ligamiento, en la medicina forense y en el estudio de deleciones genéticas (pérdida de heterocigosis) en tumores.
La inestabilidad genómica y los microsatélites
La pérdida de la estabilidad genómica parece ser un paso clave que ocurre en las primeras etapas del proceso de tumorigénesis. Este fenómeno contribuye a crear un ambiente permisivo para la ocurrencia de alteraciones en genes claves en el control de la proliferación celular, como oncogenes y genes supresores de tumores.22
En el CCR se han identificado hasta el momento 3 tipos de inestabilidad genómica:4,23
- Traslocaciones cromosómicas.
- Inestabilidad cromosómica (CIN). Ejemplo: aneusomía, pérdida o ganancia de regiones del cromosoma.
- Inestabilidad en microsatélites. ]]>
La inestabilidad en microsatélites (MSI) es una situación en la cual la longitud de un microsatélite ha aumentado o disminuido en la línea germinal. Esta variación implica un cambio somático en la talla del microsatélite. Los microsatélites son particularmente susceptibles a errores en la replicación, debido a que su estructura repetitiva propicia que la ADN polimerasa “se equivoque” al copiar la hebra molde del ADN.24
La MSI se descubrió fortuitamente una década atrás
Después que se había asociado la susceptibilidad a HNPCC a un locus del cromosoma 2 mediante análisis de ligamiento, los investigadores esperaban encontrar un gen supresor de tumores y buscaron pérdida de heterocigosis entre las repeticiones de dinucleótidos en la región genética del locus. En su lugar se encontró la existencia de alelos microsatélites cuya longitud había variado en todos los cánceres estudiados, como resultado de la inserción o pérdida de nucleótidos. Estas modificaciones se encontraron distribuidas prácticamente por todo el genoma del tumor.21
El hecho de detectar MSI en un tumor no puede considerarse un diagnóstico de mutación; sin embargo es de gran utilidad, porque la MSI constituye un reflejo de las deficiencias en los mecanismos de replicación o en la reparación del ADN.25 Pronto se evidenció que la MSI en el HNPCC estaba asociada a un funcionamiento deficiente de la maquinaria enzimática de reparación de apareamientos incorrectos de nucleótidos (MMR). Estos apareamientos incorrectos ocurren normalmente durante la replicación del ADN, pero la mayoría son rectificados rápido por el mecanismo de corrección de prueba de la ADN polimerasa o por la maquinaria de reparación de la célula.26
La reparación de los apareamientos incorrectos es una función celular altamente conservada, llevada a cabo por productos génicos que reconocen el par de bases erróneamente apareado, lo separan y lo reemplazan por el par correcto; garantizando de este modo la fidelidad del proceso de transmisión de la información genética durante la replicación. Se conocen al menos 6 genes involucrados en este mecanismo en los humanos: hMLH1, hMSH2, hMSH6, hMLH3, PMS1 y PMS2.27 En estos genes se han encontrado numerosas mutaciones en pacientes con historia familiar de cáncer colorrectal cuyos tumores presentan inestabilidad en microsatélites, sobre todo en pacientes HNPCC.
La mayoría de las mutaciones en los genes MMR reportadas actualmente son corrimientos del marco de lectura (frameshift mutations), mutaciones sin sentido (nonsense), mutaciones que introducen cambio del sentido (missense)28 o defectos en los sitios de splicing, y son causadas por sustituciones de una base o pequeñas deleciones e inserciones, o ambas, generalmente de 1-5 pares de bases.29 Adicionalmente se ha reportado la detección menos frecuente de grandes deleciones, inserciones e inversiones en los genes de reparación de algunas familias HNPCC.30
La mayor parte de estas mutaciones ocurren en los genes hMLH1 (50 %) y hMSH2 (40 %),31 cuyos productos proteicos son centrales en la función reparadora. Existe alguna evidencia de que las mutaciones en hMLH1 y hMSH2 no son todas equivalentes fenotípicamente. Jager y otros en Watson y Lynch (2001) encontraron que una mutación común (en el intrón 4 de MLH1) estaba asociada con un fenotipo menos agresivo y con un menor número de manifestaciones extracolónicas.32 Los tumores de los individuos que presentan mutaciones en hMLH1 y hMSH2 tienen un grado elevado de MSI (MSI-H) y a menudo dan lugar a familias HNPCC clásicas que cumplen con los AC.33 En los cánceres esporádicos es frecuente la inactivación de hMLH1 como parte de una hipermetilación de la región promotora del gen.34
El número de mutaciones reportadas en el gen hMSH6 se ha venido incrementando en los últimos años. Las mutaciones en MSH6 generalmente ocurren en familias HNPCC atípicas, es decir con inicio tardío, alta frecuencia de cáncer de endometrio y bajo nivel de MSI.35
La reparación de apareamientos erróneos es una función celular coordinada y específica
Varios estudios realizados han revelado que los componentes de la maquinaria de reparación actúan de forma concertada, formando complejos heteroméricos que actúan específicamente según el tipo de lesión que necesite ser reparada (fig. 1).
Por ejemplo, MSH2 forma el complejo hMutSα con MSH6 para el reconocimiento de los apareamientos erróneos en pares de bases.32 Si la lesión es un lazo por inserción/deleción de nucleótidos (IDL), MSH2 se asocia con MSH3 y forman el complejo hMutSβ para reconocer el daño.36 Consecuentemente, los cánceres que surgen producto de una pérdida en la función de MSH6 muestran MSI solo en repeticiones de nucleótidos.37
En el caso de hMLH1 se asocia con PMS2 y forma el complejo hMutLα que coordina la interacción entre el complejo de reconocimiento de la lesión y otras proteínas que participan en el proceso de reparación como PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular), ADN polimerasas δ y ε, las proteínas SSB (proteínas de estabilización de simple cadena en la replicación) algunas exonucleasas y helicasas.38
De acuerdo con hallazgos recientes, hMLH1 también puede formar heterodímeros con hMLH3 y PMS1.39 El complejo hMLH1-hMLH3 tiene una función similar a hMutLα en la reparación de los lazos formados por inserción/deleción, mientras que la función de hMLH1-PMS1 (complejo hMutLβ) no está claramente determinada hasta el momento.40
Recién se demostró que la incorporación de purinas oxidadas, provenientes de la reserva celular de dNTPs (desoxinucleótidos trifosfato), puede contribuir significativamente al incremento de la inestabilidad genética en los tumores. La oxidación es una lesión que sufre por lo general el ADN y las purinas son en particular susceptibles a esta. Los desoxinucleótidos oxidados son una fuente importante de apareamientos erróneos, que deben ser detectados y corregidos por las proteínas de la maquinaria de reparación. En los tumores HNPCC estas proteínas, al estar dañadas, no pueden efectuar correctamente esa función, contribuyendo al incremento de la inestabilidad genética en el genoma del tumor.41
En estudios realizados in vitro se ha demostrado que basta con la presencia de un solo alelo salvaje para que el mecanismo reparador actúe correctamente. Por tanto, parece ser que el estado heterocigótico no provoca una pérdida total de la función reparadora.42
En la mayoría de los casos, la tumorigénesis asociada a defectos en los genes de reparación conduce a la inactivación de ambos alelos del gen en cuestión. En el caso de HNPCC, la presencia de mutaciones en la línea germinal acelera este proceso.43
En general, la actividad defectuosa de los genes de reparación de apareamientos incorrectos de nucleótidos facilita presumiblemente una transformación maligna del tumor, porque permite la rápida acumulación de mutaciones que inactivan genes claves para la célula.
Parece ser que estos genes de reparación defectuosos, al no poder producir proteínas que corrijan los errores de apareamiento de nucleótidos durante la replicación del ADN, promueven mutaciones en otros genes y, a su vez un aumento en la velocidad mutacional en el genoma del tumor. Se ha encontrado que, en líneas celulares de CCR, la velocidad de mutación está incrementada hasta 103 veces en la secuencia de los genes expresados.44
Los genes que contienen microsatélites dentro de su propia secuencia son especialmente susceptibles a este fenómeno.45 Por ejemplo, el gen TGF-βRII, que codifica para el receptor II del TGF (siglas en inglés de factor de crecimiento transformante), contiene una repetición de 10 adeninas (A)10 que sufre un cambio en el marco de lectura en alrededor de 90 % de todos los tumores HNPCC. Esta mutación conlleva a la pérdida de la función del TGF, un supresor de tumores de gran importancia en el CCR.46
Marcadores de MSI en tumores
]]> El grupo de marcadores y alelos de microsatélites que se ha utilizado para identificar la MSI en tumores es muy variado.La MSI en un tumor generalmente se determina comparando la talla de las secuencias de los marcadores microsatélites en diferentes loci y en general se requiere un control de tejido normal además del tumor.
En ocasiones resulta impreciso establecer la condición MSI empleando este sistema, sobre todo porque no existe un criterio único en cuanto al número de loci que debe ser analizado para diagnosticar la MSI y la proporción de marcadores inestables que debe considerarse para clasificar la MSI.
En 1997 se sugirió el empleo de un panel de referencia de 5 marcadores de MSI para dicho propósito: BAT-25, BAT-26, D2S123, D5S346, y D17S250.47
De acuerdo con los criterios internacionales se considera alta frecuencia de MSI (MSI-H) si 40 % de marcadores de los recomendados o más, presentan alteraciones en su secuencia. Además se pueden considerar MSS (MSI estables) cuando ningún marcador presenta variaciones en la longitud de su secuencia y MSI-L (baja frecuencia de MSI) cuando un solo marcador se muestra inestable. Según algunos autores47 desde el punto de vista cualitativo, no parecen haber diferencias ni patológicas ni clínicas en los tumores colorrectales con MSI-L y MSS. Solo se puede establecer esta diferencia cuantitativamente, para lo cual hay que utilizar una gran cantidad de marcadores.47 Los tumores MSI-H constituyen 15 % de los CCR y se localizan predominantemente en el colon proximal, presentan características histopatológicas únicas y están asociados con un desarrollo clínico menos agresivo.48 En HNPCC 95 % de los tumores presentan MSI y su distribución es contraria a la de los casos esporádicos.23
Los marcadores BAT-25 y BAT-26, que están ambos contenidos en el panel recomendado, presentan un solo alelo en la línea germinal y en las células somáticas normales de la mayoría de los individuos.49 El BAT-26 consiste en una secuencia de 26 adenosinas (A)26, localizada en el intrón 5 del gen hMSH2. Algunos individuos pueden presentar 24, 25 o 27 adenosinas en lugar de 26, aunque estos individuos representan menos de 5 % de la población, por lo que se considera como un marcador monomórfico50 con un PIC de 1,00.51 La secuencia polimórfica de nucleótidos del marcador BAT-25 consiste principalmente de (T)7A(T)25 localizada en el oncogén c-kit. Este alelo es el más común, aunque se han reportado otros cuyas variaciones consisten en la pérdida o adición de 1 o 2 nucleótidos.52
Tanto BAT-25 como BAT-26 han demostrado ser altamente sensibles a la MSI. Debido a la condición casi monomórfica de ambos loci es posible diferenciar los alelos inestables de los alelos de talla normal sin necesidad de trabajar con mucosa normal. En diversos estudios realizados con tumores colorrectales y líneas celulares,49,53-55 se ha podido comprobar la MSI en casi la totalidad de las muestras estudiadas empleando solamente BAT-26.
Es importante tener en cuenta que el panel de 5 marcadores recomendado (BAT-25, BAT-26, D2S123, D5S346, y D17S250) para la evaluación de la MSI, puede subestimar el número de tumores MSI-H, debido al empleo de 3 marcadores dinucleótidos. Además el número de tumores MSI-L puede sobrestimarse, debido al empleo de 2 marcadores mononucleótidos. La adición de otros marcadores mononucleótidos al análisis mejora la sensibilidad del panel.56
Técnicas de detección de MSI
Existe una gran variedad de metodologías para la determinación de la MSI. La SSCP (polimorfismo de conformación de cadena simple) es una de las más empleadas debido a que es sencilla y versátil. La SSCP se basa en la relación entre la movilidad electroforética de un segmento de ADN monocatenario y su conformación plegada, la cual a su vez depende estrechamente de la secuencia de nucleótidos o de la talla del segmento.57,58 De esta forma la MSI es detectable fácil en un gel, pues aparecen diferentes bandas de acuerdo con las diferentes conformaciones del marcador inestable (fig. 2).
Es usual el empleo del marcaje con fluorescencia de los productos amplificados por RCP para el análisis mediante SSCP.51,53,59-60
La inmunohistoquímica (IHC) es otra de las técnicas empleadas en el diagnóstico de HNPCC.61-63 Esta técnica se basa en el empleo de anticuerpos específicos para las proteínas de los genes de reparación, mayormente anti-hMLH1 y anti-hMSH2, en tejido tumoral.
La IHC es especialmente útil para clasificar los pacientes con MSI-H en sus respectivos niveles de riesgo, así como para determinar aquellos casos en los cuales se deben analizar los genes de reparación.56 La IHC también permite detectar casos en los cuales los genes de reparación no se expresan, como sucede por ejemplo con hMLH1 debido a la hipermetilación de su región promotora. Sin embargo, la asociación de la IHC con la MSI no es exclusiva; por ejemplo, es posible encontrar un fenotipo MSI en un tumor aun cuando el resultado de la IHC es positivo para una de las proteínas de la vía de reparación.
Conclusiones
Como se ha visto la MSI es un fenómeno complejo, que surge en el genoma como consecuencia de una función celular deficiente: la reparación posreplicativa del ADN, producto de mutaciones en varios genes que participan en este proceso. Debido a la MSI se crea en la célula un estado favorable para la acumulación de mutaciones en genes vulnerables que controlan actividades biológicas críticas. Por lo general, estas alteraciones conllevan en última instancia a una desregulación genética que conduce inevitablemente al cáncer.
El análisis de la MSI puede ser una herramienta adicional para hacer más preciso el diagnóstico clínico de HNPCC, pues posibilita la identificación de aquellas familias potencialmente portadoras de defectos genéticos entre las familias que no poseen mutaciones conocidas en los genes de reparación. En general, la detección de MSI es un paso previo al genotipaje de los genes de MMR. Estas pruebas permiten al médico evaluar el pronóstico del paciente y quizás establecer una terapia; además, es una herramienta de diagnóstico efectiva en los casos de HNPCC.
Los criterios clínicos-histopatológicos establecidos para definir familias HNPCC constituyen una base importante para el diagnóstico, pues sería poco eficiente analizar todos los tumores para detectar MSI, teniendo en cuenta que solo 15 % de los CCR esporádicos presenta MSI, mientras que los tumores de pacientes HNPCC presentan MSI en más de 90 % de los casos.
Una estrategia eficaz para la evaluación molecular de los casos de riesgo, identificados por los criterios clínicos (AC o BC), sería el análisis de MSI o IHC de los tumores, seguido de la detección de mutaciones en los genes de reparación, con preferencia hMLH1 y hMSH2. Después de identificada la mutación es importante el asesoramiento genético de los familiares de riesgo, que pueden ser sometidos al diagnóstico, si están de acuerdo.
Microsatellite instability: some aspects of their relation to hereditary nonpoliposis colorectal cancer
Summary
A review on nonpolipoid hereditary colorectal cancer was made. It presents the highest incidence among the heridatary syndromes predisposing to colorectal cancer. It is characterized by its appearance at early ages, the presence of neoplastic lesions in the colon and other organs, and by microsatellite instability. The microsatelites are multiple repetitions from 1 to 5 nucleotides that are distributed all around the genoma. Due to their repetitive structure, the microsatellites are susceptible to errors during the replication process. The microsatellite instabilitiy results from a deficiency in the postreplicative repair mechanism of erroneous matchings. Various genes whose products are involved in this mechanism and that are mutated in the tumors of the hereditary nonpoliposis colorectal cancer are known. Some of the different techniques used to determine microsatellite instability in tumors of carrier patients are the single chain conformation polymorphism and immunohistochemical techniques.
Key words: Microsatellite instability, HNPCC, colorectal cancer, repair genes.
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Recibido: 16 de octubre de 2004. Aprobado: 4 de marzo de 2005.
Lic. Darwyn Toledo González. Instituto Nacional de Gastroenterología. Calle 25, No 503, Vedado, La Habana. Teléf: 832-5594-97