0864-03000864-0300S0864-03002007000200007000620070006200726200Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas “Victoria de Girón”
Efectos protectores del ácido fólico sobre los hepatocitos de conejos machos adolescentes alcohólicos
Dra. Aleida Herrera Batista, Dra. Liana Yanet Rojas Rodríguez, Dr. Jorge Bacallao Gallestey y Dra. IsisLebredo Álvarez
Resumen
Se evaluaron los efectos protectores del ácido fólico sobre los hepatocitos de conejos alcohólicos adolescentes, para lo cual se analizaron las variables morfométricas área núcleo, área citoplasma, y relación área núcleo/área citoplasma en los hepatocitos de las 3 zonas del lobulillo hepático. Se utilizaron 24 conejos divididos en 4 grupos: tratados con etanol, tratados con etanol y ácido fólico, tratados con ácido fólico y control no tratado. Para el estudio morfométrico se empleó el software ImageToolforWindowv 3.00 y se aplicó una ANOVA de 2 vías con interacción. Los animales tratados con etanol presentaron alteraciones en las variables morfométricas, en particular en las zonas intermedia y perivenosa. Los animales alcohólicos tratados con ácido fólico mostraron valores de las variables estudiadas, que aunque fueron superiores a los controles, estuvieron por debajo de los animales que solo ingirieron etanol. Se concluyó que el ácido fólico brindaba protección a los hepatocitos y, por otra parte, se comprobó heterogeneidad zonal en el lobulillo hepático en todos los grupos estudiados.
El alcoholismo es una enfermedad crónica incurable que eleva la morbilidad y mortalidad del individuo y afecta su comportamiento social. Esta toxicomanía constituye un grave problema médico y social, en particular en la adolescencia, porque en estas edades el organismo es mucho más sensible a las consecuencias del tóxico.1-3
El consumo excesivo de etanol entre los adolescentes es uno de los problemas de salud emergente. En la última década se ha reportado una prevalencia alarmante en el consumo de bebidas alcohólicas entre jóvenes estudiantes de secundaria y preuniversitario4,5 y se ha señalado que en países industrializados la edad promedio en el comienzo de este hábito es de 13 años.6
El etanol produce lesiones hepáticas, que van desde una esteatosis y una hepatitis, hasta una cirrosis con marcada fibrosis del órgano.7 En las últimas décadas se ha involucrado al estrés oxidativo en la génesis de estas alteraciones.8
El alcoholismo provoca un déficit nutricional donde están afectados un grupo de nutrientes, entre ellos las vitaminas y en particular el ácido fólico, el cual ha sido reportado como un poderoso antioxidante.9,10
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Teniendo en cuenta todos estos planteamientos, sería factible esperar que un aporte suplementario de esta vitamina tenga efectos protectores en el caso de lesiones hepáticas provocadas por el etanol. Por lo que podría constituir un tratamiento, al menos paliativo, contra los efectos nocivos del tóxico.
El empleo de mediciones morfométricas permite obtener datos cuantitativos de gran valor pronóstico para evaluar daños celulares presentes en varias enfermedades, entre estas las provocadas por el etanol.11,12 El estudio de variables morfométricas como son el área nuclear y del citoplasma sería de gran utilidad para evaluar los efectos del ácido fólico como posible protector hepático, por lo que la presente investigación tiene como objetivo determinar el comportamiento de esas variables en el hígado de conejos alcohólicos adolescentes tratados con ácido fólico
Métodos
Se utilizaron 24 conejos de la familia lagomorfos, raza Nueva Zelanda, machos, de 100 d de vida posnatal. Se formaron 4 grupos de idéntico tamaño: Grupo A-tratados con etanol, Grupo B-tratados con etanol y ácido fólico, Grupo C-tratados con ácido fólico, Grupo D-control. La asignación a cada grupo se hizo al azar utilizando una tabla de números aleatorios. Los conejos fueron colocados en jaulas individuales, se enumeraron y marcaron. Se les suministró ad libitum pienso para conejo.
Para el suministro del etanol se midió la cantidad de agua ingerida cada día por los animales y se halló la media de estas cantidades. Se les suministró solo esa cantidad de agua diaria a la cual se añadió el alcohol que debían ingerir para procurar que consumieran la dosis total de este calculada de acuerdo con el peso corporal por día.
Se utilizó una dosis de etanol de 5 g/kg de peso corporal por día diluido en el agua de beber. Los conejos se pesaron todas las semanas con una balanza marca Salter modelo 235 PBW y con los valores obtenidos se calculó la cantidad de etanol que se debía suministrar por día. El tratamiento se extendió por 16 semanas.A los animales de los grupos B y C se les administró ácido fólico a razón de 1 mg/kg de peso corporal por día.13
Al final de la experiencia los animales fueron anestesiados con pentobarbital sódico por vía endovenosa a una dosis de 60 mg/kg de peso corporal.13 Se extrajo el hígado y se tomaron fragmentos de 1 cm3, se fijaron en formalina neutra tamponada 12 % y se procesaron por el método de la parafina. Se obtuvieron cortes de 4 micrómetros, y se colorearon con hematoxilina y eosina.
Se evaluaron las variables morfométricas: área núcleo (AN), área citoplasma (AC), y la relación área núcleo/área citoplasma (AN/AC), mediante la digitalización de las imágenes y las mediciones sobre ellas utilizando el software ImageToolfor Windows v 3.00.14 Para esto se contornearon los núcleos y los citoplasmas de las células seleccionadas al azar. Se utilizaron imágenes a menor aumento y para delimitar las 3 zonas del lobulillo, se trazó una línea imaginaria desde la vena central del lobulillo hasta su zona portal; a la región que ocupó una posición intermedia entre ambos extremos se le denominó zona intermedia y a las zonas próximas a la vena central y a la zona portal se le llamó perivenosa y periportal, respectivamente. Las mediciones se realizaron con objetivo de inmersión.
En cada animal se midieron 30 células en total, 10 células por cada zona. Los resultados obtenidos se exportaron al paquete estadístico SPSS for Windows v 11.0.1 para su procesamiento. Se realizó ANOVA de dos vías con interacción, tomando las variables morfométricas como dependientes continuas y como variables independientes, el etanol, el ácido fólico y su interacción.
Resultados
Al comparar las variables morfométricas AN, AC, y relación AN/AC de los hepatocitos en cada una de las zonas del lobulillo hepático, se observaron los resultados siguientes. En la zona periportal los valores medios de AN en los grupos tratados con etanol, con ácido fólico y en los controles, presentaron valores similares. En los tratados con etanol y ácido fólico a la vez se observaron valores superiores, aunque esto no fue significativo (tabla 1).
Tabla 1. Estadística descriptiva de las variables morfométricas en la zona periportal
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Zonas
Áreas
Control
Ácido fólico
Etanol
Etanol y ácido fólico
Zona peri portal
AN
= 29,7
]]>
= 28,9
= 29,0
= 30,6
DE= 7,0
DE= 7,9
DE= 6,0
DE= 6,5
AC
= 193,5
= 200,5
]]>
= 247,1
= 208,8
DE= 47,9
DE= 59,0
DE= 56,8
DE= 61,8
AN/AC
= 0,15
= 0,15
= 0,12
]]>
= 0,15
DE= 0,03
DE= 0,04
DE= 0,03
DE= 0,04
Zonas
Áreas
Ácido fólico
Etanol
Etanol y ácido fólico
]]>
F
P
F
P
F
P
Zona periportal
AN
0,1
0,6
]]>
0,3
0,5
1,9
1,6
AC
4,5
0,03
17,9
0,00
9,5
]]>
0,00
AN/AC
6,6
0,01
8,3
0,00
15,0
0,00
La media del AC fue superior en el grupo tratado con etanol con respecto a los demás grupos de tratamiento. Se observó que el grupo que consumió etanol y ácido fólico mostró valores inferiores a los del grupo tratado solo con etanol, pero estos valores fueron superiores a los observados en los animales que consumieron solo ácido fólico. El grupo control mostró los valores menores para la variable AC de todo el conjunto. Se observó interacción entre el alcohol y el ácido fólico (tabla 1).
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La relación AN/AC en el grupo tratado con etanol mostró valores inferiores al grupo tratado solo con ácido fólico. El grupo al que se le administró etanol más ácido fólico presentó valores similares a los del grupo tratado solo con ácido fólico. Los valores medios de los animales controles fueron similares a los de los animales tratados con ácido fólico y a los tratados con etanol más ácido fólico. Se produjo interacción entre el etanol y el ácido fólico (tabla 1).
En la zona intermedia los valores medios del AN fueron mayores en los animales tratados con etanol comparados con los observados en el resto de los grupos de tratamiento, aunque estas diferencias no fueron significativas (tabla 2).
Tabla 2. Estadística descriptiva de las variables morfométricas en la zona intermedia del lobulillo hepático
ZONAS
Áreas
Control
Ácido fólico
Etanol
Etanol y ácido fólico
]]>
Zona periportal
AN
= 29,6
= 29,9
= 30,4
= 27,7
DE= 21,8
DE= 7,0
DE= 5,2
DE= 5,5
]]>
AC
= 214,7
= 211,4
= 294,8*
= 257,8
DE= 76,0
DE= 44,5
DE= 92,2
DE= 106,0
AN/AC
]]>
= 0,25
= 0,14
= 0,11
= 0,11
DE= 0,7
DE= 0,04
DE= 0,03
DE= 0,03
Zonas
Áreas
]]>
Ácido fólico
Etanol
Etanol y ácido fólico
F
P
F
P
F
P
Zona intermedia
]]>
AN
0,6
0,4
0,1
0,6
0,9
0,3
AC
3,5
0,06
]]>
34,8
0,00
2,4
0,1
AN/AC
0,9
0,3
2,7
0,09
1,1
]]>
0,2
La media del AC fue mayor en el grupo tratado con etanol, con respecto a los otros grupos. El efecto de la variable etanol fue muy significativo en esta zona del lobulillo (p< 0,001). En el grupo que ingirió etanol y ácido fólico, los valores medios fueron menores que los del grupo que ingirió etanol, pero superiores a los del grupo control y a los tratados solo con ácido fólico. No se comprobó interacción entre el etanol y el ácido fólico (tabla 2).
A los animales a los que se les suministró solo etanol y los tratados con etanol y ácido fólico mostraron valores menores en las medias al evaluar la relación AN/AC, al compararlos con los valores obtenidos en los grupos control y tratados solo con ácido fólico; aunque esto no fue significativo.
En la zona perivenosa la media del AN en el grupo tratado con etanol fue similar al grupo tratado con etanol y ácido fólico, y superior a la media del grupo al que se le suministró ácido fólico y a la del grupo control. Se comprobó un efecto significativo de la variable etanol sobre el AN de los hepatocitos.
Los valores medios del AC de los animales tratados con etanol fueron similares a los mostrados por el grupo al que se le administró etanol y ácido fólico, y superiores a los valores observados en el grupo tratado con ácido fólico y en el grupo control. Se comprobó un efecto significativo de la variable etanol sobre el AC de los hepatocitos. No se observó interacción entre el etanol y el ácido fólico.
En la relación AN/AC los valores medios fueron menores en el grupo tratado con etanol, con respecto a los demás grupos de tratamiento y esta diferencia fue significativa (p< 0,001). El grupo etanol y ácido fólico también mostraron valores menores que los grupos control y ácido fólico, aunque esto no fue significativo. No se comprobó interacción entre las variables etanol y ácido fólico.
Tabla 3. Estadística descriptiva de las variables morfométricas en la zona perivenosa del lobulillo hepático
Zonas
]]>
Áreas
Control
Ácido fólico
Etanol
Etanol y ácido fólico
Zona perivenosa
AN
= 26,7
= 26,0
= 28,0*
]]>
= 28,2
DE= 6,1
DE= 5,3
DE = 6,7
DE = 6,6
AC
= 227,3
= 223,2
=277,2*
= 278,4
]]>
DE= 63,6
DE= 60,4
DE= 76,5
DE= 105,3
AN/AC
= 0,12
= 0,12
= 0,10*
= 0,11
DE= 0,03
]]>
DE= 0,03
DE= 0,03
DE= 0,03
Zonas
Áreas
Ácido fólico
Etanol
Etanol y ácido fólico
F
P
]]>
F
P
F
P
Zona perivenosa
AN
0,1
0,7
4,7
0,03
]]>
0,2
0,6
AC
0,02
0,8
26,8
0,00
0,06
0,7
AN/AC
]]>
0,06
0,8
7,2
0,00
0,2
0,6
Discusión
Al analizar los resultados se comprobó que las 3 zonas del lobulillo mostraron variaciones en cuanto a las variables AN, AC, AN/AC; en los diferentes grupos de tratamiento. Esto difiere de lo planteado por algunos autores, que no han encontrado variaciones importantes entre las zonas del lobulillo15 y apoya los planteamientos de otros investigadores quienes señalan que existe una heterogeneidad zonal morfológica, funcional y en la respuesta a xenobióticos en el lobulillo hepático.12,16,17
Se ha señalado que el lobulillo hepático presenta heterogeneidad zonal dada por la disponibilidad de oxígeno en las regiones cercanas a la zona portal, con carencia de este en las cercanías de la vena centrolobulillar. También se plantean diferencias en las características genotípicas, fenotípicas y en las funciones metabólicas y xenobióticas de sus 3 zonas.16,17
En el presente estudio se observó que en la zona periportal las medias de las áreas nucleares tuvieron un comportamiento similar en los diferentes grupos de tratamiento y no se observaron diferencias significativas entre ellas. El área citoplasma estuvo influenciada tanto por el efecto del etanol como por el ácido fólico. La relación AN/AC confirma los resultados de las mediciones AN y AC por separado.
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En la zona intermedia, los valores de AN son algo mayores en el grupo tratado con etanol, y aunque estos valores no resultaron significativos, sí concuerdan con otros estudios realizados en hígado.15 En el AC se comprobó que los animales tratados solo con etanol presentaron los mayores valores, y la diferencia fue significativa. Este efecto agresivo del etanol en la zona intermedia pudiera explicarse porque sus características genotípicas y fenotípicas difieren de las de la zona periportal, según plantean los autores que defienden la existencia de heterogeneidad zonal en el lobulillo hepático16 y confirman que el etanol es una sustancia tóxica para el hígado.
Los animales tratados con etanol y ácido fólico, presentaron valores medios de estas variables menores que los tratados solo con etanol, aunque mayores que los animales controles y los tratados solo con ácido fólico. Esto pudiera deberse a un efecto beneficioso del ácido fólico al nivel celular en esta zona. Se comprobó, además, que no hubo interacción entre las variables alcohol y ácido fólico.
Cuando se analizó la variable relación AN/AC se comprobó que esta tuvo un comportamiento similar entre los grupos tratados solo con etanol, con respecto a los tratados con etanol y ácido fólico; esto concuerda con los resultados obtenidos al comparar ambas variables por separado y reafirma el efecto tóxico del etanol, como sugieren otros autores.18-20
Cuando se analizó la zona perivenosa se comprobó que las variables AN y AC fueron significativamente mayores en el grupo tratado con etanol al compararlo con el resto de los grupos. En cambio la variable relación AN/AC presentó los menores valores en este grupo y esto fue significativo.
Esos resultados demostraron que en los hepatocitos de la zona perivenosa se produjo un incremento del tamaño celular, lo cual concuerda con los hallazgos reportados por otros investigadores,12 y coincide con el planteamiento de un mayor riesgo de esta zona al daño tisular.16
En la presente investigación se comprobó la existencia de heterogeneidad zonal, dada por las diferencias en los valores morfométricos en las 3 zonas del lobulillo, la zona perivenosa fue la que mostró las mayores alteraciones. Por otra parte se comprobó que en los animales tratados con ácido fólico el daño causado por el tóxico fue menor.
Protective effects of folic acid on hepatocytes from adolescent alcoholic male rabbits
Summary
The protective effects of folic acid on hepatocytes of alcoholic adolescent rabbits were evaluated. To this end, morphometric variables like core area, cytoplasmic area and core area/ cytoplasmic area ratio were analyzed in hepatocytes of the 3 hepatic lobule areas. Twenty four rabbits divided into 4 groups were used; they were treated with ethanol, with ethanol and folic acid, with folic acid and untreated controls. For the morphometric study, we used software Image Tool for Windows 3000, and two-way interactive ANOVA was also applied. The animals treated with ethanol presented disturbances in morphometric variables, particularly in intermediate and perivenous areas. The alcoholic animals that received folic acid exhibited higher values of the studied variables than controls, but lower than those of the animals that just took ethanol. It was concluded that folic acid protects hepatocytes, and on the other hand, heterogeneity of hepatic lobule areas in all the studied groups was confirmed.
1. Philpot RM, Badanich KA, Kirstein CL. Place conditioning age-related changes in the rewarding and aversive effects of alcohol. Alcohol Clin Exp Res 2003;27(4):593-9.
2. Hemmingsson T, Lundberg I. Development of alcoholism: interaction between heavy adolescent drinking and later low sense of control over work. Alcohol Alcoholism 2001;36(3):207-12.
3. Guibert Reyes W, Gutiérrez Díaz I, Martínez Gómez C. Comportamiento ante el alcohol de los estudiantes en las etapas de la adolescencia Rev Cubana Med Gen Integr 2005;21(1-2). URL disponible en http://www.infomed.sld.cu/revistas/indice.html
4. Maddock J, Glanz K. The relationship of proximal normative belief and global subjective norms to collage student’s alcohol consumption. Addict Behav 2005;30(2):315-23.
5. Andersen A, Due P, Holstein BF, Iverson I. Tracking drinking behavior from age 15-19 years. Addiction 2003;98(11):1505-11
6. Spea LP. Alcohol’s effects on adolescents. Alcohol Research 2002;26(4):287-91
7. González Menéndez R. Alcoholismo abordaje integral. Santiago de Cuba:Editorial Oriente, Instituto Cubano del Libro; 2004. p. 95-7.
8. Gutiérrez Salinas J, Morales González JA. Producción de radicales libres derivados del oxígeno y el daño al hepatocito. Med IntMex 2004;20:287-95.
9. Cano MJ, Ayala A, Murillo ML, Carreras O. Prospective effect of folic acid against oxidative stress produced in 21-day postpartum rats by maternal-ethanol chronic consumption during pregnancy and lactation period. Free RadicRes 2001;34(1):1-8.
10. García Rodríguez S, Arguelles S, Llopis R, Murillo ML, Machado A, Carreras O, et al. Effect of prenatal exposure to ethanol on hepatic elongation factor-2 and proteome in 21 d old rats: protective effect of folic acid. Free RadicBiol Med 2003;35(4):428-37.
11. Díaz Rojas PA, Sánchez Meca J. El área nuclear como indicador diagnóstico en el carcinoma ductal de la mama: un estudio metaanalítico. Rev Cubana InvestBiomed 2004;23(3):50-5.URL disponible en http://www.infomed.sld.cu/revistas/indice.html
12. Jacqueline T, Pérez M, Herrera Batista A, Puldon Seguí G. Comportamiento de las variables morfométricas en el hígado de ratas machosalcohólicas adolescentes inoculadas con Heberbiovac HB. 2005http://WWW.conganat.org/7congreso/final/vistaImpresion.asp
13. Harris I. The laboratory rabbit. ANZCCART News 1994;7(4):1-11.
14. Wilcox D, Dove B, McDavid D, Creer D. UTHSCSA Imagen Tool for Windows Version 3.00 The University of Texas Health Science Center in San Antonio 2002;4:204-11
15. González Bravo M, Herrera Batista A, Coro Antich RM, Puldón Seguí G. Alteraciones morfométricas de los hepatocitos de ratas albinas que ingieren alcohol desde la adolescencia. Rev Cubana InvestBiomed 2003;22(2):117-22.
16. Otero W, Sierra F. El hígado en Cirugía. Rev Coloma Gastroenterol 2003;18:230-8.
17. González Bravo M, Herrera Batista A, Domínguez Álvarez C, Coro Antich RM,Lebredo Álvarez I. Efectos del alcoholismo crónico sobre las características morfológicas y ultramicroscópicas del hígado de ratas adolescentes. 2004 http://conganat.sld.cu/autores/trabajos/T342/index.html
18. Roca Goderich R, SmithSmith V, Paz Presilla E. Temas de Medicina Interna. 4ª ed. La Habana. Editorial CienciasMédicas; 2002. p.255-64.
19. Nakamura Y, Kobayashi Y, Ishikawa A, Maruyama K, Higuchi S.Severe chronic pancreatitis and severe liver cirrhosis have different frequencies andare independent risk factors in male Japanese alcoholics J Gastroenterol 2004;39(9):915-7.
20. Herrera Batista A, Puldón Seguí G, Díaz Rondón B, Bacallao Gallestey J.Efectos del alcoholismo crónico sobre la presión arterial y frecuencia cardiaca en ratas adolescentes machos. Rev Cubana Invest Biomédicas 2006;25(1). URL disponible en http://bus.sld.cu/revistas/ibi/vol 25-1-06/ibi 04106.htm
Recibido: 10 de febrero de 2007. Aprobado 12 de marzo de 2007. Dra. Aleida Herrera Batista. Calle 194 número 1511, entre 15 y 17 Siboney, municipio Playa. Correo electrónico: candina@infomed.sld.cu
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