Primer estudio de Enterobacter sakazakii en alimentos en Cuba
First study on Enterobacter sakazakii in foodstuffs in Cuba
Virginia LeyvaI; Heidi RuizII; Mayrín MachínIII; René TejedorIV; Tamara K. MartinoV; Yaumara FerrerVI
ILicenciada en Bioquímica. Investigadora Auxiliar. Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos. La Habana, Cuba. ]]>
IILicenciada en Ciencias de los Alimentos. Oficina Nacional de Normalización (ONN). La Habana, Cuba.
IIILicenciada en Ciencias de los Alimentos. Aspirante a Investigadora. Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos. La Habana, Cuba.
IVDoctor en Ciencias de los Alimentos. Profesor Titular. Instituto de Farmacia y Alimentos, Universidad de La Habana. La Habana, Cuba.
VMáster en Microbiología. Agregado. Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos. La Habana, Cuba.
VITécnica A en Procesos Biológicos. Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos. La Habana, Cuba.
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RESUMEN
Introducción Enterobacter sakazakii es uno de los microorganismos patógenos emergentes que han hecho su aparición en los últimos años, fundamentalmente como contaminante ocasional de las fórmulas infantiles en polvo. En países en vías de desarrollo no existen suficientes investigaciones sobre este microorganismo, en Cuba este constituye el primer estudio realizado.
Objetivos Conocer la presencia de E. sakazakii en muestras de leche en polvo de importación.
Métodos Se analizaron 60 muestras de leche en polvo, entera y descremada, provenientes de nueve países, se siguió la técnica recomendada por autoridades reguladoras de EE.UU., con la inclusión de pruebas bioquímicas convencionales como alternativa antes de aplicar el sistema de identificación API 20E. Se empleó el agar hierro Kligler y el agar citrato de Simmons; en aquellas cepas con imagen sugestiva de Enterobacter se comprobó la obtención de triptofano a partir de indol, reacción de Voges Proskauer y rojo de metilo, descarboxilación de lisina y ornitina, dihidrólisis de la arginina, producción de ácido de sacarosa, dulcitol, adonitol, rafinosa y sorbitol.
Resultados Se obtuvo crecimiento de enterobacterias en 26 muestras. Una sola cepa dio resultado presuntivo de E. sakazakii por pruebas bioquímicas, la misma se confirmó por API 20E para 1,6 % de positividad.
Conclusiones En general la calidad microbiológica de las muestras de leche estudiadas fue buena. La técnica empleada para determinar E. sakazakii en muestras de leche en polvo, con la inclusión de pruebas bioquímicas convencionales, es factible de realizar en Cuba, para minimizar los costos asociados a la utilización de API 20E. Sería importante continuar estos estudios en áreas hospitalarias, especialmente aquellas donde se preparan fórmulas lácteas para recién nacidos. ]]>
Palabras clave: Enterobacter sakazakii, enterobacterias, leche en polvo, Cuba.
ABSTRACT
Introduction Enterobacter sakazakii is an emerging pathogen that has been isolated in milk powder preparations for infant in the last few years. Practically there is no research works about this microorganism in developing countries; in Cuba this is the first study.
Objectives To detect the presence of E. sakazakii in imported milk powder samples.
Methods Sixty samples of whole and skimmed powdered milk imported from 9 countries were analyzed. Before applying API 20E Kit, the recommended technique by US regulatory bodies including conventional biochemical tests was used. Kligler´s iron agar and Simmons´s citrate agar were employed; other tests such as obtaining of triptophane from indole, Voges Proskauer reaction, methyl red, lysine and ornitine decarboxylation, arginine dihydrolysis, production of sucrose acid, dulcit, adonit, raffinose and sorbitol were performed in presumptive Enterobacter strains.
Results Enterobacteria were isolated in 26 samples. Just one strain was classified as E. sakasakii using the traditional biochemical tests and further confirmed by API 20E for 1.6 % possitivity of the sample.
Conclusions Generally speaking, the microbiological quality of powered milk samples was good. The technique used to determine E. sakazakii in powered milk samples, including conventional biochemical tests, is feasible to be performed in Cuba in order to reduce costs inherent to the use of API 20E. It is important to conduct these studies in hospital settings, particularly in those areas where milk formulae for neonates are prepared. ]]>
Key words: Enterobacter sakazakii, enterobacteria, powdered milk, Cuba.
INTRODUCCIÓN
En los últimos años la frecuencia y el número de casos y brotes de Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETAs) se han incrementado notablemente.1 Una nueva bacteria denominada Enterobacter sakazakii, se ha aislado en casos esporádicos y brotes epidémicos.2 Aunque esta bacteria ha causado enfermedades en todos los grupos de edades, está bien reconocido, en la actualidad, que los neonatos y los lactantes son un grupo con un riesgo particular.3
E. sakazakii es uno de los gérmenes oportunistas que actualmente ocupa la atención del personal de salud, y empresas elaboradoras de productos lácteos desecados, por su vinculación a procesos infecciosos invasivos, con alta tasa de morbilidad y mortalidad y que dejan en algunos casos, importantes secuelas neurológicas teniendo la particularidad de estar relacionado directamente al consumo de fórmulas a base de leche en polvo, preparadas para niños lactantes.4 Parece tener una predisposición para infectar al sistema nervioso central, ha sido asociado con una variedad de enfermedades severas tales como sepsis generalizadas, meningitis, cerebritis, y enterocolitis necrosante.5 ]]>
Aunque no está claro si la fórmula en polvo para lactantes es la única fuente de infección por E. sakazakii en lactantes, la OMS advirtió sobre el riesgo de infecciones en bebés a causa de la posible presencia de la bacteria en leches maternizadas.5 En Cuba se preconiza la lactancia materna, sin embrago se conoce que existen madres que utilizan las fórmulas infantiles a base de leche en polvo o leche fresca reconstituida pasteurizada, la cual incluye entre sus ingredientes la leche en polvo. Según Linnecar,6 en países en vías de desarrollo, no existen suficientes datos sobre investigaciones realizadas de E. sakazakii; en Cuba este estudio constituye el primero realizado sobre este microorganismo en alimentos.Dado los antecedentes expuestos, y teniendo en cuenta el riesgo para la salud que puede representar la presencia de esta bacteria, se propone como objetivo del trabajo, evaluar la presencia de E. sakazakii en leches en polvo de importación.
MÉTODOS
Muestras analizadas
Se analizaron 60 muestras de leche en polvo procedentes de nueve países, 42 muestras correspondieron a leche entera y las restantes a leche descremada en polvo.
Método de detección
Se utilizó la técnica de presencia/ausencia recomendada por Heuvelink y otros, pero sustituyendo el agua de peptona buferada por agua destilada estéril en el medio de preenriquecimiento, según lo sugerido por la FDA-CFSAN,7 y tomando un inóculo de 100 g de la muestra en 900 mL de agua destilada estéril. Se incluyeron, además, pruebas bioquímicas convencionales, antes de confirmar las cepas aisladas por el sistema de indentificación API 20E. ]]>
Desarrollo del métodoEl medio de preenriquecimiento se incubó a 37 ºC de 18 a 24 h. A continuación se sembraron 10 mL de este medio en caldo EE (medio de enriquecimiento), y se incubó a 37 ºC de 18 a 24 h. El aislamiento a partir del caldo EE se obtuvo, por duplicado, en placas de agar rojo violeta bilis con glucosa (VRBG), por siembra en superficie, por estría, de 10µL con asa calibrada de 3mm, las mismas se incubaron a 37 ºC de 18 a 24 h. Se seleccionaron al menos 5 colonias de color rojo púrpura de las placas de VRBG, y se pasó cada una a medio agar hierro Kligler y a agar citrato de Simmons, la incubación se realizó a 37 ºC de 18 a 24 h para el primero y hasta 5 días para el segundo.
Seguidamente se comprobó la producción de pigmento amarillo en placas de agar triptona soya (ATS) que se incubaron a 25ºC de 48 a 72 h y luego se realizó la prueba de la oxidasa.
Las pruebas bioquímicas convencionales incluidas para la identificación de la especie fueron: obtención de triptofano a partir de indol (I), reacción de Voges Proskauer (VP) y de rojo de metilo (RM), descarboxilación de ornitina y lisina, dihidrólisis de arginina, producción de ácido de sacarosa (Sac), dulcitol (Dulc), adonitol (Adon), rafinosa (Raf) y sorbitol (Sorb). A aquellas cepas presuntivas de E. sakazakii se le realizó la identificación por API 20E.8
RESULTADOS
Como se aprecia en la tabla 1, en 26 de las muestras analizadas, se obtuvo crecimiento de colonias fermentadoras de glucosa en agar VRBG, presuntivas Enterobacteriaceae. De agar hierro Kligler se seleccionaron las cepas que ofrecieron una imagen caracterizada por producción de ácido y gas de glucosa y lactosa sin producción de sulfhídrico. A aquellas que utilizaron el citrato y que crecieron con pigmentación amarilla en ATS, se les realizó la prueba de la oxidasa, acorde a lo establecido en la metodología empleada,8 en todos los casos dio resultados negativos.
Los resultados de las pruebas bioquímicas convencionales realizadas para la identificación de la especie,8 aparecen en la tabla 2. Sólo la cepa, cuyos resultados se encuentran resaltados en dicha tabla, pudo clasificar como E. sakazakii, lo que fue confirmado, también, por el API 20E. El código obtenido fue 3305173. ]]>
DISCUSIÓN
El 56,7 % de las muestras analizadas fue negativa a Enterobacteriaceae, lo cual es un aval a favor de la buena calidad microbiológica de las muestras estudiadas para este indicador.
En la identificación presuntiva de las cepas aisladas, se adicionó la utilización del medio Kligler al método empleado,7 ya que se conoce que las especies correspondientes al género Enterobacter, pertenecen al grupo coliformes, indicador empleado para evaluar la calidad sanitaria de los alimentos.9 A las cepas con imagen sugestiva de coliformes se les realizó, también la prueba de citrato pues el 99 % de las cepas de E. sakazakii son capaces de emplearlo como única fuente de carbono.8
El método original, propone realizar directamente la siembra en ATS a partir de las colonias seleccionadas en agar VRBG.7 La pigmentación amarilla en ATS es típica de E. sakazakii, aunque Farmer y Kelly,8 señalan que el 75 % de las cepas de Enterobacter agglomerans también pueden desarrollar este pigmento, aunque su respuesta a la prueba del citrato es positiva en el 50 %, de ahí que se requieren pruebas adicionales para la confirmación definitiva.
A las cepas obtenidas con pigmento amarillo, correspondientes a 12 muestras (tabla 1), se le realizó la prueba de la oxidasa, que permitió confirmar la condición de Enterobacteriaceae pues todos los miembros de esta familia son oxidasa negativa.10
La técnica empleada para la determinación de E. sakazakii en muestras de leche en polvo, es factible de realizar en Cuba, con la inclusión de pruebas bioquímicas convencionales, para minimizar los costos asociados a la utilización del sistema de identificación API 20E. La confirmación de la especie demostró que sólo el 1,7 % de las muestras analizadas resultó positiva a E. sakazakii, este porcentaje se encuentra por debajo de lo informado por otros investigadores.11-13 ]]>
Desde la década de los 80 del siglo xx hasta la fecha se han ensayado diferentes medios de cultivo para el aislamiento de E. sakazakii, tanto de muestras clínicas como de alimentos, ya que existe preocupación por parte de los investigadores por la sensibilidad de los métodos utilizados.14-16 Se sugiere que la dificultad para el aislamiento de este microorganismo del producto deshidratado, podría deberse a su distribución desigual en el producto o a la baja concentración existente, por lo que pudiera no ser detectado por los métodos convencionales.15En el estudio de un brote de meningitis neonatal, ocurrido en Islandia entre 1986 y 1987, se aisló E. sakazakii en 5 de 7 lotes diferentes de fórmula infantil para lactantes en envases cerrados. En este caso se utilizó la cantidad de agua estéril recomendada por el fabricante para 500 y 1 000 g de la fórmula y se dividió la suspensión en porciones de 100 mL. Posteriormente, se incubó la muestra 4 h a 37 ºC, y se realizaron aislamientos en placas de agar sangre y agar MacConkey. No se realizaron estudios cuantitativos. Los aislamientos se confirmaron por el sistema API 20E, seguido por biotipificación, determinación del perfil plasmídico y antibiograma.17
En 1989 se utilizó un método similar para el aislamiento de E. sakazakii en fórmulas de leche en polvo asociadas con un brote, en una unidad de cuidados intensivos localizada en Tennesse, Memphis.18 En este estudio se utilizaron inóculos de 50, 10 y 1 g de las muestras de la fórmula infantil implicada que se disolvieron en 450, 90 y 9 mL de agua peptonada buferada respectivamente. Las colonias sospechosas en agar MacConkey, se confirmaron por el sistema API 20E; el nivel de E. sakazakii obtenido en las muestras fue un estimado de 8 UFC/g.
En Canadá, Nazarowec-White y Farber,11 emplearon el método de Muytjens y otros,15 en fórmulas infantiles, con una pequeña modificación. El polvo fue suspendido en agua estéril. La sensibilidad de este método fue la misma que la del método original. E. sakazakii se aisló en 8 de 120 envases con un nivel de 0,36 UFC/100 g.
E. sakazakii se aisló también en un estudio de brote,12 sembrando directamente la fórmula láctea líquida en placas de ATS suplementadas con 5 % de sangre de carnero y en agar MacConkey. Los resultados del control de la calidad de la fábrica, para el lote de la producción implicada de la fórmula de leche deshidratada fueron que de 5 sub-muestras, 1 contenía 20 colonias de coliformes/g y las 4 sub-unidades restantes contenían menos de 1 coliforme/g.
Estos resultados avalan la hipótesis de la distribución heterógenea de la microbiota en este tipo de muestra. Por lo que Van Acker y otros,12 señalan que si la distribución es heterogénea (específicamente la de E. sakazakii) en los lotes de la fórmula en polvo; es sumamente importante analizar sub-muestras para incrementar la probabilidad de aceptabilidad correcta del lote.
Forsythe13 halló E. sakazakii en 4 de 102 muestras de fórmulas infantiles a base de leche en polvo, en 5 de 49 alimentos para consumo infantil en polvo, en 3 de 72 muestras de leche deshidratada, en 2 de 62 muestras de quesos y en 40 de 122 alimentos deshidratados varios. Al comparar el método convencional de la FDA,7 con el uso de un nuevo medio cromogénico, agar Druggan-Forsythe-Iversen (DFI), el cual distingue E. sakazakii de especies estrechamente relacionadas, se apreció que el segundo ofrecía mejores resultados y con dos días de antelación que el método convencional. E. sakazakii fue aislado de 69 muestras usando el medio DFI, y por el método convencional sólo se aislaron en 19 muestras, esta gran diferencia se obtuvo principalmente en los productos deshidratados varios.13
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en todos estos trabajos, en los cuales se han utilizado diferentes métodos de ensayo, con variaciones en los medios e inóculos así como los tipos de muestras analizadas; el bajo aislamiento encontrado en el presente estudio (1,7 %) puede deberse a varias causas, entre ellas, (1) el inóculo inicial de la muestra; (2) la selectividad del medio utilizado para el aislamiento y (3) las propias características de las muestras investigadas, que no necesariamente tenían que estar contaminadas con E. sakazakii.
Sólo en pocos países desarrollados se han encontrado casos de ETAs por E. sakazakii. Es probable que en todos los países exista una cantidad importante de ETAs por este patógeno que no son informadas o reconocidas. La ausencia de informes se debe probablemente más a la carencia de conocimiento del problema, que a la ausencia de la enfermad. En general, las limitaciones de los actuales sistemas de vigilancia en la mayoría de los países se suman a la explicación de la carencia de casos divulgados.19
En Cuba no existen informes clínicos publicados sobre esta bacteria, por lo que sería importante continuar estos estudios en áreas hospitalarias, especialmente aquellas relacionadas con la preparación de fórmulas lácteas para recién nacidos, así como en la investigación de las enfermedades neonatales. ]]>
Agradecimientos
Los autores agradecen expresamente al Laboratorio de Cuba Control, por todo el apoyo ofrecido para la realización de este trabajo.
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Recibido: 10 de septiembre de 2007.
Aprobado: 27 de mayo de 2008.
Virginia Leyva. Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos. Dpto. Microbiología de los Alimentos. Infanta 1158 e/ Llinás y Clavel. Centro Habana. La Habana, Cuba.
Teléf.: 8-700911. E mail: virginia.leyva@infomed.sld.cu ]]>
