ARTÍCULO ORIGINAL

Recuperación y diferenciación de Aeromonas con CromoCen AE y CromoCen AGN

Recovery and differentiation of Aeromonas with CromoCen AE and CromoCen AGN

Diana Rosa Viera Oramas, Claudio Rodríguez Martínez, Raisa Zhurbenko

Centro Nacional de Biopreparados (BioCen). Bejucal, Mayabeque, Cuba.

RESUMEN

Introducción: en la actualidad las especies del género Aeromonas han emergido como un problema de salud pública, son ellas los agentes etiológicos de las enfermedades diarreicas con el aumento de la atención médica por años. Los procedimientos convencionales para su diagnóstico son muy engorrosos, laboriosos y duraderos. Una nueva metodología que emplea medios de cultivo cromogénicos ha permitido la simplificación y aceleración de su diagnóstico, que ofrece resultados altamente específicos.
Objetivo: estudiar el efecto de la combinación de diferentes agentes selectivos de los microorganismos grampositivos sobre el aumento de la capacidad de recuperación, cuantificación y diferenciación de las especies de Aeromonas.
Métodos: se estudió el efecto inhibidor de la combinación de agentes selectivos (desoxicolato de sodio (0,05-0,2 g·L^-1), sales biliares (0,65 g·L^-1), verde brillante (0,025-0,03 g·L^-1), cristal violeta (0,001-0,01 g·L^-1) y sulfito de sodio (0,8 g·L^-1) sobre los microorganismos grampositivos, así como la capacidad de recuperación, cuantificación y diferenciación de las especies de Aeromonas. Como base se utilizó la formulación de CromoCen AGN, sin el desoxicolato de sodio.
Resultados: los valores de las productividades de los medios CromoCen AE y CromoCen AGN a partir del inóculo 1,5 × 10² UFC·mL^-1 resultaron, para: A. hydrophila 116,8 % y 23,9 %, A. caviae 100,8 % y 3,95 %, A. bestiarium 93,6 % y 28,8 %, A. culicicola 85,1 % y 66,12 %, A. veronii 116,7 % y 59,2 %, A. popoffi 86,56 % y 13,2 %, A. trota 94,8 % y 11,25 % y para A. eucrinophila 103,9 % y 2,80 %. La nueva composición cromogénica logró la diferenciación de los microorganismos por sus características culturales: color, forma, superficie, bordes en las colonias y proteólisis del medio circundante.
Conclusiones: la combinación de diferentes agentes selectivos para la inhibición de los microorganismos grampositivos coadyuvo el aumento de la capacidad de recuperación, cuantificación y diferenciación de las especies de Aeromonas.

Palabras clave: Aeromonas; recuperación; sustratos cromogénicos; desoxicolato de sodio; sulfito de sodio; CromoCen AE; CromoCen AGN.

ABSTRACT

Key words: Aeromonas; recovery; chromogenic substrates; sodium deoxycholate; sodium sulfite; CromoCen AE; CromoCen AGN.

Los géneros de la familia Aeromonadaceae han sido reconocidos por mucho tiempo como causantes de procesos infecciosos en peces, reptiles y anfibios.^1,2 Las especies del género Aeromonas han surgido como un problema de salud para la población mundial, por el amplio espectro de expresiones clínicas que producen entre las cuales se encuentran tales como endocarditis, septicemia, bacteriemia, meningoencefalitis, neumonía, peritonitis, infección hepatobiliar, celulitis e infección gastrointestinal.^3,4

En Cuba, las condiciones climáticas favorecen la aparición de enfermedades diarreicas agudas (EDA). Por esta razón las EDA constituyen una de las principales causas de atención médica con más de un millón de atenciones anuales.⁵ Las bacterias que ocupan los primeros lugares como agentes etiológicos de las enfermedades diarreicas son: Clostridium difficile, Escherichia coli y diferentes especies de los géneros tales como Salmonella, Shigella, Yersinia, Campylobacter, Vibrio y Aeromonas.³

Los miembros del género Aeromonas son habitantes de ecosistemas acuáticos y desempeñan un papel importante como patógenos primarios en el tracto gastrointestinal. Están constituidos por bacilos gramnegativos, oxidasa y catalasa positivos, fermentadores de glucosa y son anaerobios facultativos.⁶ Las especies más importantes de Aeromonas que causan infección en el hombre son Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae y Aeromonas veronii biotipo sobria.^2,7

El aumento de los aislamientos de estos microorganismos en los últimos años, a partir de muestras clínicas, ha conducido a la profundización en el estudio de la patogenicidad en este género. Los procedimientos convencionales para su diagnóstico son muy engorrosos y la confirmación de los resultados se demora de 7 a 10 días.⁴

Una nueva metodología que emplea medios de cultivo elaborados con sustratos cromogénicos y fluorogénicos ha permitido la simplificación y aceleración del diagnóstico de diferentes patógenos, que ofrece resultados altamente específicos.^8,9 Estos novedosos diagnosticadores cromogénicos-fluorogénicos muestran, entre sus ventajas, la posibilidad de que ocurran varias reacciones simultáneas; además de prescindir de un medio de aislamiento primario, en la mayoría de los casos; lo que significa un ahorro de tiempo, trabajo y recursos.¹⁰

El medio cromogénico CromoCen AGN permite la identificación rápida y simultánea de Aeromonas y Pseudomonas.¹¹ Sin embargo, la recuperación de diferentes especies de Aeromonas se encuentra disminuida debido a la utilización de los agentes selectivos en su composión. Es por ello que el objetivo de esta investigación consistió en estudiar el efecto de la combinación de diferentes agentes selectivos de los microorganismos grampositivos sobre el aumento de la capacidad de recuperación, cuantificación y diferenciación de las especies de Aeromonas.

MÉTODOS

MATERIAS PRIMAS

En la firma Conda (España) se adquirió el agente gelificante, el agar. Como medios controles se utilizaron el CromoCen AGN (AGN) y agar triptona soya (ATS), ambos de BioCen (Cuba). Las cepas de los microorganismos se activaron en caldo triptona soya (CTS) (BioCen, Cuba).

MATERIAL BIOLÓGICO

Para la evaluación de la capacidad nutricional y diferencial del medio CromoCen AE (AE) (BioCen, Cuba) se emplearon ocho especies de Aeromonas procedentes del cepario central del Centro Nacional de Biopreparados (BioCen): 6 de ellas clasificadas según laAmerican Type Culture Collection (ATCC) como A. hydrophila 7966, A. caviae 15468, Aeromonas bestiarum 51108, Aeromonas culicicola 3249, Aeromonas veronii 35624, Aeromonas trota 49657 y dos especies (Aeromonas eucrenophila NCIMB74 y Aeromonas popoffi LMG 17541), clasificadas según National Collections of Industrial Food and Marine Bacteria (NCIMB) y Belgian Coordinated Collections of Microorganisms/LMG Bacteria Collection (LMG), al respecto.

En el estudio de la capacidad inhibidora se empleó un total de 13 bacterias grampositivas, procedentes del cepario central de BioCen y clasificadas según ATCC de la siguiente forma: cinco de ellas concernientes al género de Staphylococcus (Staphylococcus aureus 25923 , Staphylococcus aureus 6538, Staphylococcus haemolyticus 29770, Staphylococcus xylosus 29771 y Staphylococcus saprofiticus 15305); seis correspondientes al género de Enterococcus (Enterococcus faecalis 29212, Enterococcus faecalis 19433, Enterococcus faecium 19434, Enterococcus casseliflavus 700327, Enterococcus avium 14025 y Enterococcus hirae 10541) y dos representantes del género de Streptococcus (Streptococcus pyogenes 9959 y Streptococcus agalactiae 12136).

A partir de un cultivo puro en CTS, incubado durante 24 h a 35 ± 2 °C, se prepararon las suspensiones microbianas en solución salina estéril al 0,85 % (SSE) (p/v) (NaCl, grado analítico; Merck, Alemania). La densidad microbiana se estandarizó a DO_{550 nm} a 0,125 equivalente a 1,5 × 10⁸ UFC·mL^-1, con el uso del espectrofotómetro Ultrospec 2000 (Pharmacia Biotech, Inglaterra). De esta se prepararon diluciones decimales seriadas en SSE.

ESTUDIO DE LA CAPACIDAD SELECTIVA DEL MEDIO CROMOCEN AE

Se realizó un diseño experimental donde se establecieron distintas concentraciones y combinaciones de los seis inhibidores para las bacterias grampositivas (tabla 1). Como base se utilizó la formulación de AGN,¹¹ sin el desoxicolato de sodio como inhibidor. A esta base se le adicionaron, en el momento de la preparación de las ocho variantes experimentales, las cantidades de los inhibidores objeto de este estudio de manera individual o en sus combinaciones (tabla 1). El resto del proceso de preparación de dichas variantes se realizó de igual manera como está establecido para el AGN.¹¹ La actividad inhibitoria de las nuevas composiciones se evalúo frente a las especies de los géneros Enterococcus, Streptococcus y Staphylococcus, mencionadas en el acápite “Material biológico”. En todos los casos se inocularon 0,2 mL de cada una de las diluciones decimales desde 10^-1 (1,5 × 10⁷ UFC·mL^-1) hasta 10^-5 (1,5 × 10³ UFC·mL^-1) en los medios AE, AGN y ATS, por duplicado. Los medios fueron incubados a 35 ± 2 °C por 24 h. Pasado el tiempo de incubación se observó el crecimiento de las bacterias grampositivas.

EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE RECUPERACIÓN DE LAS ESPECIES DE AEROMONAS DEL MEDIO CROMOCEN AE

La productividad de AE se determinó en comparación con los medios AGN y ATS. Se utilizaron tres diluciones correspondientes a 1,5 × 10⁴ UFC·mL^-1, 1,5 × 10³ UFC·mL^-1 y 1,5 × 10² UFC·mL^-1 para los microorganismos siguientes: A. hydrophila, A. caviae, A. bestiarum, A. culicicola A. veronii, A. popoffi, A. trota y A. eucrenophila. Cada dilución se inoculó con 0,2 mL por triplicado en cada uno de los tres medios de cultivo. Posterior se incubaron a 35 ± 2 °C por 24 h. Se realizaron los recuentos de los cultivos en todas las placas (UFC). Con ayuda del programa Excel se calculó la productividad ISO 11133-2 (2003)¹² relacionando los recuentos medios obtenidos en cada una de las diluciones en los medios AE y AGN con los recuentos de UFC obtenidos en el medios ATS en la dilución correspondiente. En último lugar se calculó la media entre las productividades obtenidas en cada dilución para cada medio y su desviación estándar.

DIFERENCIACIÓN DE LAS ESPECIES DE AEROMONAS EN EL MEDIO CROMOCEN AE

La diferenciación de las especies de Aeromonas se observó en la composición final del medio AE con la incorporación de los inhibidores definidos (desoxicolato de sodio – 0,2 g·L^-1 y el sulfito de sodio – 0,8 g·L^-1), inoculada con 0,2 mL de una suspensión microbiana de 1,5 × 10³ UFC·mL^-1. Las características diferenciales de las colonias (color, forma, superficie y bordes), así como la proteólisis del medio alrededor de la colonia se observaron de manera visual, después de incubadas las placas a 35 ± 2 °C por 24 h.

RESULTADOS

El estudio de inhibidores en el AE reflejó que las concentraciones empleadas en las variantes V₁ (0,05 g·L^-1 de desoxicolato de sodio), V₂ (0,65 g·L^-1 de sales biliares) y V₄ (verde brillante 0,025 g·L^-1), así como las combinaciones entre los agentes inhibidores en las variantes V₆ (desoxicolato de sodio y el verde brillante: 0,05 y 0,003 g·L^-1), V₇ (desoxicolato de sodio y el cristal violeta 0,05 y 0,001 g·L^-1), empleadas en la composición del medio cromogénico, no fueron suficientes para la inhibición del crecimiento de los microorganismos grampositivos, ya que se observó el desarrollo microbiano hasta la dilución 10^-5 (1,5 × 10³ UFC·mL^-1). El crecimiento de los microorganismos diana no se vio afectado en ninguna de las variantes antes mencionadas.

La composición confeccionada como V₈ (0,2 g·L^-1 de desoxicolato de sodio y 0,8 g·L^-1 de sulfito de sodio) fue efectiva para inhibir en la dilución 10^-2 (1,5 × 10⁵ UFC·mL^-1) a las bacterias grampositivas y mostró adecuadas características culturales de las colonias de las especies de Aeromonas.

Se puede plantear que la concentración combinada de 1 g·L^-1 entre los inhibidores desoxicolato de sodio y el sulfito de sodio (V₈) en el medio AE, permitió la inhibición de los microorganismos evaluados de los géneros de Enterococcus, Streptococcus y Staphylococcus en la dilución 10^-2 (1,5 × 10⁵ UFC·mL^-1).

Los valores de las productividades de los medios AE y AGN resultaron, para: A. hydrophila 116,8 % y 23,9 %, A. caviae 100,8 % y 3,95 %, A. bestiarium 93,6 % y 28,8 %, A. culicicola 85,1 % y 66,12 %, A. veronii 116,7 % y 59,2 %, A. popoffi 86,56 % y 13,2 %, A. trota 94,8 % y 11,25 % y para A. eucrinophila 103,9 % y 2,80 % (Fig.).

La nueva composición cromogénica logró la diferenciación de los microorganismos por sus características culturales (color, forma, superficie y bordes en las colonias y proteólisis del medio circundante) (tabla 2). Se identificó A. culicicola por el color violeta con centro oscuro y su forma irregular de las colonias, mientras que A. eucrinophila desarrollo colonias redondas de color violeta. A su vez, esta composición permitió la detección de A. bestiarium y A. caviae por el color naranja con centro verde grisáceo de las colonias. La aparición del color rosado con centro verde grisáceo de forma circular y superficie convexa, mostrado por las colonias de A. trota, permitió diferenciarla del resto de las especies de Aeromonas. Las especies de A. hydrophila, A. veronii y A. popoffi presentaron un color violeta claro con centro oscuro.

En el medio AGN todas las especies de Aeromonas estudiadas se tornaron de color verde azul. En los dos medios (AE y AGN), todas las especies de Aeromonas se caracterizaron por presentar un halo amplio y traslúcido alrededor de las colonias.

DISCUSIÓN

La detección e identificación temprana de este género reviste gran importancia en la microbiología clínica. Existen diferentes medios de cultivo destinados al aislamiento de Aeromonas presentes en disímiles muestras clínicas y ambientes ecológicos, que utilizan como inhibidores de la microbiota grampositiva los antibióticos, tales como el ampicillin y la vancomicina.⁹ Sin embargo, esto atenta contra la estabilidad en el tiempo de las placas listas para el uso de estos medios de cultivo.

En Cuba, en la última década, se desarrolló un diagnosticador (CromoCen AGN) con la utilización de los sustratos cromogénicos para la detección de las especies de Aeromonas tanto en muestras clínicas, como en de los alimentos.¹¹ El nuevo método con la utilización de este medio de cultivo ha sido validado en agua,¹⁴ en alimentos,¹⁰ y en muestras clínicas.¹⁰ Como resultado de estos estudios surgió la necesidad de aumentar la capacidad de recuperación y cuantificación de las aeromonas, con los estudios pormenorizados de las combinaciones de diferentes agentes selectivos de la microbiota grampositiva con los nutrientes de la formulación.

Rodríguez y colaboradores en el 2000¹¹ estudiaron el uso de desoxicolato de sodio para la inhibición de los microorganismos grampositivos en concentraciones 0,1 y 1 g·L^-1 sin afectar la capacidad del medio de diferenciar las especies de Aeromonas. Los resultados obtenidos en el actual estudio con el medio AGN (utilizado como control) demostraron que altas concentraciones de este agente selectivo (1 g·L^-1) inhiben el desarrollo de los microorganismos diana y no diana, en comparación con los recuentos obtenidos en el medio AE. Esta inhibición está dada a que el desoxicolato de sodio actúa sobre la lisis mitocondrial de las células bacterianas, e impidide su crecimiento.¹⁵ Las cantidades empleadas del desoxicolato de sodio en el medio AE entre 0,05 y 0,2 g·L^-1 resultaron ser adecuadas para el desarrollo de Aeromonas, sin embargo esas concentraciones no fueron suficiente para la inhibición de los gérmenes grampositivos.

La concentración de 0,65 g·L^-1 de sales biliares en el presente estudio no logró la inhibición del crecimiento de los microorganismos grampositivos, coincidiendo con los estudios realizados por varios autores los que utilizaron las concentraciones de este inhibidor enmarcadas entre 0,8 y 4 g·L^-1.¹⁶

La mezcla de los agentes selectivos desoxicolato de sodio (0,05 g·L^-1) y sales biliares (0,65 g·L^-1) fue efectiva para inhibir el crecimiento de los microorganismos no diana, pero impidió el crecimiento de Aeromonas, debido a que la combinación del ácido cólico y desoxicólico inhibe el desarrollo de los microorganismos grampositivos, pero tiene efecto tóxico sobre algunas bacterias gramnegativas, excepto los coliformes.¹⁷

Los estudios realizados por varios autores refieren que el efecto de inhibición del cristal violeta aumenta a medida que se eleva el pH del medio de 6 a 8 y se debe también a la formación de un complejo no iónico con las bacterias gramnegativas y grampositivas, incrementa la acción inhibitoria a medida que aumente el pH del medio y la carga negativa de las bacterias.^18,19 Estos hallazgos confirman los resultados obtenidos en el presente estudio, donde se inhibió el crecimiento de las especies de los Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus y Aeromonas en concentración de 0,01 g·L^-1 de cristal violeta.

El colorante verde brillante se utiliza como agente selectivo en medios de cultivos por su efecto bacteriostático. El modo de acción del este compuesto (derivado del trifenilmetano) no está claro, pero se cree que interviene en los procesos de oxidación celular. La acción bacteriostática del mismo se debe a la modificación del potencial de oxido-reducción del medio, lo que inhibe el desarrollo de los microorganismos. Bloquea la conversión del ácido undecaprenil-fosfato (UDP)-acetilmurámico en UDP-acetilmuramil-péptido. En general, estos derivados son más activos contra las bacterias grampositivas y algunos hongos en concentración de 0,05 g·L^-1.^20,21 A la concentración 0,025 g·L^-1, utilizada en esta investigación no se logró la inhibición deseada de los microorganismos grampositivos.

Se ha reportado que el sulfito de sodio puede ejercer una acción antimicrobiana sobre diversos mohos, levaduras y bacterias, al penetrar en la célula microbiana: ejerce una acción directa sobre el acetaldehído de la misma, y provoca una reacción de bisulfito de sodio con las enzimas bacterianas que contienen los enlaces disulfuro y la interferencia del bisulfito con los mecanismos de respiración de los microorganismos en los que intervienen el de nucleótido de nicotinamida.²² El sulfito de sodio (0,8 g·L^-1), en combinación con el desoxicolato de sodio (0,2 g·L^-1) proporcionó la inhibición de los microorganismos grampositivos en la concentración de 1,5 × 10⁶ UFC·mL^-1 y, a su vez, proporcionó una adecuada recuperación y cuantificación de las especies de Aeromonas.

Los mayores valores de productividad obtenidos en el medio AE corresponden a las especies de A. hydrophila, A. veronii y A. caviae, aisladas de forma predominante en los estudios de muestras clínicas. En Cuba los cuadros diarreicos tienen una elevada incidencia. Por otra parte, los estudios realizados por Cabrera y colaboradores en el 2007, demostraron que la mayor cantidad de los bacilos gramnegativos, oxidasa positivos, aislados de las muestras extraintestinales (hemocultivos, exudados óticos, pus de heridas, exudados conjuntivales, entre otras), pertenecieron al género Aeromonas.⁴ Los estudios relacionados con la caracterización de los de aislamientos del agua del embalse “Niña bonita” reflejaron que 78 % de los mismos correspondieron al género Aeromonas.²³

La recuperación de las especies de Aeromonas en el medio AE se debe a la combinación de bases nutritivas de varios orígenes, con los aportes de nitrógeno en diferentes fracciones proteicas, vitaminas, macro y microelementos, disponibles para el metabolismo bacteriano, en especial de Aeromonas.^24-26

La diferencia en el porcentaje de recuperación entre los medios AE y AGN se debe a la disminución de la concentración de desoxicolato de sodio de 1 g·L^-1 en el AGN hasta 0,2 g·L^-1 en el medio AE.

La diferenciación de las especies de Aeromonas entre sí se logró debido a que la nueva composición AE promueve el crecimiento profuso de las mismas por poseer las sustancias nutritivas necesarias para el metabolismo de las mismas. Por otra parte la combinación del sustrato cromogénico para la detección de actividad β-galactosidasa, presente en Aeromonas, con un sustrato (de origen proteico) para la detección de actividad proteolítica, hizo posible la diferenciación entre ellas. La presencia de proteínas lácteas en el medio y fuentes de carbono, así como de una sustancia inerte contrastante, posibilita la detección de la actividad proteolítica que permite la aparición de halos transparentes alrededor de la colonia.^8,10,27

Se ha demostrado que los sustratos cromogénicos son una herramienta potente en la identificación de microorganismos, debido a la detección de enzimas específicas producidas por los microorganismos en estudio.²⁸ Su incorporación en un medio selectivo, pueda eliminar la necesidad del subcultivo y la realización de numerosas pruebas bioquímicas, economiza tiempo y recursos. Las interacciones entre los microorganismos y las sustancias químicas, difieren y dependen de la estructura de los cromógenos usados y de las enzimas detectadas. La sustancia generada durante la reacción enzimática, se precipita sobre las células microbianas que da características cromogénicas específicas a las colonias. Se demostró, con este estudio, que la combinación de diferentes agentes selectivos de los microorganismos grampositivos coadyuvo el aumento de la capacidad de recuperación, cuantificación y diferenciación de las especies de Aeromonas.

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Recibido: 4 de noviembre de 2015. ]]> Aprobado: 6 de diciembre de 2015.

Diana Rosa Viera Oramas. Centro Nacional de Biopreparados (BioCen). Mayabeque, Cuba.
Correo electrónico: diana@biocen.cu