Oriela Pino Pérez, Fanny Jorge Lazo
Grupo de Plagas Agrícolas, Dirección de Protección de Plantas, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA). Carretera Jamaica y Autopista Nacional, Apartado 10, San José de las Lajas, La Habana, Cuba. Correo electrónico: oriela@censa.edu.cu
RESUMEN ]]>
Este artículo pretende divulgar entre los investigadores de nuestro país las nociones fundamentales relacionadas con el bioensayo de artemia (Artemia spp.). Se recogen los aspectos biológicos generales de este organismo, las distintas variantes experimentales del ensayo y sus posibles aplicaciones, así como las ventajas y desventajas de esta prueba. Se exponen ejemplos de los avances logrados con su utilización, promoviendo su uso entre ecotoxicólogos y químicos de productos naturales, fundamentalmente en el campo del descubrimiento y desarrollo de nuevos plaguicidas de origen natural.Palabras clave: Artemia; bioensayo; productos naturales
ABSTRACT
This paper is aimed at divulging the fundamental notions related to the brine shrimp (Artemia spp.) bioassay among the researchers of our country. General biological characteristics of this organism, different experimental variants of the bioassay and their applications, as well as their advantages and disadvantages are summarized. Several examples about the advances achieved with the application of this bioassay are included promoting its use by ecolotoxicologists and specialists of natural products, mainly those concerned with the discovery and development of new natural pesticides.
Key words: Artemia; brine shrimp; bioassay; natural products
INTRODUCCIÓN
El desarrollo de la agricultura moderna se debe en gran parte, a la aparición y uso de plaguicidas sintéticos para reducir las pérdidas que las plagas causan a los cultivos. Desde los años 50 a los 90, se produjo la expansión de los productos fitosanitarios de síntesis (clorados, carbamatos, fosforados y otros) con acción sobre las principales entidades que resultaban perjudiciales al agricultor: insecticidas, acaricidas, fungicidas, bactericidas, herbicidas, entre otros. Sin embargo, a largo plazo, su uso ininterrumpido y masivo ha producido graves problemas: aparición de resistencia, presencia de residuos en las cosechas, contaminación del medio ambiente y ruptura de equilibrios naturales. Las plagas continúan evolucionando, convirtiéndose en resistentes a los plaguicidas disponibles, por lo que existe una necesidad constante de desarrollo de nuevos productos para la protección de plantas (1). ]]>
En la búsqueda de soluciones alternativas a estos problemas en los últimos años ha resurgido el interés en las plantas y su quimio-biodiversidad como rica fuente de productos bioactivos para el desarrollo de nuevos productos fitosanitarios. Las moléculas deben conjugar una mayor selectividad hacia las plagas, actividad contra las que han desarrollado resistencia (nuevos modos de acción) y menor impacto sobre los ecosistemas. Universidades, institutos de investigación y compañías de agroquímicos están prestando especial importancia al estudio de productos naturales, en respuesta al creciente interés en el descubrimiento de nuevos productos para el desarrollo de una agricultura sostenible y amigable con el medio ambiente (2).La necesidad de sustituir los métodos de lucha contra plagas basados en los plaguicidas convencionales, parece evidente por motivos medioambientales y esta necesidad de cambio está determinando la investigación actual en el campo agroquímico. Además de los aspectos medioambientales, otros factores favorecen el retorno al estudio de fuentes naturales como origen de nuevos plaguicidas. Entre ellos figura el gran desarrollo actual de las técnicas de aislamiento y determinación de estructuras químicas, pues trabajos que hace años hubieran requerido mucho tiempo, hoy en día se puedan realizar con rapidez.
La otra tecnología de vital importancia para el descubrimiento y desarrollo de nuevos productos de origen natural son los ensayos biológicos (3). En la última década, se han incorporado algunos ensayos de gran utilidad y eficacia que requieren pequeñas cantidades de muestras y permiten la evaluación rápida de extractos crudos y fracciones, conduciendo con seguridad a los principios activos y descartando todo lo que no sea de interés. Hay que indicar claramente la diferencia entre un estudio de productos naturales convencional, cuyo objetivo es el conocimiento de los componentes químicos de una planta, y la búsqueda de nuevos productos bioactivos que depende siempre de los ensayos biológicos que guían el fraccionamiento y el aislamiento final (3, 4, 5). En muchas ocasiones, el factor clave que ha impedido el descubrimiento rápido de nuevos constituyentes bioactivos ha sido el uso insuficiente e inadecuado de la tecnología del bioensayo (3, 4).
En los últimos años, el objetivo de muchos laboratorios relacionados con el estudio de productos naturales ha sido desarrollar y utilizar nuevos procedimientos de bioensayos; tratando de fomentar métodos baratos y fáciles de utilizar, sin la necesidad de cooperación de otros grupos de investigación (3, 4, 6, 7). Cada investigador realiza sus propios bioensayos de manera rápida, reproducible y obtiene resultados confiables estadísticamente. De esta manera, son detectados y aislados con rapidez compuestos bioactivos novedosos a través del cribado y fraccionamiento biodirigido de los extractos vegetales. El objetivo principal de la investigación no es solamente aislar moléculas con estructuras novedosas, sino aislar nuevos compuestos bioactivos que tengan aplicaciones potenciales o puedan servir como compuestos guías para las modificaciones sintéticas (3, 8).
Un lugar sobresaliente dentro del grupo de bioensayos más utilizados lo ocupa el ensayo de Artemia spp. Este es un ensayo general de amplio uso que determina el efecto letal de los materiales en larvas de Artemia spp., y de esta manera se predice su habilidad para producir la muerte de células cancerígenas en cultivo de tejidos, matar insectos y/o ejercer un amplio rango de efectos farmacológicos (3, 4, 5). Este artículo reseña pretende divulgar entre los investigadores de nuestro país, los aspectos fundamentales relacionados con el desarrollo histórico de este ensayo, sus distintas variantes experimentales y posibles aplicaciones, promoviendo su uso entre ecotoxicólogos y químicos de productos naturales.
PARTE ESPECIAL
Aspectos biológicos generales y significado práctico
Artemia spp. son camarones minúsculos de cuerpo blando, de color carmelita y transparentes a la luz; pertenecen al Phylum Arthropoda, clase Crustaceae, subclase Branchiopoda. Se conocen comúnmente por el nombre de artemia, también llamados "monos de mar" o "brine shrimp" en inglés (9). El género Artemia está compuesto por varias especies, de las cuales se han identificado al menos cinco especies bisexuales y varias poblaciones partenogenéticas, entre ellas Artemia salina Leach, Artemia persimilis Piccinelli y Prosdocimi, Artemia franciscana Kellogg (bisexuales) y Artemia partenogenetica Bowen y Sterling (10, 11). ]]>
Estas especies se encuentran distribuidas en todo el mundo en aguas de elevada salinidad, pueden crecer a temperaturas entre 6 y 35ºC. Se alimentan de algas y bacterias y son fuente de alimento para peces, pájaros y varios invertebrados. Las hembras producen huevos que, en condiciones externas favorables, eclosionan produciendo larvas de un tamaño aproximado de 1 mm. Los huevos también pueden formar quistes y permanecer en esta forma por un año o más. Las artemias se convierten en adultos transcurridas 6 a 8 semanas, alcanzando un tamaño promedio de 7mm.Artemia es hasta la fecha el único género animal en todo el mundo cuyo estado criptobiótico (quistes) está disponible comercialmente de manera continua, como fuente de alimentos para peces y crustáceos en acuicultura. Esto ha constituido un elemento clave en su utilización en ensayos biológicos (12). Por razones prácticas, las especies con un estado criptobiótico, durante su ciclo de vida son más adecuadas para el desarrollo de un bioensayo estándar. La disponibilidad permanente de huevos (quistes) a partir de los cuales pueden ser obtenidas las larvas ofrece las siguientes ventajas:
- no hay necesidad de mantener una colonia viva permanentemente,
- las pruebas pueden realizarse dónde y cuándo sea necesario,
- se dispone siempre de un número suficiente de individuos de la misma edad y condición fisiológica.
Aplicaciones y comparación con otros ensayos biológicos
Las larvas de Artemia spp. se han utilizado por más de 40 años en estudios toxicológicos y ecotoxicológicos (7, 12) y se ha estudiado su biología y usos potenciales en diversos campos como un método práctico y económico para la determinación de bioactividad de compuestos sintéticos y productos naturales (3, 13, 14, 15, 16, 17).
Prueba ecotoxicológica para el ambiente marino
Para la protección del ambiente marino, son necesarios métodos de ensayos ecotoxicológicos simples y confiables para determinar el impacto potencial sobre la biota marina de sustancias xenobióticas (7). Además, la implementación correcta de medidas regulatorias, tanto en el ámbito nacional como internacional, requiere que los métodos toxicológicos usados sean confiables y reproducibles (12, 18).
En 1984, Vanhaecke et al. (12) del Centro de Referencia de artemia en Bélgica, después de un estudio extensivo de la literatura científica relacionada con el uso de este organismo en investigaciones sobre la contaminación ambiental, desarrollaron un ensayo estándar de toxicidad aguda (a corto plazo), conocido como ARC-TEST o ensayo del Centro de Referencia de Artemia. Este ensayo está basado en la determinación de la LC50 a las 24 horas de las larvas (instares II-III) de una cepa específica de Artemia sp. El procedimiento fue sometido a un estudio colaborativo que involucró centros de investigación en Europa y América para determinar el grado de estandarización del protocolo experimental propuesto. Al comparar los resultados de este estudio con los obtenidos utilizando los organismos diana de uso común en pruebas toxicológicas, se determinó que la repetibilidad y reproducibilidad son al menos iguales que las de una prueba a corto plazo usando Daphnia spp. y aproximadas en algunos casos a los valores obtenidos utilizando Brachydanio spp. Aunque la prueba de artemia fue nueva para las dos terceras partes de los 70 laboratorios participantes, todos reconocieron que esta requiere poca experiencia y no consume mucho tiempo, aunque la sensibilidad del ensayo fue relativamente baja, resultado que relacionan con la cepa y los compuestos de referencia utilizados en este estudio. Los autores concluyeron que este bioensayo es un valioso instrumento como prueba en una primera evaluación para categorizar la toxicidad de productos químicos y como prueba de referencia para el ambiente marino. ]]>
Evaluación biológica de productos naturales: extractos crudos, fracciones y compuestos purosArtemia es también útil para predecir actividades plaguicidas y farmacológicas, responde a un amplio rango de compuestos química y farmacoló-gicamente diversos; es por ello que resulta tan importante su aplicación en programas de descubrimiento y desarrollo de nuevos plaguicidas y medicamentos de origen natural (3, 4, 5, 19, 20). Además, el ensayo permite la evaluación rápida de las relaciones estructura-actividad y son fácilmente observables las interacciones entre compuestos (21).
En 1982, Meyer et al. (13), fueron los primeros en introducir el uso de las larvas de Artemia spp. en sustitución de animales superiores en la evaluación de extractos vegetales para el descubrimiento de compuestos con actividad antitumoral y citotóxica. Este ensayo se utiliza para la pre-evaluación de extractos vegetales en el descubrimiento de compuestos antitumorales (17). Inicialmente, se determinó que existe una correlación positiva entre la mortalidad de las larvas de artemia y la citotoxicidad frente a las células 9KB (carcinoma nasofaríngeo humano) y la línea celular 3PS(P388) (leucemia in vivo) (3). En general, los valores de ED50 para las citotoxicidades son aproximadamente una décima parte de los valores de LC50 encontrados en los ensayos con Artemia spp. En el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Pardue Cancer Center se utilizó el ensayo de artemia para la evaluación inicial de seis líneas celulares de tumores humanos. De este modo, es posible detectar y entonces monitorear el fraccionamiento de extractos con actividad citotóxica, utilizando el ensayo de mortalidad de larvas más que otros ensayos antitumorales in vivo o in vitro que resultan más tediosos y costosos. En este centro se han descubierto hasta el momento más de 300 compuestos antitumorales y plaguicidas utilizando este bioensayo en la pre-evaluación (1).
La actividad detectada a través del ensayo de artemia es un indicador de la toxicidad frente a plagas de insectos. Mawardi et al. (19) comprobaron la correspondencia entre el efecto frente a las larvas de artemia del extracto crudo de Glycosmis pentaphylla (Retz.) Correa y un alcaloide activo aislado como resultado de su fraccionamiento biodirigido, y la actividad inhibidora del crecimiento de ambas sustancias frente a la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster Meigen). Otros investigadores, encontraron correspondencia entre los altos niveles de actividad frente a artemia de coumarinas y cromonas presentes en un extracto de Flourensia thurifera (Mol.) D.C. y la actividad antialimentaria del mismo frente a Spodoptera littoralis Boisduval (22).
El ensayo de artemia resultó preponderante en el descubrimiento de una nueva clase de compuestos conocidos como acetogeninas, reconocidas por sus efectos biológicos diversos (23). En los años 80, investigaciones detalladas condujeron al aislamiento de un número elevado de estos derivados de ácidos grasos de cadena larga, con actividad insecticida. Estas sustancias son venenos estomacales de acción lenta, particularmente efectivos frente a insectos tales como lepidópteros y Leptinotarsa decemlineata Say (23, 24). Leatemia e Isman (25, 26) demostraron recientemente que extractos etanólicos y acuosos de semillas de Annona squamosa L. son efectivos frente a Plutella xylostella L. Un buen número de estos compuestos, tales como asimacina y annonacina, que demostraron una actividad citotóxica potente en el ensayo de artemia (valores de LC50 entre 0,002 y 33 mg. mL-1) poseen un futuro comercial muy promisorio como plaguicidas. Existen patentes obtenidas por investigadores estadounidenses sobre insecticidas basados en acetogeninas provenientes de Asimina triloba Dunal (27) y otra patente similar obtenida por Bayer AG (Alemania) basada también en este tipo de compuestos pero a partir de otras especies vegetales pertenecientes al género Annona (28). McLaughlin et al. (29) han aislado cientos de acetogeninas a partir de las Anonáceas, y muchas de ellas poseen potencial no solo como plaguicidas sino también como agentes anticancerígenos.
Otra aplicación potencial del ensayo de artemia, se relaciona con las ventajas especiales que ofrecen los bioensayos en la estandarización y control de la calidad de productos botánicos heterogéneos (3). Tales productos pueden ser "heterogéneos" debido a la presencia de mezclas de compuestos bioactivos provenientes de la misma fuente botánica o pueden ser mezclas preparadas a propósito. La respuesta biológica deseada con frecuencia no se debe a un solo compuesto activo sino a una mezcla de ellos, y las proporciones relativas de los compuestos bioactivos individuales pueden variar de un lote a otro mientras que la actividad biológica permanece dentro de los límites tolerables. Por lo tanto, el análisis físico o químico de un componente individual en tales mezclas no es completamente satisfactorio. Para lograr la estandarización y control de la calidad de las materias primas, procesos y productos deben emplearse de forma armonizada los ensayos biológicos y los métodos físico-analíticos, tales como cromatografía, para lograr la sensibilidad requerida frente a las complejidades químicas encontradas en los productos naturales. La estandarización de los productos, empleando este análisis integral químico y biológico de los componentes bioactivos, contribuirá a una aceptación más generalizada de los productos botánicos heterogéneos y generará beneficios pues resultará en la confianza del consumidor.
Comparación del ensayo de artemia con otros ensayos biológicos utilizados en la investigación y desarrollo de productos naturales bioactivos
En general, todos los sistemas de ensayos biológicos usados en la investigación de nuevos agroquímicos a partir de productos naturales poseen aspectos positivos y negativos. Cada equipo de investigación debe realizar la selección de cuál o cuáles utilizará en correspondencia con los objetivos propios de cada proyecto de investigación, número de muestras a evaluar y cantidad disponible de cada una de ellas, infraestructura y recursos existentes, preparación técnica del personal requerida, entre otros.
En los últimos años se ha incrementado el uso de bioensayos muy específicos, computarizados, in vitro basados en los mecanismos de acción. Estos bioensayos simulan los efectos de algunos compuestos previamente conocidos que poseen un mecanismo de acción específico. Muchas compañías químicas multinacionales utilizan una batería de bioensayos "in vitro" o incluso pruebas biológicas sin células, que se centran en la actividad sobre enzimas específicas, receptores o rutas bioquímicas. Mientras que tales pruebas biológicas requieren cantidades bajas de material y se logran altos rendimiento de procesamiento "throughput", no existe una correspondencia confiable con la eficacia bajo condiciones reales (en campo). Por otro lado, los investigadores deben ser muy cuidadosos con los ensayos biológicos basados en mecanismo de acción, pues deben asegurar que el alcance de estos sea lo suficientemente amplio para incluir mecanismos desconocidos y diversos, así como nuevas entidades químicas. Además, en estos bioensayos específicos los extractos deben ser analizados muchas veces antes de detectar actividades. Es más recomendable realizar una preevaluación utilizando ensayos generales, desechar los negativos, y utilizar los ensayos específicos con los activos.
Si se trata de ensayos in vivo y el propósito de la investigación es descubrir nuevos plaguicidas, ha habido mucha discusión en cuanto al organismo más apropiado para el bioensayo. Algunos investigadores han utilizado las larvas de mosquito (generalmente Aedes aegypti L.) como organismo de prueba (3). Si el propósito de la investigación es el desarrollo de un producto contra el mosquito, el mérito de esta prueba biológica es obvio. Por otra parte, Isman et al. (30) plantean que si el propósito del estudio es descubrir un insecticida de amplio espectro, o al menos un producto eficaz contra insectos fitófagos, entonces las larvas de mosquito son probablemente un mal indicador pues los extractos de plantas y los productos naturales que son altamente activos contra las larvas de mosquito a menudo muestran una actividad débil, si la hay, contra los insectos fitófagos. ]]>
Isman et al. (30) en un programa de investigación, dirigido al descubrimiento y desarrollo de insecticidas botánicos, utilizaron rutinariamente dos especies de orugas noctuidas para el estudio de extractos crudos de plantas, su fraccionamiento biodirigido y el aislamiento de los compuestos activos. Estas son Spodoptera litura (Fabricius) y Peridroma saucia (Hubner); ambos insectos son altamente polífagos de plantas cultivables. Sin embargo, es muy posible obviar compuestos activos al utilizar solo los noctuidos; por ejemplo, los gingkolidos, sesquiterpenos del Gingko biloba L., son insecticidas potentes contra Nilaparvata lugens (Stal), aunque son inactivos contra S. litura (3).Desventajas comunes a estos ensayos in vivo, independientemente de la diana, son la necesidad de mantener una colonia del organismo, se pueden probar cantidades limitadas de muestras al mismo tiempo, la obtención de los resultados toma varios días, y en ocasiones no es posible discriminar si la inhibición del crecimiento se presenta por alteración del comportamiento (efecto antialimentario) o por efecto fisiológico post-ingestión.
Los sistemas de ensayos biológicos simples, son de gran importancia para identificar los principios activos; la prueba de Artemia spp. es una prueba biológica general, particularmente útil con este propósito. Un bioensayo general debe ser sensible a un amplio rango de actividades más que estar dirigido a un sistema particular de compuestos o de reacciones (20, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38). La respuesta biológica debe ser lo suficientemente amplia como para incluir diferentes y nuevos mecanismos de acción y estructuras químicas novedosas. La utilidad del ensayo de artemia como un bioensayo general, indicador de varios tipos de actividades, se ha validado por el descubrimiento de centenares de compuestos activos (35, 39, 40).
La eficiencia del método para predecir actividades plaguicidas y farmacológicas es reconocida, no obstante se debe prestar especial atención a dos aspectos al estandarizar este bioensayo: sensibilidad de la especie utilizada y correspondencia entre la actividad frente a artemia y la actividad biológica de interés. Varó et al. (11) plantearon que la existencia de diferencias en la biología y fisiología entre especies y cepas del género Artemia puede provocar variaciones en las sensibilidades de las distintas formas a los mismos compuestos. Estas observaciones alertan sobre el uso indiscriminado de cualquier fuente de Artemia spp., e indican la importancia de reoptimizar el bioensayo general para cada nueva especie y/o cepa usando compuestos de referencia para establecer el grado de sensibilidad de la cepa empleada. También, debe corroborarse en cada caso la correspondencia entre la actividad frente a este organismo y la actividad plaguicida de interés, pues existen autores que sugieren que la ausencia en A. salina de estructuras desarrolladas como receptores puede generar la posibilidad de obtener falsos resultados negativos (10).
El ensayo de Artemia spp. tiene las ventajas de ser más rápido (24 horas), barato y sencillo (no se requieren técnicas asépticas). Se pueden utilizar fácilmente un gran número de organismos para la validación estadística, no necesita equipamiento especial y se emplean pequeñas cantidades de muestras (2-20mg o menos). Además, no se requiere suero animal que si es necesario para las citotoxicidades. Este sistema de bioensayo puede ser utilizado fácilmente por farmacólogos y químicos de productos naturales; cada técnico de laboratorio conduce sus propias pruebas biológicas, y obtiene de una manera rápida y reproducible los resultados estadísticos confiables del bioensayo. De esta manera, los compuestos bioactivos novedosos se pueden detectar y aislar rápidamente mediante un fraccionamiento biodirigido de los extractos de las plantas. Por último, los defensores de los derechos de los animales no han objetado el uso de estos invertebrados para el trabajo experimental (3).
Variantes experimentales del ensayo de Artemia spp.
Según Vanhaecke y Persoone (12) los aspectos que deben ser considerados para desarrollar una prueba de Artemia spp. estándar son los siguientes:
- utilizar los estadios larvales tempranos para pruebas de toxicidad aguda,
- los huevos tienen que eclosionar bajo condiciones estrictamente controladas de temperatura, salinidad, aireación, luz y pH,
- las larvas tienen que ser exactamente de la misma edad al inicio de cada prueba, ]]>
- durante la prueba, la larva no debe transformarse en otro estadio con una sensibilidad diferente,- las pruebas deben realizarse con quistes del mismo origen geográfico,
- las condiciones experimentales de la prueba tienen que ser definidas con gran exactitud,
- realizar una prueba control en paralelo con un químico de referencia.
Existen diferentes variantes experimentales del procedimiento cuyas principales características se presentan a continuación.
Ensayo del Centro de Referencia de Artemia
Alcance y campo de aplicación
Este método estándar se desarrolló en el Laboratorio de Maricultura del Centro de Referencia de Artemia, Universidad Estatal de Ghent, Bélgica; con el objetivo de determinar la toxicidad aguda en larvas de Artemia spp. de: sustancias químicas y afluentes industriales y domésticos considerados por su vertimiento en el ambiente marino (12).
Principio
Se basa en la determinación de la concentración que causa la muerte 50% de las larvas de artemia en 24 horas bajo las condiciones descritas por este procedimiento. Esta concentración es conocida como LC50. ]]>
Ensayo de toxicidad generalLa prueba se realiza en pequeñas placas Petri de vidrio de 5 cm de diámetro. Se transfieren diez larvas con una pipeta Pasteur a cada placa Petri. El volumen de agua de mar que se toma con las larvas no debe exceder 0,05mL. Posteriormente 10 mL de las concentraciones respectivas del compuesto tóxico (ya aclimatado a 25ºC) se añaden a las placas,
que son incubadas en la oscuridad a una temperatura de 25±1ºC.
Se desarrolla una prueba preliminar para determinar el rango crítico (una placa Petri por concentración y una como control). Para ello se prepara una serie de diluciones del tóxico con agua de mar artificial. Para sustancias químicas: 10 000; 1 000; 100; 10; 0,1; 0,01 mg.L-1 y para afluentes: 1 000 000; 100 000; 10 000; 1 000; 10 mg.L-1.
Después de 24 horas, se determina el número de larvas muertas en cada placa Petri. La larva es considerada muerta si no se observa movimiento de los apéndices durante 10 segundos. Inmediatamente después del conteo, se mide la concentración de oxígeno en la placa Petri con la menor concentración de compuesto tóxico que induce un 100% de mortalidad.
Bioensayo general para productos naturales con actividad biológica
Alcance y campo de aplicación
Esta variante la desarrollaron en 1982, Meyer et al. (13) y ha sido mejorada desde entonces por diferentes investigadores. Aquí se presenta la versión publicada en 1998 por McLaughlin et al. (3). El ensayo permite la evaluación rápida y conveniente de extractos crudos, fracciones y compuestos puros; y además comparar varias partes de la planta y establecer variaciones estacionales en plantas individuales. También puede ser utilizado para establecer la actividad biológica de compuestos sintéticos.
Principio
Se basa en la determinación de la mortalidad in vivo de un organismo zoológico simple, las larvas de Artemia spp. en 24 horas a dosis iguales o menores de 1000 mg.mL-1 (3, 13). ]]>
Ensayo de toxicidad generalLos extractos crudos, fracciones o compuestos puros de origen natural son evaluados a concentraciones iniciales de 10, 100 y 1000 mg.mL-1 en viales que contienen 5mL de solución salina y 10 larvas, cada uno es considerado una réplica (tres por concentración). Después de 24 horas, se cuenta el número de larvas muertas. La muerte de las larvas se establece por la falta total de movimientos durante 10 segundos de observación bajo el estéreo microscopio (11, 12). Los valores de LC50 e intervalos de confianza 95%, se calculan usando el método análisis estadístico Probit, programa Polo (LeOra Software, Berkeley, California) (41). La LC50 se define como la concentración de un material tóxico letal al 50% de los organismos de la prueba.
Ensayo de la movilidad óptica de las larvas de Artemia spp.
Usualmente, un parámetro conveniente para expresar la toxicidad es la LC50, pero sus valores no consideran los efectos que son menos severos que aquellos que resultan en la muerte y que sin embargo, constituyen un signo de toxicidad (4). Un nuevo método óptico que mide la movilidad de las larvas de artemia se desarrolló con el objetivo de obtener resultados más exactos y definidos biológicamente. En 1985, Schmidt (9) determinó la inhibición de la motilidad de las larvas en lugar de su letalidad. La actividad de los animales se mide utilizando un contador óptico de motilidad. Esta se calculó considerando el número de interrupciones del haz de luz en 10seg. El procedimiento es más fácil y menos tedioso que contar con un estéreo microscopio. Pueden ser detectados aún pequeños daños en las larvas y esto es una mejora significativa en comparación con otras variantes del método y permite la detección de pequeñas cantidades de toxinas. La desventaja principal relacionada con esta variante experimental, es que exige la disponibilidad de un contador y por esa razón su uso es menos frecuente.
Las dos primeras variantes experimentales descritas se diferencian fundamentalmente en las concentraciones de las muestras que se sugieren para el trabajo, lo que se encuentra condicionado a la interpretación final de los resultados. Como ensayo para establecer las propiedades tóxicas de algunas sustancias es conveniente determinar la cantidad mínima de cada sustancia que representará un peligro para el medio ambiente y el hombre y por tanto, se ajusta el rango de concentraciones en cada caso haciéndose lo más estrecho posible. Para productos naturales, sin embargo, es más eficaz evaluar las muestras en un rango que garantice que los compuestos seleccionados posean el potencial para el desarrollo futuro de un medicamento o un plaguicida y no se inviertan recursos y tiempo en la investigación de compuestos no promisorios.
A partir de estos protocolos de referencia han trabajado numerosos investigadores introduciendo pequeñas variaciones encaminadas fundamentalmente a reducir el volumen de muestra necesario, aspecto este de vital importancia, sobretodo en las últimas etapas de purificación y aislamiento de los compuestos. Por ejemplo, en lugar de viales o placas Petri han sido utilizadas placas de 24 ó 96 pocillos, que requieren menor cantidad de muestra para realizar los estudios biológicos. Estas placas, además, proporcionan la posibilidad de evaluar simultáneamente un mayor
número de muestras y diluciones (8, 10, 21, 42). Otros autores han utilizado discos de papel de filtro sobre el cual se absorbe la muestra y esto contribuye a que la solución de las larvas de artemia se encuentre más limpia de contaminantes y los compuestos a evaluar entren en contacto más eficientemente con los organismos (43).
Potencialidades de uso del ensayo de artemia en la bioprospección de la flora cubana como fuente de plaguicidas
Para desarrollar plaguicidas fitoquímicos ambientalmente benignos, se deberá dar un énfasis apropiado a la conservación y estudio de la biodiversidad, aún inexplorada en relación con sus propiedades plaguicidas. Al afrontar estos estudios la química de productos naturales deberá, para lograr aplicación práctica, combinar el uso de técnicas de separación, métodos de elucidación estructural y pruebas biológicas simples, enfoque investigativo que facilita el descubrimiento y desarrollo de nuevos productos bioactivos de origen natural.
Debido a la diversidad de la flora tropical, existe la necesidad de realizar evaluaciones masivas de extractos vegetales para determinar la presencia de compuestos bioactivos pues productos naturales potencialmente activos permanecen sin descubrir, sin investigar, sin desarrollar y/o sin utilizar en este gran depósito de material vegetal. La flora cubana posee enormes potencialidades como fuente de productos activos de origen natural; sin embargo, estas solo han sido explotadas muy someramente. Nuestro país es considerado como uno de los de mayor biodiversidad botánica en el mundo, en lo que se refiere al número total de especies, y tiene la biodiversidad florística más rica de todas las islas en el continente americano y el Caribe insular. Se informan alrededor de 6 700 especies de plantas superiores (agrupadas en 1300 géneros y 101 familias), aproximadamente el 50% de la flora terrestre conocida es endémica y la mayor parte de nuestras especies no han sido investigadas a profundidad (44). ]]>
Existe información relacionada con la actividad biológica de muchas de estas plantas y su uso popular como medicamentos y plaguicidas naturales, pero los compuestos activos no se han estudiado en la mayoría de los casos (8). El trabajo realizado en el área del descubrimiento y desarrollo de sustancias con actividad plaguicida es aún más reducido (45). Si bien es cierto, que el campesinado cubano ha hecho uso empírico de las propiedades de las plantas para proteger sus cultivos de las plagas, no existe un estudio científico sistemático y riguroso que sustente o respalde este conocimiento tradicional, y mucho menos que abarque un grupo numeroso de especies vegetales que no han sido estudiadas como plaguicidas potenciales. Las investigaciones encaminadas al aislamiento y caracterización de los compuestos responsables de la actividad plaguicida son también muy escasas (21).Pino et al. (8) realizaron la evaluación biológica frente a A. salina de 123 extractos obtenidos a partir de plantas de las familias Anacardiaceae, Asteraceae, Clusiaceae, Myrtaceae y Poaceae. Este trabajo es el primero desarrollado en Cuba en el cual la investigación de nuevas fuentes de plaguicidas potenciales se realiza utilizando el fraccionamiento dirigido por el ensayo de artemia. Los resultados de este estudio químico y biológico de varias especies de la flora cubana, la mitad de ellas endémicas y algunas de ellas investigadas por primera vez, representan un aporte al conocimiento de nuestra biodiversidad botánica valorando sus potencialidades como fuentes de plaguicidas. Desde el punto de vista social y económico la identificación de compuestos activos como candidatos potenciales para el desarrollo de nuevos productos fitosanitarios brinda nuevas alternativas, eficaces y ambientalmente seguras, para nuestra agricultura en el campo de la Protección de Plantas.
La extensión del uso de este ensayo general al estudio de nuestra biodiversidad, como fuente de compuestos activos, simplificaría y aumentaría las posibilidades de evaluación biológica incrementando el conocimiento en general sobre nuestros recursos naturales y consecuentemente su uso sostenible. Las ventajas del uso de un ensayo general como este, podrán ser aprovechadas además para la evaluación biológica de compuestos de origen sintético, lo cual representa un elemento muy importante en el avance no solo de la Química de Productos Naturales sino también de la Síntesis Orgánica y la Bioinformática.
CONCLUSIONES
El uso combinado de ensayos biológicos como el de Artemia con las tecnologías de separación y elucidación estructural actuales guiará a los químicos de productos naturales en el descubrimiento de compuestos altamente promisorios para su desarrollo como plaguicidas de origen natural. Su aplicación en nuestro país, proporcionará un valioso instrumento que contribuirá a la búsqueda de nuevas alternativas para el control de plagas en la agricultura, centrando las investigaciones y los recursos disponibles en los candidatos más prometedores.
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(Recibido 30-9-2008; Aceptado 8-9-2009)
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