ARTÍCULO ORIGINAL

Carcinogenicidad del D-004 en ratas Srague Dawley: informe parcial a los 18 meses

Carcinogenicity of D-004 in Sprague Dawley rats: a partial report at 18 months

Dra. C. Ariadne Gutiérrez Martínez, Dr. C. Rafael Gámez Menéndez, Dra. C. Rosa Mas Ferreiro, Dra. C. Miriam Noa Puig, MSc. Maikel Valle Clara, Dr. Carlos Nodal Flores

RESUMEN

Introducción. el D-004, extracto lipídico del fruto de Roystonea regia (palma real),  constituido por una mezcla reproducible de ácidos grasos -principalmente oleico, palmítico, láurico y mirístico- ha mostrado ser efectivo en modelos experimentales de hiperplasia prostática.
Objetivo. resumir los resultados parciales (18 meses) del estudio de carcinogenicidad por exposición repetida y prolongada del D-004 en ratas Sprague Dawley, el cual culminará al concluir el tiempo establecido (24 meses).
Métodos. ratas Sprague Dawley de uno y otro sexo fueron distribuidas aleatoriamente en cuatro grupos (50 ratas/sexo/grupo): uno control de vehículo y tres tratados con D-004 (500, 1000 y 1500 mg/kg, respectivamente). Los tratamientos se administraron oralmente por intubación gástrica. Este reporte incluye los resultados de peso corporal, observaciones clínicas, mortalidad y frecuencia de aparición de tumores hasta ese momento (18 meses).
Resultados. la frecuencia de mortalidad es baja: en los grupos tratados fue de un 8,3 % por un 9 % en los controles. No se evidencia una disminución en el tiempo de supervivencia y las observaciones diarias no revelaron signos indicativos de toxicidad atribuibles al tratamiento. Además, el momento de aparición de tumores y la frecuencia de estos en los animales tratados y en los controles fueron estadísticamente similares en ambos sexos.
Conclusiones. en conclusión, la administración oral de D-004 (500-1500 mg/kg) a las ratas no mostró, durante los primeros 18 meses del estudio, evidencias de toxicidad o carcinogenicidad temprana relacionadas con el tratamiento. ]]>
Palabras clave: D-004, Roystonea regia, ácidos grasos libres, hiperplasia prostática, ratas, carcinogénesis.

ABSTRACT

Introduction: D-004, a lipid extract from royal palm (Roystonea regia) fruit constituted by a reproducible mixture of fatty acids, mainly oleic, palmitic, lauric and myristic, has shown to be effective in experimental models of prostate hyperplasia.
Objective: summarize the partial results (18 months) of the study on carcinogenicity by repeated and long-term exposure of Sprague Dawley rats to D-004, to be completed in the planned period of 24 months.
Methods: sprague Dawley rats of both sexes were randomly distributed into four groups (50 rats / sex / group): one group was the vehicle control and three were treated with D-004 (500, 1000 and 1500 mg/kg, respectively). Treatments were administered orally by gastric intubation. This report includes the results obtained so far (18 months) concerning body weight, clinical observations, mortality and frequency of appearance of tumors.
Results: mortality is low: 8.3% in treatment groups and 9% in controls. A reduction in survival time was not observed, and daily observations did not reveal any signs of toxicity attributable to the treatment. The time of appearance and the frequency of tumors in treated animals and controls were statistically similar in both sexes.
Conclusions: oral administration of D-004 (500–1500 mg/kg) to rats during the first 18 months of the study did not show any evidence of early carcinogenicity or toxicity associated with the treatment.
]]> Key words: D-004, Roystonea regia, free fatty acids, prostatic hyperplasia, rats, carcinogenesis.

INTRODUCCIÓN

La hiperplasia prostática benigna (HPB) es una afección de alta prevalencia en los hombres mayores de 50 años. Causa eventos adversos considerables para la salud, y su frecuencia aumenta con la edad.¹ Consiste en un crecimiento incontrolado del tejido prostático que involucra los elementos estromales y epiteliales de la glándula, y su origen es multifactorial. Una de las causas fundamentales del incremento del tamaño de la próstata con la edad es el aumento de la actividad de la 5α-reductasa prostática, enzima que transforma la testosterona (T) en su metabolito más activo, la dihidrotestosterona (DHT). Esta última, al unirse a los receptores androgénicos, promueve la proliferación de factores de crecimiento celular.¹ Por otra parte, los síntomas de la enfermedad se encuentran influidos por el aumento del tono de la musculatura lisa de la vejiga y la próstata, regulado por los α1-adrenoreceptores (α1-ADR).²

El tratamiento de la enfermedad abarca, según la gravedad, desde la vigilancia atenta hasta la cirugía, pero la terapia farmacológica es la más utilizada. Esta terapia se basa fundamentalmente en el empleo de dos clases terapéuticas: los inhibidores de la 5α-reductasa prostática (finasteride, dutasteride), ³ y los antagonistas de los ADR-α₁ (alfuzosin doxazosin, prazosin, terazosin, tamsulosin).²

El tratamiento de la HPB también incluye la fitoterapia, y el agente más conocido y estudiado es el extracto lipídico de los frutos Serenoa repens (saw palmetto, ELSP).⁴ El modo de acción del saw palmetto incluye diversos mecanismos, ya que inhibe la actividad de la enzima 5α-reductasa prostática, bloquea los receptores α-adrenérgicos⁵ y además posee efectos antiinflamatorios y antiproliferativos.^6,7

La Roystonea regia (palma real) es la palmácea más abundante en Cuba y presenta similitudes taxonómicas con el saw palmetto. El D-004 es un extracto lipídico del fruto de la palma real, constituido por una mezcla de ácidos grasos -principalmente oleico, palmítico, láurico y mirístico-⁸ que ha mostrado prevenir la hiperplasia prostática (HP) inducida con T en los roedores y que, como el ELSP, actúa mediante un mecanismo multifactorial que implica la inhibición de 5α-reductasa prostática,^9-11 el antagonismo de las respuestas mediadas por los α1-ADR,^12,13 y efectos antiinflamatorios y antioxidantes.^4,15 Tal similitud es consistente con la de las composiciones de los extractos lipídicos de los frutos de Roystonea regia y Serenoa repens. Tales antecedentes, unidos a los resultados obtenidos en los primeros estudios clínicos del D-004 que mostraron sus efectos antioxidantes en voluntarios sanos¹⁶ sustentan la necesidad de desarrollar la evaluación toxicológica de esta sustancia.

El D-004, en dosis de hasta 2000 mg/kg no reveló toxicidad en los estudios de dosis únicas y repetidas a corto y largo plazo, administradas por vía oral.^17-21 Tampoco mostró potencial citotóxico o mutagénico en ninguno de los sistemas empleados, entre los cuales se incluye el ensayo de Ames, el ensayo cometa, el ensayo de micronúcleos en medula ósea de roedores, aberraciones cromosómicas in vitro e in vivo y el ensayo de morfología de la cabeza del espermatozoide.^22-27 Por otra parte, otros estudios han demostrado que el D-004 no posee efectos estrogénicos o antiestrogénicos,^9,29 no modifica la actividad sexual en la rata macho,³⁰ ni diversos patrones conductuales en los roedores.³¹ El tratamiento con D-004 no afectó la fertilidad y la reproducción en ratas,³² ni produjo efectos embriotóxicos o teratogénicos en conejos, administrado en dosis de hasta 1000 mg/kg.³³

MÉTODOS

Animales

Se utilizaron ratas SD de uno y otro sexo (75 y 110 g), de 7 semanas de edad, provenientes del Centro de Producción de Animales de Laboratorio (La Habana, Cuba). Fueron colocadas en cajas para roedores (tres ratas por jaula) y mantenidas en cuarentena durante 7 días para su adaptación a las condiciones experimentales que se mantuvieron durante el estudio: temperatura 23 ± 2 ºC, humedad relativa del 60 ± 10 % y 12 h de ciclos de luz y oscuridad. Los animales tuvieron acceso libre al agua. Como alimento se suministró pienso convencional para roedores, proveniente del CENPALAB, el cual se administró en función del peso corporal promedio (10 % del peso) durante las primeras 13 semanas. A partir de la semana 14 la cantidad administrada a los animales se restringió al hasta el final del estudio.

La manipulación de los animales se realizó de acuerdo con los principios éticos para el uso de animales de laboratorio, recomendados internacionalmente y en la República de Cuba, y en correspondencia con las normas de Buenas Prácticas de Laboratorio y los Procedimientos Normalizados de Trabajo del Centro de Productos Naturales.

Administración y dosificación

El D-004 utilizado en los estudios fue suministrado por el Departamento de Química Farmacéutica del Centro de Productos Naturales, y se utilizó tras corroborar sus especificaciones de calidad. Su composición y pureza fueron determinadas mediante un método validado de cromatografía gaseosa.³⁴

Para su administración en el D-004 se preparó diariamente como emulsión en un vehículo Tween 65/H₂O al 2 %. Las emulsiones por emplear se prepararon 2 h antes de su utilización, tras corroborar su estabilidad y homogeneidad mediante cromatografía gaseosa.³⁵ Se realizaron los ajustes de la dosis según el peso corporal semanal.

Las ratas se distribuyeron aleatoriamente en cuatro grupos (50 ratas/sexo/grupo): uno control de vehículo y tres tratados con D-004 (500, 1000 y 1500 mg/kg, respectivamente). Los tratamientos se administraron oralmente por intubación gástrica (2 mL/kg). La dosis mayor estudiada es 300 veces superior que la dosis propuesta para su uso en los seres humanos (320 mg/día, aprox. 4,6 mg/kg).

Exámenes realizados

Peso corporal. El peso corporal se controló al inicio (día previo al comienzo del tratamiento), semanalmente hasta la semana 13, y mensualmente desde la semana 14 hasta los 18 meses.

Consumo de alimentos. El consumo de alimentos se controló dos veces a la semana durante las primeras 13 semanas y una vez al mes a partir de la semana 14.

Observaciones diarias. Los animales fueron observados diariamente en tres momentos: en la mañana (8:30 a 11:30 a.m.) se realizó una inspección minuciosa de cada animal; y entre las 2:00 y 3:00 p.m. y las 5:00 y 6:00 p.m. se registró cualquier cambio en la condición vital de cada animal. Estas observaciones perseguían detectar cualquier signo clínico de toxicidad, así como la posible aparición temprana de tumores palpables, animales moribundos o mortalidad.

Eutanasia

La eutanasia se practicó a todos los animales que manifestaron deterioro notable de salud, incluida la pérdida de peso mayor de un 10 % durante el estudio. Fueron anestesiados en una atmósfera de éter, y posteriormente desangrados. Hasta el corte de 18 meses solo se había practicado la eutanasia de nueve animales (cuatro controles y cinco tratados). Todos presentaban pérdida de peso y deterioro general, y seis de ellos mostraban tumores evidentes al tacto.

Se realizó la necropsia a todos los animales muertos por eutanasia o espontáneamente, y se evaluó in situ la presencia de lesiones macroscópicas en órganos y cavidades. En este reporte se incluyen las observaciones microscópicas de los animales necropsiados y su diagnóstico. Se utilizó la denominación "tumores palpables" en los animales vivos con tal manifestación y la de "tumores" para los confirmados en la necropsia. El momento de detección de las masas o tumores palpables fue la primera fecha en que se registró su detección.

Evidencia temprana de carcinogenicidad asociada al D-004

En este reporte se consideró como una evidencia temprana de carcinogenicidad relacionada con el tratamiento el aumento significativo de la frecuencia de mortalidad, la reducción del tiempo de supervivencia o el incremento de la frecuencia total de tumores (por sexo o en total) en los animales tratados con respecto a los controles hasta los 18 meses de tratamiento.

Análisis estadístico

Según lo establecido, la esencia de este tipo de estudios es el análisis de supervivencia y de aparición de tumores. El análisis de supervivencia del estudio total se hará según el modelo de regresión de Cox.

El análisis de las lesiones incluyó la incidencia total de animales con tumores, la incidencia total de tumores y el período de latencia hasta la aparición de tumores. Las variables continuas (peso corporal y consumo de alimentos) se compararon por la prueba de Levene y las diferencias se analizaron con un análisis de varianza (ANOVA). Si se encontraron efectos significativos, las diferencias se evaluaron por la prueba de Tukey. De no existir homogeneidad de varianza fueron analizadas por la prueba no paramétrica de Kruskall-Wallis.

RESULTADOS

Análisis de la mortalidad

En los primeros 18 meses de estudio se produjeron 34 muertes (8,5 %), distribuidas como refleja la tabla 1. La eutanasia se practicó en nueve casos, los cuales presentaban signos tales como pérdida de peso, reducción del consumo de alimentos, deterioro general, poca respuesta a estímulos y disnea marcada. Tres de ellos tenían lesiones tumorales evidentes al tacto y sangramiento, por lo que presentaban mucosas pálidas y debilidad. 

La mortalidad se comportó de modo similar en los grupos tratados y controles en ambos sexos: nueve muertes (9,0 %) ocurrieron en las ratas controles (seis hembras, tres machos), nueve (8,3 %) en las ratas tratadas; con 500 mg/kg (siete hembras, dos machos), cuatro en las tratadas con 1000 mg/kg (tres hembras, un macho) y 12 en las tratadas con 1500 mg/kg (siete hembras, cinco machos). La primera muerte ocurrió en un macho control pasados los 10 meses de tratamiento.

La comparación entre grupos de las frecuencias de mortalidad hasta los 18 meses de tratamiento por sexo y total no reveló diferencias significativas entre los grupos tratados y el control. Un análisis de supervivencia revela que la mortalidad y el tiempo de supervivencia en los animales tratados y los controles tuvieron un comportamiento similar. Un análisis por sexo reveló un comportamiento similar, sin diferencias entre animales tratados y controles (v. tabla 1).

Signos de toxicidad

Las observaciones diarias no revelaron signos de toxicidad, aparecieron en animales de uno y otro sexo y de todos los grupos, y se relacionaron con eventos aislados de lesiones por mordeduras, cambios en las deposiciones, lesiones en las extremidades inferiores, alopecia y tumores evidentes al tacto en los animales que murieron o fueron sacrificados antes de los 18 meses, así como en algunos que aún permanecen en estudio. La tabla 2 resume las lesiones evidentes al tacto en los animales que aún continúan en el estudio, presentes al culminar los 18 meses de tratamiento. 

Peso corporal y consumo de alimento

La tabla 3 muestra los datos de peso corporal, evidenciándose que no hubo diferencias significativas entre tratados y controles, ni tendencias con las dosis en ninguno de los sexos y un mayor aumento de estas variables en los machos que en las hembras.

Consistente con lo referido sobre la ganancia en peso, el consumo de alimentos fue similar en ambos sexos, tanto en los animales tratados como en los controles, si bien el consumo en los machos fue mayor que en las hembras (datos no mostrados).

Análisis anatomopatológico

Las tablas 4 y 5 resumen los resultados del análisis microscópico de los animales que murieron antes de los 18 meses de tratamiento, bien espontáneamente o por eutanasia. Las lesiones histopatológicas observadas fueron muy escasas y en ninguna de las comparaciones realizadas se encontraron diferencias significativas entre tratados y controles.

El número de animales con lesiones tumorales que fueron determinantes para la vida de los animales a los 18 meses de tratamiento se puede clasificar como bajo (28/400, 7,0 %); de estos ocho (8,0 %) muertes fueron en animales controles. El tumor de mayor prevalencia diagnosticado en los animales que murieron en 18 meses de tratamiento fue el adenoma de hipófisis (lesión benigna), documentado en 12 hembras (tres controles y nueve tratados con D-004: cinco [500 mg/kg], uno [1000 mg/kg] y tres [1500 mg/kg] y dos machos [control y 1000 mg/kg]). Ocurrieron en muy baja frecuencia otras lesiones neoplásicas benignas tales como fibroma de tejido celular subcutáneo, fibroadenoma de glándulas mamarias, pólipo endometrial y angioma hepático (v. tabla 5).

Entre las lesiones neoplásicas malignas observadas, la de mayor frecuencia fue el adenocarcinoma de glándulas mamarias, que fue diagnosticado en seis hembras: un control y cinco tratados (tres hembras de la dosis de 500 mg/kg, y dos de la dosis máxima). También se observó en menor frecuencia el histiocitoma maligno, el sarcoma quístico y el linfosarcoma (v. tabla 5).

DISCUSIÓN

Este constituye el primer reporte de la administración de D-004 a ratas por un período superior a los 12 meses. Durante 18 meses de tratamiento no existen evidencias de carcinogenicidad o toxicidad asociada al D-004 en ratas SD. Teniendo en cuenta que la dosis más alta evaluada (1500 mg/kg) es la dosis límite propuesta para estos estudios³⁶ y que esta dosis es mucho mayor que la mínima a la cual se observan efectos farmacológicos, debe descartarse la inadecuada selección de las dosis de D-004 empleadas como la causa de la falta de de toxicidad/carcinogenicidad aquí reportada.

Los resultados muestran que la frecuencia de mortalidad ha sido baja (8,5 %), lo que es una evidencia indirecta de que las condiciones de desarrollo del estudio han sido las adecuadas. Además corroboran la toxicidad de dosis orales repetidas por largo plazo (18 meses) del D-004, ya que no se produjeron muertes atribuibles al tratamiento, resultados que son consistentes con los obtenidos en el estudio crónico de 1 año en ratas tratadas con dosis de hasta 2000 mg/kg, y con otros estudios toxicológicos previos realizados en roedores y no roedores.^18-21

Las primeras muertes ocurrieron en animales con presencia de lesiones tumorales, en una etapa muy próxima al año de iniciado el estudio, cuando es normal que aumente la mortalidad y también comiencen a manifestarse espontáneamente lesiones neoplásicas (benignas y malignas) en esta especie y línea.^37,38

El análisis de supervivencia no mostró diferencias significativas entre los grupos, lo cual demostró que el tratamiento con D-004 no induce mortalidad temprana con respecto al grupo control. La frecuencia de lesiones tumorales resultó baja y consistente con esta especie y línea, de acuerdo con los resultados de estudios toxicológicos previos de otros autores y de los propios reportes históricos.^39-42

Así, luego de 18 meses de estudio, no se han observado signos de toxicidad atribuibles al tratamiento, incluyendo la ganancia de peso corporal y el consumo de alimentos en ambos sexos, y ningún grupo ha mostrado reducciones del peso corporal mayores o iguales al 10 % al compararlo con el grupo control, lo cual permite descartar que el D-004 afecte el peso corporal. El hecho de que el incremento en el peso corporal fuera mayor en los machos que en las hembras es consistente con resultados previos de nuestro grupo en esta especie,^40-42 y evidencia también que las condiciones del estudio han sido adecuadas.

Otras lesiones neoplásicas benignas tales como el fibroma de tejido celular subcutáneo, el fibroadenoma de glándulas mamarias, el pólipo endometrial y el angioma hepático que han sido descritas como espontáneas^37,38 ocurrieron en muy baja frecuencia. La lesión neoplásica maligna de mayor frecuencia fue el adenocarcinoma de glándulas mamarias, consistente con otros reportes.^37,38,44,45 También se observó en menor frecuencia el histiocitoma maligno, el sarcoma quístico y el linfosarcoma.

Estos hallazgos no son sorprendentes ya que el histiocitoma maligno es un tumor del tejido celular subcutáneo que aparece espontáneamente en las ratas Sprague Dawley de esta edad y ha sido reportado con una frecuencia similar a la obtenida en este estudio, entre un 0,9-5 % en machos y entre un 1,4-2 % en hembras. Igual se ha dicho para el linfosarcoma y el sarcoma indiferenciado (quístico) en las ratas SD de esta edad, los cuales han sido reportados con una frecuencia baja.^38,46

Llama la atención que no hubo tumores malignos en el grupo tratado con la dosis de 1000 mg/kg y en los machos tratados con 500 mg/kg no se observó ninguna lesión neoplásica, lo que no resultó significativo debido a la baja frecuencia ocurrida en el grupo control. En los animales tratados tampoco se observaron lesiones poco comunes en esta especie y línea. Todas las neoplasias encontradas en los animales tratados han sido descritas en esta especie y línea,^38,46 y en ningún caso su aparición ha sido asociada con la acción agentes inductores específicos.

En conclusión, los resultados obtenidos demuestran que la administración oral de D-004 (500-1500 mg/kg) a ratas SD durante 18 meses no mostró evidencias de toxicidad o carcinogenicidad temprana relacionadas con el tratamiento.

AGRADECIMIENTOS

Los autores desean agradecer la relevante participación de los técnicos Isury Bucarano, Eddy Goicochea, Nilda Mendoza y Regla Placeres, durante el trabajo experimental.

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Recibido: 24 de marzo de 2014.
Aprobado: 20 de abril de 2014

Dra. C. Ariadne Gutiérrez Martínez. Departamento de Toxicología. Centro de Productos Naturales. Centro Nacional de Investigaciones Científicas. Apartado Postal 6990, Ave 198 entre 19 y 21. Cubanacán, Playa. La Habana, Cuba. Correo electrónico: ariadne.gutierrez@cnic.edu.cu