Efecto del medio de soporte en la estabilidad biológica de dos cepas de Frankia aisladas de Alnus acuminata H. B. K.
The effect of the means of solid support on the biological stability of two strains of Frankia isolated from Alnus acuminata HBK
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Ana María Rey1, D. Chamorro2 y R. Barahona3
1Universidad Cooperativa de Colombia, Sede Pasto-Colombia. Centro de Investigaciones. Calle 18 N° 47-150, Colombia
2Universidad Nacional Abierta y a Distancia Medellín-Colombia
3Departamento de Producción Animal, Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín
Correo electrónico: ana.reyob@ucc.edu.co
RESUMEN
]]> Alnus acuminata H. B. K. es una especie arbórea que puede ser incorporada en sistemas silvopastoriles, ya que tiene la capacidad de crecer en suelos marginados y contribuir a la conservación de la biodiversidad y al mejoramiento del suelo; lo cual se relaciona con la incorporación de hojarasca, el efecto de sombra, la retención de humedad, el reciclaje de nutrientes y la fijación de nitrógeno atmosférico, debido a su asociación simbiótica con el actinomiceto Frankia. La utilización de este como inoculante es una tecnología que requiere un profundo análisis de su comportamiento en condiciones controladas. Por otra parte, para la comercialización de los biofertilizantes es importante conservar su calidad el mayor tiempo posible, de lo cual depende la aceptación del producto en la cadena productiva. Por ello, se realizó una investigación con el objetivo de evaluar la estabilidad biológica de las cepas nativas de Frankia (Aan17 y Aac49) con diferentes proporciones sustrato:cepa, así como el efecto del alamacenamiento a 4 °C. Las cepas fueron tolerantes a los cambios del pH y al almacenamiento en condiciones de refrigeración. Se concluye que los inoculantes se deben almacenar a 4 °C durante 120 días, con una proporción de 80:20 (inoculante:sustrato) en Aan17 y 60:40 en Aac49. En estos sustratos la proteína microbial se mantuvo por encima de 0,65 mg/mL en Aan17 y 0,7 mg/mL en Aac49.Palabras clave: Bioinoculantes, calidad, diazótrofos, fijación biológica de nitrógeno.
ABSTRACT
Alnus acuminata H. B. K. is a tree species which can be incorporated in silvopastoral systems, because it has the capacity to grow on marginal soils and contribute to the conservation of biodiversity and to soil amelioration; which is related to the incorporation of litter, effect of shade, retention of humidity, nutrient recycling and fixation of atmospheric nitrogen, due to its symbiotic association with the actinomycete Frankia. The use of Frankia as inoculant is a technology that requires a deep analysis of its performance under controlled conditions. On the other hand, for the commercialization of biofertilizers it is important to preserve their quality as long as possible, on which the acceptance of the product in the productive chain depends. For such reason, a study was conducted in order to evaluate the biological stability of the native Frankia strains (Aan17 and Aac49) with different substratum:strain proportions, as well as the effect of storage at 4 ºC. The strains were tolerant to the pH changes and the storage under refrigeration conditions. It is concluded that the inoculants should be stored at 4 ºC during 120 days, with a proportion of 80:20 (inoculant:substratum) in Aan17 and 60:40 in Aac49. In these substrata the microbial protein remained over 0,65 mg/mL in Aan17 and 0,7 mg/mL in Aac49.
Key words: Biological nitrogen fixation, bioinoculants, diazotrophs, quality.
INTRODUCCIÓN
Los productores, los gremios y las instituciones promueven e implementan la utilización de buenas prácticas en la producción ganadera para lograr un manejo sostenible y productivo de los sistemas y la certificación ecológica, así como convertir la ganadería convencional en una práctica sostenible. En los últimos años las investigaciones han demostrado la importancia del uso estratégico de los árboles en los sistemas silvopastoriles (SSP), tecnología que ha sido adoptada de forma creciente por los productores. En el trópico alto, la implementación de los SSP es una alternativa para la recuperación de praderas degradadas que permite aumentar la productividad animal con un enfoque sostenible, lo cual resulta especialmente promisorio en los sistemas de leche especializados.
En Colombia, estos sistemas representan el 5 % del hato nacional (1,2 millones de cabezas, aproximadamente) y producen 2 861 millones de litros de leche al año (alrededor de 52 % del total de leche producida). Además, generan de siete a ocho empleos por cada 100 animales y cubren un área de 4 906,344 ha (Lafaurie, 2008). En su plan estratégico de la ganadería colombiana (2019), FEDEGAN planteó que el desarrollo y la implementación de los modelos silvopastoriles constituyen una oportunidad para llevar a cabo los procesos de modernización de la ganadería colombiana.
]]> En este sentido, un SSP que puede resultar beneficioso en el trópico de altura colombiano incluye a la especie nativa Alnus acuminata H. B. K. Esta es una arbórea multipropósito que, además de suministrar sombra a las praderas y los animales, mejora las condiciones de fertilidad del suelo, lo cual se asocia a la incorporación de hojarasca, la retención de humedad, el reciclaje de nutrientes y la alta capacidad de fijación de nitrógeno atmosférico (279-400 kg de N/ha/año). Este último beneficio se debe a que su sistema radical se asocia a microsimbiontes como el actinomiceto Frankia, que induce la formación de nódulos (Bautista y Valdés, 2008; Chamorro y Rey, 2008).La inoculación de A. acuminata con cepas de Frankia como biofertilizante es una alternativa sostenible que ha mostrado respuestas positivas en variables dasométricas y de composición química. Estos efectos se relacionan no solo con la fijación de nitrógeno, sino también con la producción de ácido indolacético y la formación de asociaciones con otros microorganismos como las micorrizas, los solubilizadores de fosfato y los promotores de crecimiento vegetal (Gyaneshwar et al., 2002; Rey, 2006; Nain et al., 2010).
En Colombia, el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) es el responsable del control de los insumos agrícolas que se producen y comercializan en el territorio nacional. Debido al incremento del uso de bioinsumos, el ICA emitió la resolución No. 00375 del 27 de febrero de 2004, la cual fue sustituida por la No. 698 del 4 de febrero de 2011, en la que se establecieron los requisitos para el registro de ensayos de eficacia, así como de productores e importadores de bioinsumos de uso agrícola. Con dicha resolución se pretende armonizar las normas colombianas con las internacionales para fortalecer las condiciones de producción, importación, comercialización y utilización de los bioinsumos, lo cual aumenta la calidad, eficacia y seguridad alimentaria en beneficio de la salud humana, la inocuidad del producto, la sanidad agropecuaria y el ambiente (ICA, 2013).
Debido a la falta de información sobre la producción de un inoculante de Frankia, es necesario realizar estudios que permitan identificar la estabilidad biológica del inóculo; garantizar que el sustrato sea compatible con el crecimiento, la supervivencia y la capacidad de nodulación del microsimbionte; así como lograr que las características de almacenamiento eviten la contaminación por otros microorganismos, en correspondencia con lo dispuesto en la resolución No. 698.
Teniendo en cuenta que el soporte es uno de los factores que garantizan la calidad del inoculante, así como que existen observaciones previas sobre los beneficios asociados al uso de la turba y la cascarilla de arroz como sustratos, el objetivo de esta investigación fue evaluar la estabilidad biológica de las cepas nativas de Frankia Aac49 y Aan17, con diferentes proporciones sustrato:cepa.
MATERIALES Y MÉTODOS
La cepa Aan17 fue aislada de una población natural de A. acuminata H. B. K., perteneciente a la vereda Cubijan Alto, del municipio Pasto (departamento de Nariño, Colombia), ubicado a 3 070 msnm y con una temperatura promedio de 13,5 °C; mientras que la cepa Aac49 se aisló en una población que pertenecía a la vereda Villa Nataly, localidad de Usme, departamento de Cundinamarca, a 3 045 msnm y 12 °C.
Estas cepas se clasificaron a nivel de género, mediante pruebas bioquímicas (crecimiento en fuentes de azúcares y nitrógeno), morfológicas (formación de estructuras especializadas: esporangios, vesículas e hifas) y moleculares (a través de la amplificación de una región variable V2-V3 del gen 16S rDNA). Después se evaluaron en plantas del hospedero, de forma independiente (Rey, 2006) y en mezclas con un inóculo mixto de micorrizas (Gigaspora y Glomus sp.).
En la interacción con las micorrizas hubo una respuesta positiva; esta sinergia se evidenció en el rápido crecimiento y la mayor respuesta en las variables dasométricas y de composición química de A. acuminata durante la fase de vivero (Pintor, 2007; Chamorro y Rey, 2008). Basado en los resultados previos, estas cepas se consideraron como promisorias para la producción de inoculantes biológicos del suelo.
]]> Las cepas se conservaron en medio benzil amina purina (BAP) más glicerol (500 uL de BAP + 150 uL de glicerol al 10 %) a 4 °C. Fueron activadas y crecieron durante dos meses en medio líquido BAP –modificado por Murry et al. (1984)–, lo que permitió obtener el cultivo stock con la biomasa requerida para realizar los microensayos. La temperatura de incubación fue de 36 ºC, con una agitación constante de 150 rpm (Rey, 2006). Se realizaron tinciones en fresco con azul tripán, así como tinción de Gram con el fin de verificar la pureza de los aislamientos.Preparación del inóculo de las cepas experimentales. Se preparó un preinóculo en 500 mL de medio líquido que contenía extracto de raíz, levadura y melaza (extracto de raíz de A. acuminata, 0,1 mL/L: 50 g de raíz disuelta en 1 L de agua; 100 mL de extracto de raíz/L de medio BAP; solución stock de micronutrientes (g/L): MnCl2.4H2O 1,81 Na2MoO4 .2H2O 0,025; solución stock de vitaminas (mg/100 mL): tiamina HCL 10, piridoxina HCL 5, ácido nicotínico 50, biotina 22,5, ácido fólico 10, riboflavina 10; solución buffer KH2PO4 1 M, K2HPO4 1 M). Este se mantuvo en agitación constante (150 rpm), a 36 °C, durante cinco días. Posteriormente el preinóculo fue introducido en 1 000 mL de medio de cultivo, por cinco días, en las mismas condiciones de incubación. Asimismo, los cultivos se homogenizaron con agitador magnético y plancha mecánica hasta lograr el rompimiento de las colonias. Cuando culminó el tiempo de incubación se realizó un análisis de pureza por tinción de Gram (Murry et al., 1984; Rey, 2006).
Medio de soporte. En los ensayos se utilizó como soporte una mezcla de turba y cascarilla de arroz, con una proporción de 1:3, la cual fue molida y tamizada en una malla de 0,16 mm. Dicho soporte se esterilizó en una autoclave, a 121 °C y 15 libras de presión (por 15 min), durante tres días consecutivos (Matos y Zúñiga, 2003). De acuerdo con las características del pH inicial del soporte (5,3), se realizó la corrección a un pH cercano a 6,5, mediante la adición de CaCO3.
Condiciones de evaluación. La evaluación del inoculante se realizó en bolsas de polietileno de 70 g (100 g/bolsa), previamente esterilizadas en una autoclave, a 121 °C y 15 libras de presión, durante 30 min (Ramírez, 1992). A continuación, los sustratos fueron inoculados y para ello se utilizó una jeringuilla, según las proporciones de cada tratamiento. El periodo de maduración de los inoculantes fue de 8 días a 24 °C, para permitir la formación de estructuras de resistencia –esporas y vesículas– (Materon y Weaver, 1985). Después, las mezclas se almacenaron a 4 °C, durante 0, 30, 60, 90 y 120 días.
Diseño y tratamientos. Para determinar el efecto del soporte en la viabilidad y las estructuras especializadas de las cepas nativas de Frankia, se evaluaron proporciones turba:cascarilla y medio de cultivo:cepa; esta proporción se basó en las utilizadas para inoculantes de rizobios por Ramírez (1992). Los tratamientos se muestran en la tabla 1.
El diseño fue completamente al azar, con tres réplicas. Se utilizaron dos cepas, cada una con tres proporciones de soporte por tratamiento y cinco periodos de almacenamiento, para un total de 30 tratamientos y 90 evaluaciones.
Prueba de estabilidad biológica de los inoculantes. La estabilidad biológica se evaluó durante el almacenamiento mediante la cuantificación de la proteína microbial, según la metodología propuesta por Lowry et al. (1951) y modificada por Rey (2006).
Medición del pH del inoculante. Para medir el pH se diluyó la turba en agua destilada estéril (1:2), se sometió a agitación durante 20 minutos a 100 rpm y se dejó reposar (Estrada et al., 2009).
Cálculo del porcentaje de humedad de los inoculantes. Se realizó el secado en horno a temperatura constante de 60 °C, hasta obtener un peso constante. El cálculo se hizo mediante la diferencia entre la masa de muestra húmeda y la muestra seca multiplicada por cien (Estrada et al., 2009).
Procesamiento estadístico. Los datos se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA) y las medias se compararon mediante la dócima de Tukey para un 5 % de significación, después de verificar que cumplían con el ajuste de distribución normal y de homogeneidad de varianza. Todos los análisis se realizaron a través del programa estadístico Statistic Analysis System (SAS, 1997).
]]>RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto del medio de soporte en la sobrevivencia de las cepas de Frankia en los inoculantes
En las figuras 1 y 2 se muestra el efecto del medio de soporte en la estabilidad biológica de las cepas nativas de Frankia, durante los periodos de conservación.
La cepa Aan17 comenzó con una concentración de proteína microbial de 0,70 mg/mL, con diferencias significativas a los 30 y 90 días (fig. 1). En general, dicha concentración tendió a disminuir debido a la conservación. Esta se mantuvo en la proporción 80:20, con un valor mínimo de descenso de 0,55 mg/mL a los 60 días, el cual se incrementó a los 90 días (0,76 mg/mL).
En la cepa Aac49 hubo descensos en el crecimiento a partir de los 30 días, sin diferencias significativas en los días de almacenamiento. El valor mínimo de proteína microbial se obtuvo a los 60 días, mientras que a los 90 días se observó un aumento de esta en todas las proporciones. Si se tienen en cuenta las características de este microsimbionte, se puede suponer que el efecto se debe a la producción de estructuras especializadas, como las esporas, lo cual se corroboró a los 120 días de almacenamiento.
En el último periodo de almacenamiento se observó la presencia de esporas y esporangios como un mecanismo de reproducción y defensa a las condiciones de conservación. Los tratamientos con proporciones 70:30 y 80:20 mostraron una mayor tendencia a generar esporangios con formas diferentes. Al parecer, la menor humedad incidió en la formación de este tipo de estructuras, lo cual posiblemente esté asociado a las condiciones de estrés que se presentaron en los medios.
A partir de los 120 días de almacenamiento no hubo diferencia significativa en las concentraciones celulares de las cepas Aac49 y Aan17, por lo que se puede concluir que los inoculantes a base de estos microorganismos se comportaron de manera estable en las condiciones de almacenamiento y con las proporciones utilizadas.
Los resultados de esta investigación evidenciaron que las cepas de Frankia son tolerantes al almacenamiento en turba y refrigerado; ello se puede asociar a que estas proceden de bosques de alisos (A. acuminata) localizados en los Andes del trópico alto colombiano de Nariño y Cundinamarca, donde es común la presencia de turba y existen suelos originados por cenizas volcánicas. Además, en los sitios de recolección había una alta producción de hojarasca debido al efecto de los alisos. Asimismo, la formación de estructuras especializadas (como los esporangios) es muy importante, ya que estas actúan como un mecanismo de protección contra condiciones adversas. En los microorganismos, el efecto de las bajas temperaturas en las células produce la inactivación del crecimiento debido a la pérdida de fluidez de la membrana plasmática, lo que genera descenso en las funciones metabólicas, en el transporte de los nutrientes y en los gradientes de concentración (Sylvia et al., 2005). Por ello dicho efecto se puede tener en cuenta para el almacenamiento y la conservación de este tipo de inoculantes.
]]> A nivel internacional, los estándares de calidad de los inoculantes se han definido para bacterias fijadoras de nitrógeno, como Rhizobium, Azotobacter y Azospirillum, con recuentos mínimos de viables que van desde 5 x 107 hasta 1*109 UFC/g o mL de inoculante (Benintende, 2010). Sin embargo, no existen indicadores, tanto en Colombia como a nivel internacional, respecto a la concentración mínima efectiva de inoculantes preparados a partir de cepas de Frankia.En cepas de otros microorganismos fijadores de nitrógeno (Rhizobium, Azospirillum y Azotobacter) se han realizado estudios con el empleo de la turba como sustrato. González y Rondón (1998), al utilizar tres tipos de turba como portadores durante la producción de un inoculante basado en Azospirillum, observaron que la turba parda mantuvo la mayor viabilidad de la cepa hasta el final del periodo de evaluación (180 días).
Por su parte, Estrada (2002) evaluó el efecto de la calidad de los inoculantes almacenados a diferentes temperaturas, con la inclusión de la turba como sustrato. Este autor señaló que la temperatura de almacenamiento del inoculante incide sobre la conservación de la población de bacterias diazótroficas, y que los mejores resultados se obtienen a 19-26 °C. A 4°C, dos de las cepas estudiadas alcanzaron una conservación adecuada, por encima de 108 UFC/g de inoculante, durante los 150 días de evaluación.
En la presente investigación se evidenció que la eficiencia de la inoculación con Frankia está determinada, principalmente, por los estados tempranos de desarrollo de la planta durante las primeras semanas después de la colonización óptima de las raíces. En especies de A. acuminata se han realizado diversos estudios sobre el efecto de la inoculación a partir de nódulos macerados (Nickel et al., 2001; Ridgway et al., 2004) y de cepas que crecieron en medios de cultivo enriquecidos, métodos que solo pueden ser viables para fines investigativos. Sin embargo, en este tipo de experimentos Frankia es uno de los microorganismos menos estudiados para la producción de inoculante.
Efecto del almacenamiento en la humedad de los inoculantes
Las condiciones de almacenamiento y la temperatura (4 °C) generaron una pérdida de humedad del inoculante de 0,5 a 6 % (tabla 2).
El aislamiento Aan17 presentó pérdidas de humedad significativas, lo que se evidenció, principalmente, en las proporciones 60:40 y 80:20; mientras que la proporción 70:30 mantuvo condiciones más estables. Por otra parte, en Aac49 hubo una mayor pérdida de humedad en los tres inóculos al finalizar la evaluación.
Estrada et al. (2009) estudiaron el efecto de la temperatura de almacenamiento en la calidad de los inoculantes, con la utilización de turba como soporte sólido, en poblaciones de Azospirillum brasilense Sp245 (BR11005), Azospirillum amazonense Y2 (ATCC35120), Herbaspirillum seropedicae ZAE94 (BR11417) y Rhizobium tropici BR322 (CIAT 1988). Adicionalmente, ellos incluyeron las variables pH y humedad del inoculante hasta los 150 días de almacenamiento. Los resultados indicaron que para este tipo de fijadores de nitrógeno la temperatura ambiente entre 19 y 26 °C fue la más adecuada para realizar la conservación de los inoculantes, durante 150 días de almacenamiento.
]]> Efecto de la conservación de los inoculantes en la dinámica del pH
La dinámica del pH fue afectada durante el tiempo de almacenamiento. Se observaron diferencias significativas en todos los tratamientos, excepto en la proporción 80:20 de Aac49 (tabla 3).
El descenso del pH en los inoculantes pudo deberse a que el medio de cultivo en el que se multiplicó el inoculante contenía melaza, extracto de raíz y levadura, los cuales fueron metabolizados por las cepas para formar estructuras especializadas (esporas y esporangios) como consecuencia de la temperatura de conservación y la humedad del medio de soporte (Swan y Karalazos, 1990).
CONCLUSIONES
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Recibido el 25 de octubre de 2013
Aceptado el 17 de septiembre de 2014
