Estudios de genotoxicidad en trabajadores rurales y familias

Genotoxicity evaluation of rural workers and families

Natalia Gentile,^I Natalí Bernardi,^I Beatriz Bosch,^I Fernando Mañas,^II Delia Aiassa^I

^I Departamento de Ciencias Naturales. Facultad de Ciencias Exactas, Físico-químicas y Naturales. Universidad Nacional de Río Cuarto. Argentina.
^II Departamento de Clínica Animal. Facultad de Agronomía y Veterinaria. Universidad Nacional de Río Cuarto. Argentina.

RESUMEN

Introducción: el rápido desarrollo económico y las nuevas modalidades de producción han determinado cambios en las localidades rurales que influyen en la dinámica de la población, y alteran la calidad del ambiente afectándose la salud de los habitantes. En este nuevo contexto, las sustancias químicas, que son parte del producto del desarrollo, son vertidas al ambiente, contaminándose el medio y constituye un importante factor de riesgo para la salud. El monitoreo de grupos de población humana expuestos a agentes con potencial de daño sobre el organismo, tiene como propósito preservar la salud y la calidad de vida en aquellos que son de alto riesgo, debido a la naturaleza de las sustancias a que están expuestos.
Objetivo: identificar de manera precoz, los potenciales daños a la salud de individuos expuestos por razones laborales a plaguicidas y las personas con las que convive, empleándose como biomarcadores citogenéticos la frecuencia de micronúcleos en linfocitos de sangre periférica y en células de la mucosa bucal, y aberraciones cromosómicas.
Métodos: se realizaron encuestas con el fin de obtener información sobre actividad laboral y antecedentes personales. Para detectar en forma temprana los efectos biológicos de los plaguicidas antes de que causen daño en la salud, se emplearon los ensayos de aberraciones cromosómicas y micronúcleos en sangre y mucosa bucal.
Resultados: se observaron diferencias estadísticas significativas entre los dos grupos de estudiados, en los tres ensayos y una asociación entre los ensayos de Micronúcleos en sangre y mucosa bucal.
Conclusiones: los resultados permiten obtener elementos para proponer un protocolo de vigilancia que sirva como aporte a acciones futuras en salud pública. Evaluar el problema de los efectos de los agroquímicos sobre el material genético de grupos humanos expuestos lleva implícito un deber en la concienciación sobre medidas de protección personal, control y seguridad ambiental por el uso de los mismos.

Palabras clave: plaguicidas; genotoxicidad; monitoreo; biomarcadores; vigilancia sanitaria.

ABSTRACT

Key words: pesticides; genotoxicity; monitoring; biomarkers; health surveillance.

INTRODUCCIÓN

El rápido desarrollo económico y las nuevas modalidades de producción han determinado cambios en las localidades rurales que influyen en la dinámica de la población y alteran la calidad del ambiente afectándose la salud de los habitantes. En este nuevo contexto, las sustancias químicas, que son parte del producto del desarrollo, son vertidas al ambiente, contaminándose el medio y constituye un importante factor de riesgo para la salud.

La exposición potencial del ambiente a los plaguicidas puede ser estimada por medio del monitoreo ambiental, considerándose una herramienta valiosa en salud pública y ocupacional. El monitoreo de grupos de población humana expuestos a agentes con potencial para producir daño sobre el organismo tiene como objetivo preservar la salud y la calidad de vida en especial de aquellos grupos que son de alto riesgo, debido a la naturaleza de las sustancias a que están expuestos. También así a aquellos expuestos por accidente a agentes tóxicos y expuestos a agentes físicos, químicos y biológicos que en algunos casos son terapéuticos.^1-16

Los biomarcadores genéticos son empleados para evaluar exposiciones que pueden causar enfermedades, encontrar factores genéticos o adquiridos que pueden cambiar la susceptibilidad individual hacia una enfermedad y, validar los biomarcadores de efecto temprano que puedan predecir el riesgo de cáncer y ser empleados para el diseño de estrategias de intervención, prevención y promoción en la salud. Si el objetivo es hacer monitoreo de personas expuestas para evaluar daño citogenético en las células somáticas, se pueden aplicar diferentes ensayos a corto plazo:

• Intercambio de Cromátidas Hermanas.
• Aberraciones Cromosómicas (AC) en sus versiones más clásicas como la búsqueda de gaps, roturas y cromosomas dicéntricos en cultivos convencionales.
• Los Micronúcleos (MN), tanto en linfocitos, como en células epiteliales descamadas de las mucosas.
• Citogenética molecular para buscar inversiones, translocaciones, o para identificar el origen cromosómico de los micronúcleos ¹⁷ y en relación a la genética molecular.
• · El ensayo Cometa, que permite determinar el daño originado en el ADN por rupturas de cadenas (máxime de simple cadena) y sitios lábiles a álcali.

Diversos estudios en agricultores han demostrado una relación entre el tiempo de exposición a plaguicidas y un incremento en el riesgo de presentar cáncer.¹⁸ También en el mismo tipo de individuos se ha observado un impacto en sus células germinales, pues se afecta su capacidad reproductora hasta presentar esterilidad y alteraciones genéticas.¹⁹ En particular, el monitoreo de poblaciones humanas por medio del análisis de aberraciones cromosómicas, y micronúcleos (MN) tanto en cultivo de sangre periférica como en células exfoliadas del epitelio bucal, permite la detección del daño directo en el hombre provocado por los plaguicidas con la obtención rápida de resultados.

En Brasil, se realizaron el ensayo de MN en linfocitos de sangre periférica en 29 desinfectadores que manipulaban diferentes plaguicidas y 20 controles, donde también se observaron diferencias significativas entre ambos grupos.²¹

En Turquía, se utilizaron los métodos de AC, Intercambio de Cromátidas Hermanas y MN en células epiteliales bucales y observaron frecuencias aumentadas de MN, núcleos rotos, cariorrexis, cariolisis y binucleados en los 32 trabajadores estudiados sin diferencias entre mujeres y varones y con marcada diferencia entre fumadores y no fumadores.²²

En relación a Argentina los antecedentes sobre el biomonitoreo genético de trabajadores expuestos a químicos, refieren a la provincia de Buenos Aires^5,23-25 y Santa Fe.²⁶ Para la provincia de Córdoba los primeros reportes de estudios genéticos en personas y animales expuestos a solventes y a plaguicidas son los realizados por el grupo de investigación GeMA^{11,14,16,27-29,30,31} utilizándose los ensayos de AC, MN y cometa.

Por todo lo antes expuesto se plantea como objetivo de este trabajo, identificar de manera precoz los potenciales daños a la salud de individuos expuestos de forma directa (por razones laborales) a plaguicidas y las personas con las que convive, empleándose como biomarcadores citogenéticos la frecuencia de micronúcleos en linfocitos de sangre periférica y en células de la mucosa bucal, y aberraciones cromosómicas.

Se pretende obtener elementos para proponer un protocolo de vigilancia de las medidas preventivas y de vigilancia de la salud de la familia rural, que sirva como aporte a acciones futuras en salud pública, y discutir la problemática de la exposición a tóxicos ambientales/ocupacionales como factores de riesgo en la etiología de enfermedades malignas.

MÉTODOS

La población en estudio estuvo compuesta por personas de ambos sexos, entre las edades de 18 y 65 años, de la localidad de Las Vertientes, departamento Río Cuarto (33°16′58″S 64°34′41″O), provincia de Córdoba, Argentina, formada por:

• Grupo expuestos: diez grupos de personas, con un promedio de dos individuos cada uno (24 personas analizadas), que incluyó trabajadores rurales de sexo masculino con un tiempo de exposición a plaguicidas mínima de 5 años, y personas con las que convive.
]]> Grupo de referencia: formado por 24 individuos, de edad, sexo y estilo de vida similar al grupo expuesto, pero que se dedican a otras actividades.

Quedaron excluidas del estudio las personas con problemas de salud y/o expuestas a otros agentes contaminantes reconocidos.

La información escrita para el participante y acta de consentimiento informado, fueron aprobados por el Comité de Ética en Investigaciones Biomédicas del Instituto Multidisciplinario de Biología Celular (IMBICE), La Plata, Argentina; y de la Universidad Nacional de Río Cuarto, Exp. 10/13, proyecto Código 18/ C377, Resol Rec. 852/11.

En cuanto a las características, tanto del grupo expuesto a plaguicidas como del grupo referente, cada participante se sometió a una encuesta exhaustiva con el fin de obtener información, lo más detallada posible, sobre su actividad laboral y sus antecedentes personales. El objetivo de la encuesta fue detectar cualquier factor que pueda crear confusión en los resultados obtenidos.

Toma de la muestra

Las muestras de sangre periférica, tanto en individuos expuestos como en referente, fueron obtenidas por venopunción con jeringa estéril heparinizada, y las muestras epiteliales de descamación de la mucosa bucal fueron recogidas en simultáneo con la sangre friccionándose el interior de las mejillas de cada individuo con un hisopo estéril, sin tocar los dientes ni la lengua. Los meses de la toma de muestra se determinaron teniéndose en cuenta los tiempos de mayor aplicación de plaguicidas (noviembre-marzo).

Las muestras fueron procesadas de acuerdo a protocolos estandarizados detallados a continuación:

• Ensayo de aberraciones cromosómicas (AC): la sangre heparinizada se suspendió en 4 mL de medio de cultivo Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, suplementado con 20 % de suero bovino, 0,15 mL de fitohemaglutinina, 0,06 mL de penicilina y 10000 VI/mL y streptomicina 10000 µg/mL). Se expusieron los cultivos a Colchicina por 25 min antes de cumplirse las 72 h de cultivo a 37 ºC. Luego se cosecharon los cultivos y se efectuaron los extendidos cromosómicos. ³² El análisis citogenético se realizó en 100 metafases. Se analizaron roturas de una cromátida; roturas de dos cromátidas; fragmentos dicéntricos; fragmentos acéntricos; endoreduplicación. Se informaron los resultados como porcentaje de AC, lo que corresponde a número de AC por cada 100 metafases analizadas.
• Ensayo de Micronúcleos en linfocitos de sangre periférica: de la misma manera que para AC se realizaron cultivos convencionales de linfocitos en medio RPMI 1640, suero fetal bovino, y con fitohemaglutinina. Se incubaron durante 44 h a 37 ºC y se sometieron a la acción de la citocalasina-B a una concentración de 6ug/mL A las 72 h de incubación se llevó a cabo el cosechado celular, se fijaron las células y se efectuaron los extendidos.³³ Se analizaron al microscopio óptico la frecuencia de micronúcleos en 1000 células binucleadas para cada uno de los dadores, aplicándose los criterios establecidos para la selección de células binucleadas y de micronúcleos en cultivos de células humanas.³⁴
]]> Ensayo de Micronúcleos en células de la mucosa bucal: se extrajo el material utilizándose hisopos estériles, frotándose el interior de la mejilla durante 30 seg. Las muestras se resuspendieron en solución tampón (EDTA 0,1M, TRIS-HCl 0,01 M, NaCl 0,02 M, a pH 7). Se centrifugó a 800 revoluciones por minuto durante 10 min. Se aspira el sobrenadante y se desecha. Se añadió 3 mL de tampón y se resuspendio. Se goteó 50 mL en una lámina de vidrio y se deja secar al aire libre por un día. Se fijó con metanol al 80 % V/V. La tinción se realizó con Giemsa 6 % diluido en buffer Sörensen, por 6 min. Se lava con agua destilada y se deja secar al aire libre. La evaluación se realizó en 1000 células/individuo.

El análisis estadístico se realizó utilizándose el programa GraphPad Prism versión 5.02. A fin de determinar la distribución normal de los datos, se realizó el test de Kolmogorov-Smirnov. Para detectar diferencias significativas entre ambos grupos, expuestos y referentes, se realizó la prueba t-test de Student para variables que se distribuyen normalmente y el Test de Mann Whitney para variables que se distribuyen de manera asimétrica. Los demás factores de confusión, dilucidados por el cuestionario, tales como edad y años de exposición, así como la posible correlación entre los valores obtenidos con distintos ensayos, se analizaron empleándose el coeficiente de correlación de Pearson. En todos los casos, se trabajó con un nivel de significancia menor al 5 % (p < 0,05).

RESULTADOS

Las características de los individuos pertenecientes a los grupos estudiados, con respecto a la edad y años de exposición se resumen en la tabla 1. La edad media de los sujetos fue similar en ambos grupos estudiados, no encontrándose diferencias estadísticas significativas entre ellos. Se observó un rango de edad de 18 a 62 años tanto en el grupo referente, siendo el del grupo expuesto de 18 a 65 años. Los trabajadores rurales expuestos a plaguicidas tuvieron un periodo de exposición de 1 a 30 años.

Los plaguicidas más utilizados por los trabajadores rurales fueron los insecticidas clorpirifos endosulfan y cipermetrina, y los herbicidas glifosato, atrazina, y 2,4 diclorofenoxiacético. Más del 60 % de los trabajadores rurales aplican los plaguicidas en primavera-verano (noviembre a marzo) debido a las condiciones climáticas. Con respecto a las medidas de protección, el 75 % de los trabajadores rurales entrevistados, aseguraban usar algunos de los equipos de protección personal.

Las variables citogenéticas: AC (Aberraciones cromosómicas), BNMN (células binucleadas con micronúcleos) y CBMN (células bucales con micronúcleos),⁹ analizadas tanto en el grupo familiar que incluye al trabajador rural, como en el grupo referente, se resumen en la tabla 2. En todos los casos los resultados se expresan como media ± desviación estándar (DE). Cabe destacar que, en el caso de los ensayos de micronúcleos, se presentan los resultados de CBMN y BNMN porque representan parámetros más apropiados -al tener en cuenta las células que han sufrido daño. Los análisis realizados revelan un incremento estadísticamente significativo de AC, BNMN y CBMN, en el grupo de trabajadores rurales expuestos a plaguicidas y las personas con las que convive, en comparación con el grupo referente (P< 0,05). No se observaron diferencias significativas entre los dos grupos, con respecto al CBPI (índice de proliferación con bloqueo de citocinesis) (P > 0,05).

Los resultados de la correlación de Pearson no demuestran una asociación entre la edad de los trabajadores rurales y las personas que convive con las variables CBMN, BNMN y AC. Los años de exposición con respecto a CBMN, BNMN y AC, no mostraron ningún tipo de asociación estadísticamente significativa (correlación de Pearson).

DISCUSIÓN

Las observaciones en cuanto a la presencia de daño en el material genético de los individuos estudiados, coinciden con la mayoría de los estudios realizados donde se evidencia una asociación positiva entre la exposición a una mezcla compleja de plaguicidas y la presencia de AC y MN.^14,16,35 Los grupos de alto riesgo corresponden a aquellas poblaciones que incluyen los trabajadores que tienen contacto con los plaguicidas. Estudios realizados en distintos países indican aumentos significativos de la frecuencia de micronúcleos en personas expuestas a plaguicidas ^36-39 y de Aberraciones Cromosómicas^40,38 en comparación con el grupo de referencia estudiado.

Sin embargo, otros estudios no reportaron diferencias significativas en la frecuencia de micronúcleos^41,42 y Aberraciones Cromosómicas ^42,43 entre grupo expuesto a plaguicidas y no expuestos a los mismos.

Las diferencias de los resultados en los distintos estudios, pueden deberse a la edad de las personas, al polimorfismo genético individual, a las formas de aplicación, al nivel genotóxico de los compuestos, a las características de la aspersión (áreas cerradas o campo abierto) o a la interacción de algunas o todas estas situaciones.¹³

También deberían considerarse como grupo de alto riego no laboral, a las personas que viven con los trabajadores o que en ciertas épocas están sometidas a una exposición por razones de aplicaciones masivas o frecuentes, que se hacen en zonas vecinas a sus localidades de residencia o trabajo. En relación, en estudios realizados en Marcos Juárez, provincia de Córdoba, si bien no se observaron diferencias estadísticas significativas para ninguno de los grupos expuestos respecto al grupo de referencia mediante ensayo de AC, pudo observarse un ligero incremento en los valores de daño genético en aplicadores con respecto a personas dedicadas a otras actividades; y del mismo modo, tanto estos últimos como los aplicadores presentaban mayores niveles de genotoxicidad en relación a los valores de referencia.¹⁵

La falta de correlación entre la edad y tiempo de exposición con respecto a las variables analizadas podría deberse al tamaño de la muestra.

El ensayo de aberraciones cromosómicas es quizás, el de mayor importancia en cuanto a la información que permite obtener, ya que detecta daño a nivel de cromosomas, como rupturas de cromátidas o cromosomas, duplicaciones en el número de cromosomas, recombinaciones y otros rearreglos cromosómicos característicos de determinadas patologías neoplásicas.¹⁵

Sin embargo, en este trabajo se ha considerado también que el ensayo de micronúcleos, tanto en mucosa como en sangre, es una buena alternativa para evaluar la inestabilidad genética inducida por agentes genotóxicos, porque permite detectar daños en el material genético que responden a alteraciones del tipo estructural o numéricas, reduce la dificultad a la hora de realizar el recuento con relación al otro ensayo (Aberraciones Cromosómicas). Los micronúcleos solo se cuentan en células que han completado una división nuclear, por lo que se consigue mejorar la sensibilidad del ensayo, aumenta la precisión estadística de los estudios al analizar miles de células, y tiene un costo reducido.

Estos hallazgos son indicativos de la necesidad de realizar biomonitoreo con frecuencia periódica de los agricultores expuestos a varias mezclas de plaguicidas, como así también a los individuos que conviven con éstos, utilizándose ensayos de genotoxicidad. Por otra parte, ilustra la necesidad de promover pautas generales para minimizar o prevenir la exposición.

Bajo este marco, es de suma importancia implementar controles reglamentarios puntuales como los requeridos para la vigilancia sanitaria del uso de productos químicos cancerígenos en la industria, así como para establecer políticas y responsabilidades interinstitucionales para la coordinación de programas preventivos en materia de Salud Pública.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido realizado gracias al aporte de la SeCyT de la Universidad Nacional de Río Cuarto, Argentina y una beca otorgada a la Lic. Natalia Gentile por la Comisión Nacional Salud Investiga. Ministerio de Salud de la Nación Argentina.

Declaración de Conflicto de Intereses

Los autores declaran que no existe conflicto de interés relacionado con el artículo.

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Delia Aiassa. Departamento de Ciencias Naturales. Facultad de Ciencias Exactas, Físico-químicas y Naturales. Universidad Nacional de Río Cuarto.
Correo electrónico: delia.aiassa@gmail.com