Facultad de Medicina “Calixto García”
Dra. Ela M. Céspedes y Dr. Alberto Reyes
Se realizó un estudio sobre los marcadores de daño oxidativo y de defensa antioxidante en órganos de ratas jóvenes, adultas y senescentes; mediante los cuales se evidenció un incremento con el tiempo de la peroxidación lipídica en hígado, corazón, riñón y páncreas; así como una disminución en la actividad de la enzima antioxidante catalasa en todos los órganos, excepto el páncreas. Los cambios que se producen en el envejecimiento se han asociado a un desequilibrio en los mecanismos oxidantes y antioxidantes en las células. Los resultados demostraron un estado de estrés oxidativo que pudiera favorecer la aparición de enfermedades asociadas al envejecimiento.
Palabras clave: Envejecimiento, peroxidación lipídica, enzimas antioxidantes, estrés oxidativo.
Es un reto para las ciencias encontrar una explicación al envejecimiento. Se admite que para cada especie la duración máxima de la vida está determinada genéticamente. Tan importante como los genes, los cambios estocásticos o epigenéticos determinados por la actividad metabólica exponen a las células al daño de sus biomoléculas y en consecuencia al deterioro de su función. De los telómeros a las células madre, los genes y el metabolismo oxidativo, se abre una era excitante en el campo multidisciplinario que estudia el envejecimiento.1
El envejecimiento está asociado con alteraciones en el grado de estrés oxidativo que está influenciado por la genética molecular.2,3 La hipótesis de los radicales libres se basa en la posibilidad de formación de moléculas altamente reactivas que reaccionan con estructuras biológicas, lo que causa daño oxidativo irreparable e irreversible que se acumula con el tiempo y resulta en una pérdida gradual de la capacidad funcional. Todos los órganos envejecen. Profundizar en los mecanismos moleculares oxidativos que condicionan el envejecimiento celular en varios órganos que pueden verse afectados durante la senescencia mediante el estudio de marcadores de daño oxidativo y de defensa antioxidante en ratas es el propósito de este trabajo.
Sujetos experimentales: Ratas Sprague Dawley machos, mantenidas en condiciones estándar de laboratorio, ciclo luz:oscuridad 12:12, agua y comida ad libitum.
]]> Grupos experimentales: Grupo I: 10 ratas jóvenes (5 meses); Grupo II: 10 ratas adultas (18 meses); Grupo III: 10 ratas senescentes (24 meses)Obtención del tejido: Las ratas fueron sacrificadas por dislocación cervical, según las normas éticas para la experimentación animal. La disección se realizó en el orden: páncreas, hígado, riñón y corazón, manteniéndolos en hielo. Los órganos fueron lavados con NaCl 0,9 %, secados sobre papel secante y pesados. Se homogeneizó el tejido a 8 000 rpm en buffer fosfato. El homogenato fue centrifugado a 4 000 rpm durante 30 min a 4 °C. El sobrenadante fue conservado con hidroxitolueno butilado a - 70 °C hasta su procesamiento. La concentración de proteínas se determinó por el método de Lowry. La cuantificación de productos reactivos al ácido tiobarbitúrico (TBARs) como indicador de la peroxidación lipídica, actividad fosfolipasa A2 (FLA2), así como la actividad de las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa cobre-zinc (SOD) y catalasa (CAT), en hígado, corazón, riñón y páncreas, se realizó según los procedimientos normativos del Centro de Investigaciones Biomédicas.
Se utilizó la estadística descriptiva y análisis de varianza para la discusión de los resultados.
La concentración de TBARs, marcador de la peroxidación lipídica, resultó ser superior en todos los órganos de las ratas senescentes en relación con las ratas jóvenes, así como en hígado y corazón de las ratas adultas en relación con las jóvenes (p< 0,05) (fig.1). En el caso de riñón y páncreas no se alcanzó la significación estadística. Tampoco resultó de significación la diferencia que se observa entre las ratas adultas y senescentes en los órganos estudiados.
Fig. 1. TBARs en hígado, corazón, riñón y páncreas de ratas jóvenes, adultas y senescentes.
La fosfolipasa A2 es importante en el recambio de membranas y en la reparación del daño oxidativo. La actividad de esta enzima se incrementó con la edad en hígado y corazón, en correspondencia con el incremento en la peroxidación lipídica; y resultó superior en ratas senescentes (p< 0,05) (fig. 2).
Fig. 2. Actividad fosfolipasa A2 en los órganos estudiados.
La actividad de las enzimas superóxido dismutasa (fig. 3) y catalasa (fig. 4) fue estudiada como respuesta de los mecanismos de defensa antioxidante en los grupos mencionados.
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Fig. 3. Actividad superóxido dismutasa en los órganos estudiados.
Fig. 4. Actividad catalasa en los órganos estudiados.
Aunque no se verificaron diferencias estadísticamente significativas para la actividad de la SOD, la tendencia fue una disminución en hígado, riñón y páncreas de ratas viejas. La actividad CAT resultó menor en hígado, corazón y riñón de ratas de 24 meses en relación con ratas jóvenes y adultas (p< 0,01), mientras que en el páncreas no se encontraron diferencias con la edad.
Es razonable suponer que existen múltiples mecanismos de envejecimiento en los diferentes niveles: molecular, celular, de órgano y de organismo. Este hecho, además de las dificultades de la observación experimental por la influencia de factores ambientales, efectos secundarios que complican el esclarecimiento de un mecanismo primario y la carencia de marcadores biológicos, contribuyen a la formulación de las diversas teorías. Las investigaciones en general sugieren que el proceso primario está bajo el control génico con la contribución importante del ambiente.
En el siglo pasado, Rebeca Gershmann propuso que el envejecimiento estaba asociado a alteraciones moleculares en las que intervienen los radicales libres. En 1956 se publicó la teoría de los Radicales Libres en el Envejecimiento, por Harman, basada en la acción deletérea de estas especies; teoría refinada por Miquel quien fundamentó el papel de la mitocondria en la producción de radicales libres y como diana de la acción de estos. La teoría del estrés oxidativo es una de las hipótesis que intenta explicar los cambios que ocurren al nivel celular durante la senescencia. Considera al envejecimiento como la etapa final del desarrollo que ocurre por la influencia del estrés oxidativo en la expresión génica.4
Los productos reactivos al ácido tiobarbitúrico son indicadores de la peroxidación lipídica por causa de la acción de los radicales de oxígeno sobre los ácidos grasos poliinsaturados. Estos productos favorecen la actividad de las fosfolipasas.5,6 El incremento en la concentración de TBARs, que se observó en particular en el hígado, se corresponde con los resultados de Park y otros que observaron en este tejido un incremento acelerado de la peroxidación lipídica con la edad, incremento que ya se observa desde la adultez.7 El grupo de Jayakumar encontró niveles elevados de malonildialdehído, un producto de la peroxidación lipídica, en hígado, riñón, corazón y cerebro de ratas envejecidas.8 Sivonova y otros encontraron aumento de la peroxidación lipídica en corazón de ratas de 26 meses.9
El tiempo de vida de estas especies es de 20-24 meses, pero ya desde los 18 meses puede observarse una rápida mortalidad, por lo cual es de esperar que las alteraciones relacionadas con el envejecimiento aparezcan desde esta edad.10
En algunas investigaciones se ha demostrado que el grado de insaturación de los ácidos grasos se correlaciona negativamente con la longevidad máxima. La insaturación de ácidos grasos, y por tanto la peroxidación lipídica, es más baja en pájaros y en los mamíferos, en correspondencia con su mayor longevidad. Estos hallazgos se corresponden además con una menor modificación de proteínas y del daño al ADN mitocondrial por los productos de la peroxidación lipídica.11
]]> La fosfolipasa A2 es activada por los productos de la peroxidación lipídica. Los ácidos grasos libres, entre los que se incluye el ácido araquidónico, y lisofosfoglicéridos, que son productos de la reacción de la FLA2, pueden actuar como moléculas señal o ser transformados en compuestos biológicamente activos. La hidrólisis de la cardiolipina por la fosfolipasa A2 disrumpe la cadena respiratoria mitocondrial e incrementa la producción de especies reactivas del oxígeno. Los productos finales de la peroxidación lipídica se pueden unir a proteínas y ácidos nucleicos, alterar su función y dar origen al daño celular. El aumento en la actividad de esta enzima durante el envejecimiento se corresponde con el incremento en la peroxidación lipídica observada en este estudio.Resulta controvertido el papel de los antioxidantes enzimáticos en el envejecimiento de las especies. Por una parte se refiere que la senescencia normal se acompaña de un declinar de las defensas antioxidantes, como el glutatión reducido en sangre y en órganos de animales y humanos.12 De hecho, la suplementación de la dieta con estos antioxidantes ha demostrado efectos beneficiosos.13 Igualmente se ha atribuido la diferencia en la vida media al comportamiento de estos sistemas antioxidantes en las especies. Sin embargo; los mecanismos antioxidantes son un sistema armónico y las interacciones entre ellos resultan complejas. Es consecuente pensar que la determinación de las actividades individuales aproxima a una respuesta de lo que acontece, pero resultaría de más relevancia el análisis de todo un sistema.14 Asimismo, muchas de estas enzimas se inducen en respuesta al estrés, de manera que un mayor nivel podría indicar mejor protección o, alternativamente, una mayor necesidad de defensas antioxidantes por causa de un aumento en la generación de oxidantes. También se maneja en los últimos años que los antioxidantes no parecen controlar la cinética del envejecimiento.15
El incremento en la actividad superóxido dismutasa es exponente de una elevada generación de anión superóxido en la célula, que es eliminado por esta enzima. En los órganos estudiados no se detecta diferencia estadísticamente significativa. Algunos autores no encuentran variación en su actividad.16
La actividad CAT disminuyó con la edad en los estudios de Mo,17 resultado similar fue encontrado por Tian y otros en hígado y riñón; en correspondencia con lo observado en el presente estudio.18 Sohal encontró aumento en la actividad de la enzima a los 12 y 15 meses, con una disminución a los 24 meses.19
Se plantea que con la edad aumentan la actividad y expresión de la SOD y disminuyen la de las enzimas glutatión peroxidasa (GPx) y CAT. El aumento del índice SOD/(CAT+GPx) conduce a un desbalance en la regulación de las especies reactivas del oxígeno y en consecuencia, un aumento del estrés oxidativo.19 Sin embargo, en estudios experimentales en los cuales se incrementa el nivel de antioxidantes en cerebro y otros tejidos, en particular en mamíferos, mediante la suplementación dietética o los procedimientos transgénicos, la longevidad máxima no se modifica; solo en el caso de animales de corta vida es que se produce este incremento.20,21 En modelos de moscas Drosophila melanogaster, doblemente transgénicas, que sobreexpresaron SOD y CAT, Orr y Sohal observaron un incremento en la longevidad media y máxima; resultado que no se logra con la sobreexpresión de estas enzimas por separado.20 En animales knockout para estas enzimas tampoco se produce modificación en la longevidad máxima.15
Cutler propuso que la duración de la vida se debía correlacionar con la capacidad de protección antioxidante.22 Los antioxidantes endógenos se correlacionan de modo negativo con la longevidad máxima, aunque son relativamente pocos los resultados en la investigación en este perfil, pues, no se ha demostrado un incremento en la edad máxima que un individuo puede alcanzar. Sin embargo, los animales de más larga vida producen radicales libres en la mitocondria a más baja velocidad, proceso que es regulado en cada especie.15,23
Mediante el uso de la tecnología microarray se han identificado un conjunto de genes cuya actividad está asociada a la vida media de las especies y se ofrecen evidencias de que estos genes actúan de manera concertada en el control de la longevidad y el envejecimiento. Uno de estos genes es daf-16, que codifica para la proteína DAF-16. Esta proteína participa en los mecanismos reguladores de los genes que codifican para numerosos procesos bioquímicos y se asocian con un incremento en la vida media, entre estos los mecanismos de destoxificación o reparación del daño oxidativo.24
El envejecimiento está asociado con un declinar de la actividad metabólica del parénquima hepático. Los hepatocitos envejecidos acumulan daño oxidativo a las biomoléculas que resultan en mutaciones, principalmente, en el genoma mitocondrial.25 Los cambios estructurales y funcionales que se presentan en el riñón y el corazón envejecidos obedecen sobre todo a la presencia de eventos crónicos asociados al envejecimiento, como la hipertensión y la diabetes mellitus, eventos en los que el estrés oxidativo desempeña un papel importante.
Los resultados obtenidos ofrecen evidencias a favor del papel del estrés oxidativo en el envejecimiento, aunque en todos los órganos estudiados el comportamiento ha sido diferente el desbalance oxidativo puede favorecer la aparición de enfermedades asociadas a este proceso como las cardiovasculares, la diabetes mellitus, fallos renales agudos y los procesos degenerativos en general. Las recomendaciones nutricionales desde las etapas más tempranas de la vida constituyen un instrumento de prevención efectivo para minimizar la posibilidad de este desbalance y las consecuencias que se derivan.
A study of oxidative damage and anti-oxidizing defense markers in organs from young, adult and aged rats was conducted. It was evident that lipid peroxidation in liver, heart, kidneys and pancreas increases with the time as well as anti-oxidizing enzyme catalase reduces its action in all the organs except for pancreas. Changes at the time of aging have been associated with an imbalance in oxidizing and anti-oxidizing mechanisms within the cells. The results showed a state of oxidative stress that favors the occurrence of aging-related diseases.
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Recibido: 5 de enero de 2007. Aprobado: 12 de febrero de 2007.
Dra. Ela M. Céspedes. Facultad de Medicina “Calixto García”. Calle G e/ 25 y 27, Vedado, Cuidad de La Habana. Teléf.: 8320074. Correo electrónico: elices9848@yahoo.com