Inmunogenicidad de proteínas recombinantes comparada con el empleo de herramientas bioinformáticas
Immunogenicity of recombinant proteins compared with the use of bioinformatics tools
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MsC. Dr. Orlando R. Serrano Barrera
Universidad de Ciencias Médicas, Las Tunas, Cuba.
RESUMEN
Objetivo: para determinar la utilidad de herramientas inmunoinformáticas para detectar péptidos que puedan ser inmunodominantes, y evaluar las diferencias entre las respuestas inmunes de los modelos animales empleados en los estudios preclínicos y en los humanos.
Métodos: se modeló la respuesta frente a dos proteínas exógenas: la estreptocinasa recombinante y el antígeno de superficie de la hepatitis B. A partir de sus secuencias primarias se emplearon algoritmos para identificar epítopes B y T frente a moléculas HLA de clase I y II (HLA-A*0201, HLA-DRB1*0301 y HLA-DRB1*0701) y los haplotipos murinos H2-Kd y H2-Kk. Se seleccionaron los péptidos de más alta puntuación. ]]>
Resultados: el algoritmo ABCPred mostró una mejor capacidad de predicción de epítopes B, mientras fue mayor la coincidencia para los programas de modelación de la respuesta T. Los epítopes generados para el haplotipo H2-Kk tuvieron una similitud mayor con los presentados por las moléculas HLA seleccionadas.
Conclusiones: se presenta una metodología aplicable al desarrollo de vacunas de subunidades y multiepitópicas, así como para otros fármacos biotecnológicos de naturaleza peptídica, que permite optimizar las etapas preclínicas y clínicas, a muy bajo costo, mínimos requerimientos tecnológicos, utilización óptima de medios, recursos y capital humano disponibles en cualquier institución del sistema nacional de salud.
Palabras clave: bioinformática, inmunoinformática, modelación computacional, biología computacional, ensayos preclínicos, inmunofarmacología.
ABSTRACT
Objective: Determine the usefulness of immunoinformatics tools to detect potentially immunodominant peptides, and evaluate the differences between the immune responses provided by the animal models used in preclinical and human studies.
Methods: Modeling was conducted of the response to two exogenous proteins: recombinant streptokinase and hepatitis B surface antigen. Based on their primary sequences, algorithms were used to identify B and T epitopes against HLA class I and II molecules (HLA-A*0201, HLA-DRB1*0301 and HLA-DRB1*0701), and murine haplotypes H2-Kd and H2-Kk. The highest scoring peptides were chosen.
Results: ABCPred algorithm showed a better prediction capacity for B epitopes, whereas coincidence was greater in modeling programs for the T response. The epitopes generated for haplotype H2-Kk had greater similitude with those presented by the HLA molecules selected.
Conclusions: A methodology is presented which is applicable to the development of subunit and multiepitope vaccines, as well as other peptidic biotechnological drugs. This methodology allows optimization of the preclinical and clinical phases at a very low cost, with minimal technological requirements, optimal use of media, and resources and human capital available at any institution of the national health system.
Key words: bioinformatics, immunoinformatics, computational modeling, computational biology, preclinical assays, immunopharmacology.
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INTRODUCCIÓN
La inmunoinformática es un área emergente de aplicación de la modelación computacional a los procesos inmunitarios, con implicaciones para la solución de cuestiones relevantes para la inmunobiología y la vacunología.1 En los últimos años se han diseñado, creado y publicado numerosas y variadas bases de datos y herramientas inmunoinformáticas para la modelación computacional de los diferentes eventos de la respuesta inmune.1-3 La inmunoinformática se ha ido integrando al desarrollo de candidatos vacunales contra agentes infecciosos y tumores malignos.2, 4, 5
La inmunoinformática tiene aplicaciones potenciales que van desde los mecanismos básicos hasta la investigación aplicada: fallos vacunales, emergencia de cepas de escape, eventos adversos relacionados con la vacunación, desarrollo de vacunas personalizadas y de nuevos adyuvantes, mejora y combinación de vacunas existentes, etcétera.6 En el caso de la vacuna anti-hepatitis B se ha descrito que la sustitución de aminoácidos, sobre todo de la región 137-147, en el antígeno de superficie (AgsHB) puede traer como consecuencias cambios en la inmunogenicidad, evasión de los mecanismos inmunitarios y fallos diagnósticos.7 La estreptocinasa (SK, del término en inglés streptokinase), por otra parte, es un eficaz agente trombolítico empleado para, entre otras aplicaciones, el tratamiento del infarto agudo del miocardio.8 En algunas poblaciones los sujetos portan altos títulos de anticuerpos anti-SK y no se recomienda la utilización de este fármaco.9,10 Este fenómeno ha sido reportado en Cuba, donde se ha encontrado un 30,4 % de prevalencia de anticuerpos circulantes en las personas incluidas.10 La producción de una SK menos inmunogénica podría ser una alternativa para estos casos.8
Las técnicas disponibles para evaluar la inmunogenicidad de proteínas son de escaso valor para la predicción de las características clínicas de los fármacos y, por otra parte, muchos aspectos de la inmunogenicidad no han sido adecuadamente explorados por métodos experimentales.11 Los métodos bioinformáticos facilitan la búsqueda de antígenos para la mayoría de las proteínas, por lo que las herramientas inmunoinformáticas pueden simular las respuestas inmunes a un producto, sea o no empleado en la vacunación, y ahorrar tiempo y costos.12, 13
MÉTODOS
Evaluación de la utilidad de los algoritmos bioinformáticos en la predicción de la inmunogenicidad de proteínas terapéuticas recombinantes
A partir de la secuencia primaria de la estreptocinasa recombinante cubana, contenida en la base de datos UniProt bajo el número de acceso Q53284, se emplearon tres algoritmos para identificar epítopes B: BepiPred, Bcepred y ABCpred. Se seleccionaron dos herramientas para la identificación de los epítopes de células T: SYFPEITHI y BIMAS. Se escogieron los cinco primeros epítopes en cada caso. Se trabajó con moléculas MHC (del inglés Major Histocompatibility Complex) reportadas como más frecuentes en la población cubana: HLA-A*0201, HLA-DRB1*0301 y HLA-DRB1*0701.14, 15 Los hallazgos in silico se compararon con las regiones antigénicas de la estreptocinasa encontradas por métodos in vitro y reportadas en la literatura. ]]>
Comparación de la inmunogenicidad de proteínas recombinantes entre modelos de laboratorio y humanosA partir de las secuencias primarias de la estreptocinasa recombinante (UniProt Q53284) y del antígeno de superficie de la hepatitis B (GenBank X02763.1), se trabajó con un algoritmo para modelar epítopes B (ABCpred) y otro para epítopes T (SYFPEITHI). Se seleccionaron los primeros cinco epítopes obtenidos con las herramientas inmunoinformáticas. Se consideraron los haplotipos murinos de modelos empleados en la experimentación biomédica: H2-Kd y H2-Kk.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Predicción de la inmunogenicidad de proteínas terapéuticas recombinantes
Uno de los principales objetivos del desarrollo de vacunas y de la evaluación inmunofarmacológica e inmunotoxicológica de fármacos es la identificación de los componentes microbianos que generan una respuesta inmune, sea protectora o no. La predicción de los epítopes B de la SK recombinante cubana, a partir de los algoritmos bioinformáticos empleados, aparece en la tabla 1. ]]>
Se observa algún grado de solapamiento entre los péptidos 1 (ABCPred) y 4 (BepiPred), 2 (ABCPred) y 3 (BepiPred) y 4 (ABCPred) y 5 (BepiPred). ABCPred fue, por tanto, el algoritmo que mostró una mejor capacidad de predicción.Un estudio de inmunolocalización de epítopes lineales reconocidos por anticuerpos de tipo IgG en la estructura primaria de la SK encontró los sitios S379-T390 y Y397-N410, que se relacionan con los identificados por ABCpred y que se corresponden con regiones compartidas por los predichos por otros algoritmos.16 La región 373-414 fue reconocida respectivamente por el 39 y el 64 % de los sueros de pacientes antes y después de recibir tratamiento con SK.8, 17 El epítope G139-Q152, también identificado por ABCpred, fue encontrado en un reporte ya mencionado.16 El péptido 1 propuesto por Bcepred ya había sido mapeado en otros estudios con sueros de pacientes, anticuerpos monoclonales y bibliotecas de fagos.18, 19
La tabla 2 contiene la modelación de la respuesta de células T para antígenos HLA de clase I y II. En el caso de la molécula HLA-A*0201 se observa una muy buena correspondencia entre los dos algoritmos empleados, con al menos tres péptidos igualmente identificados entre los primeros cinco. La administración de SK es seguida por el rápido aumento de la frecuencia de linfocitos T anti-SK y de la respuesta proliferativa en ensayos in vitro. La región 100-150, que contiene el péptido ubicado en el primer lugar por los dos algoritmos empleados en la modelación de la respuesta T, mostró los mayores índices de proliferación y fue la reconocida preferencialmente en la mayoría de los ensayos.20
La respuesta mediada por las dos moléculas de clase II seleccionadas comparte dos epítopes, iniciados en los residuos 76/77 y 310, y otra región formada por el solapamiento de dos péptidos, 296 y 310. Existe una asociación reconocida entre el incremento de la población de células T específicas para SK y las concentraciones séricas de anticuerpos anti-SK, responsables estos últimos de la neutralización del fármaco y de las reacciones de tipo alérgico.18
La correspondencia de las predicciones hechas por los algoritmos inmunoinformáticos con lo encontrado por diversos autores a través de variados métodos tradicionales de la experimentación biológica habla a favor de un patrón consistente de respuesta focalizada sobre regiones inmunodominantes en la respuesta in vivo, que concentran los anticuerpos producidos por los pacientes expuestos a la bacteria o tratado con la SK,18 y la posibilidad de identificar las regiones antigénicas con mayor capacidad alergénica, con vistas a su modificación para reducir las reacciones adversas al fármaco.21
La disponibilidad de métodos in silico para predecir los determinantes antigénicos, tanto de anticuerpos como de células T, significa un complemento importante en los procesos de diseño, selección, desarrollo y evaluación de vacunas y productos sintéticos y recombinantes.22 El reconocimiento y la unión a los epítopes derivados de las moléculas de los patógenos, que conduce a la activación de los linfocitos T y a la producción de anticuerpos, son los elementos claves para una respuesta protectora23 y constituyen la base para el diseño de las vacunas multiepitópicas para uno o varios agentes. Los algoritmos bioinformáticos pueden identificar más de la mitad de los péptidos con real capacidad de unirse a los receptores inmunitarios; ello reduce el trabajo del laboratorio tradicional, con un 85 % menos de gastos en materiales, labor y tiempo.23 La mejor caracterización y modelación de las respuestas inmunes conduce a las posibilidades de refinamiento en términos de potenciar la inmunogenicidad y reducir los posibles efectos adversos, ya sea por autoinmunidad o hipersensibilidad.24, 25
Comparación de la inmunogenicidad de proteínas recombinantes entre modelos de laboratorio y humanos
En el caso de la inmunología, los ratones han permitido un profundo discernimiento de la estructura y el funcionamiento del sistema inmune, a pesar de las diferencias entre la biología humana y la murina: proporción de subpoblaciones leucocitarias, subclases de inmunoglobulinas, citocinas y sus receptores, diferenciación Th1/Th2, expresión y función de moléculas coestimulatorias, etc.26
La tabla 3 muestra la respuesta T frente a la SK recombinante producida en Cuba en el contexto de dos haplotipos murinos y moléculas HLA. De los cinco primeros epítopes seleccionados entre las dos líneas de ratón, solo hay una coincidencia: la región de la secuencia iniciada entre los residuos 96-101. Al comparar esas posibles respuestas con la humana, particularmente para el HLA-A*0201, no se observan similitudes con el haplotipo H2-Kd, mientras que aparecen cuatro epítopes en regiones similares para el haplotipo H2-Kk, para las posiciones 133/135, 259/262/268/269. Para las moléculas de clase II humanas, se encontraron tres solapamientos (226/232, 343/346, 98/101) con H2-Kk y solo uno para H2-Kd (296/298).
Para el caso del AgsHB (tabla 4), hubo una coincidencia entre ambos haplotipos murinos, en la región 175/181, y dos epítopes en regiones solapadas entre el HLA-A*0201 y H2-Kk (191 y 264/272). Para el caso de las moléculas de clase II, aparecieron cinco coincidencias entre el HLA y H2-Kk (45/50, 185/194, 191/194, 199/194, 267/272) frente a dos coincidencias con H2-Kd (172/181, 376/379). ]]>
Las diferencias documentadas entre líneas de ratón son de diversa naturaleza y en ellas subyacen las características propias en cuanto a los mecanismos de defensa. Puede pensarse en resistencia variable a infecciones: A/J, DBA/2 y BALB/c son altamente susceptibles a Staphylococcus aureus, mientras que C3H/HeN, CBA y C57BL/10 son medianamente resistentes.27 Con respecto al parásito Leishmania amazonensis se ha descrito tres grupos: susceptibles (C57BL/10 y CBA), relativamente resistentes (DBA/2) y resistentes (C3H.He).28 Por otro lado, debe tenerse en cuenta la composición de los elementos del sistema inmune: BALB/c tiene un mayor número de células T de memoria y activadas, tanto CD8+ como CD4+, y menos linfocitos vírgenes (naive), con relación a otras líneas en determinadas condiciones experimentales.29 La respuesta ante la infección, tanto en células T como en subclases de IgG, también depende del haplotipo H2.29-31La identificación de los epítopes inmunodominantes, que pueden ser delineados con el uso de los métodos computacionales incluso antes de inocularse un animal de laboratorio, pueden ser la base de modificaciones en la secuencia que reduzcan o incrementen la inmunogenicidad, según se desee y como se ha hecho para la infección por el virus de la hepatitis B.7, 32, 33 También, para clarificar los procesos patogénicos de la infección por el agente.25, 34
En igual sentido, se debe ser cauteloso en la designación de los biomodelos para la selección de epítopes para candidatos vacunales o para la decisión de secuencias a modificar en proteínas recombinantes con potencial autoinmune o alergizante.
Las diferencias en las respuestas entre murinos y el humano, descritas para diferentes moléculas, no deben ser vistas como impedimento sino como oportunidad para la mejor selección de dianas terapéuticas y vacunales, procesos en los cuales los algoritmos bioinformáticos pueden igualmente reducir costos y tiempo.
El uso de la inmunoinformática ha sido limitado en el sistema cubano de salud, a pesar de las numerosas aplicaciones básicas y aplicadas; esa problemática ha sido identificada en otros países.15 Sus potencialidades, apenas esbozadas en los estudios aquí presentados con dos moléculas de amplio uso en nuestro medio, pueden ampliarse en investigaciones básicas, ensayos preclínicos y clínicos y otras circunstancias.24 Su alcance supera la inmunología, para extenderse a la microbiología, la farmacología, la vacunología, la epidemiología y la salud pública.
Para la predicción de epítopes es recomendable la combinación de varios de los algoritmos inmunoinformáticos disponibles, sobre todo en el caso de los epítopes de células B. Los resultados de la modelación de la inmunogenicidad pueden servir de base para la selección de los mejores candidatos vacunales y para las modificaciones que se requieran con el objetivo de potenciar las respuestas deseadas y reducir las reacciones adversas a proteínas recombinantes. La selección de los biomodelos animales para los estudios preclínicos debe ser cuidadosa y puede ser apoyada por métodos bioinformáticos.
Se presenta una metodología aplicable al desarrollo de vacunas de subunidades y multiepitópicas, así como para otros fármacos biotecnológicos de naturaleza peptídica, que permite optimizar las etapas preclínicas y clínicas, a muy bajo costo, mínimos requerimientos tecnológicos, utilización óptima de medios, recursos y capital humano disponibles en cualquier institución del sistema nacional de salud.
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Recibido: 16 de mayo de 2012.
Aprobado: 21 de junio de 2012. ]]>
MsC. Dr. Orlando R. Serrano Barrera. Universidad de Ciencias Médicas, Las Tunas, Cuba. Correo electrónico: orlandosb@infomed.sld.cu ]]>
