Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas “Victoria de Girón”
Dra. Tammy Fernández Romero, Dr. Antonio Mario González Griego, Dr. Félix Juan Fernández Acosta y Dra. Victoria Esther González Ramírez
Se propuso el empleo de la determinación de la actividad enzimática sin mediación de la interacción antígeno-anticuerpo, como procedimiento analítico inicial en la evaluación de conjugados inmunoenzimáticos. Los conjugados empleados en los métodos inmunoenzimáticos deben ser evaluados una vez obtenidos y cada cierto tiempo. Como en estos procedimientos la señal que se obtiene depende del producto enzimático formado, sería ventajoso iniciar la evaluación determinando la actividad de la enzima independientemente de la del producto como conjugado. Se sugirió un método basado en la adición del conjugado de manera directa al soporte empleado para el inmunoensayo enzimático y seguidamente el sustrato de la enzima. Se incluyó la forma de interpretar los resultados y se concluyó que este es un proceder sencillo, que pudiera tener un papel rector en la evaluación de estos reactivos.
Palabras clave: ELISA, conjugados, evaluación de conjugados, actividad enzimática.
Como métodos diagnósticos, los inmunoensayos enzimáticos (IE) han demostrado superioridad sobre otros métodos convencionales de inmunoensayo. Esto se debe a las ventajas que ofrecen como la relativa sencillez, la rapidez de ejecución, el bajo costo de equipamiento y la posibilidad de automatización y procesamiento de gran número de muestras a la vez. En estos se emplean pequeñas cantidades de muestras y reactivos y son de elevada precisión, sensibilidad, especificidad y detectabilidad.1-4
Uno de los procedimientos de IE es la técnica ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Como todas las de su tipo recurre al empleo de anticuerpos (Ac), antígenos (Ag) o haptenos marcados (conjugados) con una enzima, para revelar el reactivo complementario al nivel de distintos fluidos biológicos.1,4
La existencia de una reacción inmunológica en los ELISA se demuestra por la generación de un producto enzimático coloreado cuya concentración puede ser cuantificada por espectrofotometría, en el caso de las técnicas cuantitativas. Existen además técnicas cualitativas, en las que el producto se analiza visualmente y técnicas semicuantitativas donde se utiliza un estándar o calibrador para comparar.1-8
En el funcionamiento de los ELISA la calidad de los reactivos biológicos es muy importante. Entre estos reactivos el conjugado es un elemento determinante en la adecuada operatividad del sistema. Es el conjugado el que determinará en buena medida la menor o mayor sensibilidad del método; la interacción de la enzima acoplada a un Ag o Ac con su sustrato específico es quien permite reconocer la reacción Ag-Ac amplificada por el sistema.8,9
]]> Es necesario tener en cuenta el proceder adecuado de conjugación de una enzima para obtener un producto de alta calidad. El método ideal debe rendir 100 % de conjugado de composición bien definida, producir una unión estable, sin inactivación de sus componentes y ser práctico.1,8Una vez obtenido un conjugado se hace necesaria una evaluación adecuada. Es un paso obligado valorar su funcionamiento en el sistema para el cual fue concebido.1,2,10 Sin embargo, la no determinación de la actividad de la enzima de forma independiente a la actividad inmunológica limita la caracterización adecuada del reactivo.
En estos procedimientos la señal que se obtiene depende del producto enzimático formado, por lo que sería conveniente determinar al inicio el funcionamiento de la enzima independientemente de la del producto como conjugado. Esta podría ser una forma de proceder para ubicar las deficiencias que se pueden presentar en el funcionamiento del conjugado en el sistema.
Este trabajo tiene como objetivo proponer el empleo de la determinación de la actividad enzimática sin mediación de interacción antígeno-anticuerpo (AE), como procedimiento analítico inicial en la evaluación de conjugados inmunoenzimáticos.
Se utilizó el mismo soporte sólido que se emplea para el ELISA. El más popular de todos es la placa de plástico de 96 pocillos, por lo que será el empleado en el procedimiento general que se describe a continuación para un método cuantitativo espectrofotométrico. Para otros métodos se pueden realizar adaptaciones.
El procedimiento general consiste en añadir el conjugado directamente a la placa, en diluciones dobles seriadas, y un blanco de reactivos. Seguidamente adicionar la solución sustrato de la enzima (la misma empleada en el ELISA correspondiente). Después se continúa de igual forma que se procede a partir de este paso en el ELISA correspondiente. Se debe realizar repetibilidad y reproducibilidad para evaluar la precisión.
Los criterios para trabajar con 99,9 % de confianza serían 3 desviaciones estándar y un coeficiente de variación de hasta 10 %. El resultado correspondería con la actividad mostrada en la máxima dilución del conjugado (Dil) donde la media de las densidades ópticas se encuentra por encima del valor límite (DOF). El valor límite sería calculado como la media del blanco de reactivos más 3 desviaciones estándar.
La AE se pudiera expresar como un valor numérico según la fórmula:
AE= (DOF /DE) x Dil
Donde: ]]> DE: desviación estándar del blanco de reactivos.
Si el procedimiento de conjugación no es el adecuado, a pesar de que se utilice el método apropiado, la actividad de la enzima puede afectarse hasta el punto de resultar inservible. La pérdida de la actividad también puede ocurrir con el tiempo, luego de preparado el conjugado.1,8,9 Es por esto que pudiera ser útil la medición inicial de la AE y el empleo de los resultados como referencia para estudios de estabilidad y para evaluar conjugados similares que se preparen con posterioridad.10,11
Esta forma de proceder permitiría establecer un rango de valores de referencia para el trabajo y la metodología propuesta podría convertirse también en una forma de ahorro de recursos y de tiempo. En este sentido si desde un inicio se detectara que la enzima no funciona adecuadamente, no sería necesario proseguir la evaluación del conjugado en el ELISA correspondiente.
Se concluye que la AE es un procedimiento sencillo que pudiera tener un papel rector en la evaluación de conjugados inmunoenzimáticos.
The use of the determination of the enzymatic activity without the mediation of the antigen-antibody interaction was proposed as an initial analytical procedure in the evaluation of immunoenzymatic conjugates. The conjugates used in the immunoenzymatic methods should be evaluated once they are obtained and at certain time intervals. As in these procedures the signal obtained depends on the enzymatic product formed, it would be convenient to start the evaluation by determining the activity of the enzyme independently of the product as a conjugate. It was suggested a method based on the direct addition of the conjugate to the support used for the enzymatic immunoassay, and immediately after the enzyme substrate. The way of interpreting the results was included, and it was concluded that it is a simple procedure that may play a ruling role in the evaluation of these reagents.
Key words: ELISA, evaluation of conjugates, enzymatic activity
1. Ochoa F. Bases metodológicas para la evaluación de anticuerpos en ensayos clínicos de vacunas mediante técnicas inmunoenzimáticas. La Habana:Finlay Ediciones; 2004.
2. Roitt I, Brostoff J, Male D. Inmunología. 5a ed. Madrid: Harcourt; 2001.
3. Harbeck RJ, Giclas PC. Diagnostic Immunology Laboratory Manual. New York: Raven Press; 1991.
4. Reina M. ELISA. [en línea] 2003 [fecha de acceso Enero de 2005]. URL disponible en: http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/elisa.htm
5. Segovia CN, Uzal FA, Robles CA. Evaluación de un enzimo-inmunoensayo indirecto para la detección de anticuerpos contra Brucilla militensis en suero de caprinos. Terrizo EEA Bariloche 2000;29(154):177-82.
6. Del Pilar M. El diagnóstico viral por el laboratorio. Colombia Médica 2000;31:135-50.
7. Tijssen P. Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, practice and theory of enzyme immunoassays Vol 15. London:Elsevier Science Publishers; 1985.
8. Diamandis EP, Christopoulos T. Immunoassay. New York: Academic Press; 1996.
9. Rose NR, Hamilton RG, Detrick B. Manual of Clinical Laboratory Immunology. 6th ed. Washington:ASM Press; 2002.
10. Merlín JC, Villaescusa R, Gerreiro AM, González JM, González R, Arce AA. Preparación de un conjugado anti IgG de ratón-peroxidasa en cabra. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1999;15(2):132-6. 11. Merlín JC, Villaescusa R, Gerreiro AM, González JM, Arce AA. Preparación de un conjugado peroxidasa- anti IgG humana (cadena) en conejo. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2001;17(2):132-7.
Recibido: 5 de mayo de 2006. Aprobado: 26 de junio de 2006.
Dra. Tammy Fernández Romero. Avenida. 25 No. 15016 entre 150 y 152. Cubanacán. Municipio Playa. Ciudad de La Habana. Teléf: 208-25-73. Correo electrónico: tammy@giron.sld.cu ]]>