Artículo original
PATOGENICIDAD, VIRULENCIA Y POTENCIAL REPRODUCTIVO DE Heterorhabditis bacteriophora (CEPA HC1) SOBRE Cylas formicarius var. elegantulus (SUMMERS)
PATHOGENICITY, VIRULENCE AND REPRODUCTIVE POTENTIAL OF Heterorhabditis bacteriophora (STRAIN HC1) ON Cylas formicarius var. elegantulus (SUMMERS)
L.C. Jiménez, E. del Pozo
Departamento Biología-Sanidad Vegetal. Facultad de Agronomía. Universidad Agraria de La Habana Fructuoso Rodríguez Pérez. Carretera de Tapaste y Autopista Nacional. Apartado 10, San José de las Lajas, La Habana. Correo electrónico: lcarlos@isch.edu.cu
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RESUMEN
Se evaluó la patogenicidad y la virulencia del nematodo Heterorhabditis bacteriophora Poinar (cepa HC1) sobre Cylas formicarius var elegantulus Summer en condiciones de laboratorio. Mediante un diseño completamente aleatorizado, con cuatro repeticiones se evaluó la patogenicidad del nematodo tomando en consideración la mortalidad del insecto usando una concentración de 1000 JI.mL-1 y un control. Con igual diseño experimental y número de repeticiones se evaluó la virulencia usando cinco niveles de concentración de JI y un control. Se evaluó además el potencial reproductivo del nematodo sobre el insecto. Se encontró un marcado efecto patogénico del nematodo sobre el insecto, observándose altos porcentajes de mortalidad; la virulencia DL50 y TL50 en gran medida está relacionada con la concentración de JI.mL-1. El potencial reproductivo del nematodo en el insecto puede llegar a valores de 2675 JI.insecto mostrando un valor promedio de 1832 JI.
Palabras clave: Heterorhabditis bacteriophora; Cylas formicarius var elegantulus; patogenicidad; virulencia
ABSTRACT
The pathogenicity and virulence of the strain HC1 of the entomopatogenic nematode Heterorhabditis bacteriophora Poinar (Summer) was evaluated on Cylas formicarius var elegantulus in the laboratory. The nematode pathogenicity, taking into account the insect mortality, was evaluated in a completely randomized design with four repetitions using a concentration of 1000 JI.mL-1 and a control. A similar experimental design with the same number of repetitions was used to evaluate the virulence using five concentrations of JI. The reproductive potential of the nematode on the insect were also evaluated. In this conditions, a significant pathogenic effect of the nematode on the insect was found with high mortality percentages; the virulence DL50 y TL50 was closely related to the concentration of JI.mL-1. The reproductive potential of the nematode on the insect could reach 2675 JI/insect with an average of 1832.
Key words: Heterorhabditis bacteriophora; Cylas formicariusm var. elegantulus; pathogenicity; virulence
INTRODUCCIÓN
El boniato Ipomoea batata (L.) es uno de los alimentos más importantes en Cuba, con alrededor de 60 000 ha que se plantan cada año. Una de las mayores limitantes en la producción del boniato son las pérdidas causadas por los insectos principalmente por el tetuán del boniato (Cylas formicarius var. elegantulus). Los daños que produce, han provocado una disminución de las áreas plantadas de boniato en la mayoría de las provincias más afectadas. A pesar de esta disminución y un cambio notable hacia otros cultivos, motivado por el valor del mercado, el boniato sigue siendo un cultivo importante y se considera vital en la dieta humana (1). Este insecto está presente en todas las provincias del país, causando daños en un 45% en ausencia de adecuadas medidas de control (2).
]]> En la actualidad el uso de microorganismos entomopatógenos ofrece grandes posibilidades para resolver problemas de plagas (3). Algunos autores señalan a los nematodos como excelentes reguladores biológicos para estos fines (4,5,6,7,8,9). Los nematodos se ubican dentro de los grupos de microorganismos que ofrecen estas posibilidades y particularmente la especie Heterorhabditis bacteriophora Poinar puede ser utilizada para el control de insectos del Orden Coleoptera, siendo uno de ellos el tetuán del boniato (10).Heterorhabditis bacteriophora constituye una de las líneas de producción en Cuba para lo cual están diseñadas tecnologías que permiten disponer de determinadas cantidades de nematodos y la cepa que se reproduce es la HC1. Considerando la importancia que tiene el tetuán del boniato y las posibilidades de manejo del mismo con esta especie de nematodo, se realizó el presente trabajo con el objetivo de evaluar la patogenicidad, virulencia y potencial reproductivo de H. bacteriophora (cepa HC1) sobre C. formicarius var. elegantulus en condiciones de laboratorio.
MATERIALES Y MÉTODOS
La cepa de H. bacteriophora utilizada fue la HC1 aislada por investigadores del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), la cual se reproduce sobre Galleria mellonella (L.). Los nematodos se reprodujeron sobre este insecto y se mantuvieron los JI en bandejas con agua corriente por tres días cada vez que se utilizaron. Los especímenes de C. formicarius var. elengantulus se colectaron en campo sin tratamientos biológicos y se alimentaron en el laboratorio por varios días para descartar posibles agentes biológicos sobre ellos. Durante el tiempo que se mantuvieron los nematodos en la bandeja la temperatura osciló entre 23 y 27°C. Los experimentos se realizaron en el laboratorio de Sanidad Vegetal de la Facultad de Agronomía de la Universidad Agraria de La Habana.
Determinación de la patogenicidad de H. bacteriophora (cepa HC1) sobre C. formicarius var. elegantulus
En placas Petri de 50 x 20 mm con papel de filtro estéril en el fondo y la tapa, se añadió 1 mL de una suspensión de nematodos de la cepa HC1 a una concentración de 1000 JI.mL-1. En cada placa Petri se colocaron 10 insectos adultos. Se estableció un control usando la misma cantidad de insectos, a los que se les añadió 1 mL de agua destilada estéril. Se utilizaron cuatro repeticiones, incluyendo el control. Las placas Petri se sellaron y se colocaron en total oscuridad a temperatura ambiente. Se registró el número de individuos muertos cada 12 horas durante 11 días.
El diseño experimental utilizado fue totalmente aleatorizado. Como criterio de mortalidad se consideró la existencia de insectos con adultos hermafroditas a los cinco días de inoculados. Los datos se transformaron usando la expresión arc √ p y se sometieron a un análisis de varianza simple. Las medias se compararon según Tukey al 5%. La temperatura promedio que se registró durante el desarrollo del experimento fue de 23,5±5°C.
Determinación de la virulencia de H. bacteriophora (cepa HC1) sobre C. formicarius var. elegantulus
En placas Petri de 50 x 20 mm con papel de filtro estéril en el fondo y la tapa, se añadió 1 mL de una suspensión de nematodos de la cepa HC1 a concentraciones ajustadas a 0; 1000; 2000; 3000; 4000; 5000 JI.mL-1. Cada suspensión se nematodos se preparó con agua destilada estéril incluyendo el control. En cada placa Petri se colocaron 10 insectos y se usaron cuatro repeticiones para cada nivel de inóculo de nematodo. Las placas Petri se sellaron y se colocaron en total oscuridad a temperatura ambiente. Se realizaron evaluaciones cada 12 horas, las cuales se extendieron hasta las 264 horas (11 días consecutivos), contabilizándose el número acumulado de insectos muertos. Como criterio de mortalidad de los insectos a causa del nematodo se consideró la observación en un estereoscopio de adultos hermafroditas en una muestra de 2 insectos por réplica disertados después de cinco días de la inoculación. Se utilizó un diseño experimental totalmente aleatorizado.
]]> Los porcentajes de mortalidad se transformaron usando la fórmula arc √ p, y se sometieron a un aná-lisis de varianza. Las medias se compararon según Tukey al 5%. Para determinar la DL50 y DL90 y el TL50, se utilizaron las datos finales de mortalidad y se efectuó un análisis Probit, utilizando un Programa de Análisis de Probita (Universidad de Colima, México). La temperatura promedio registrada durante el desarrollo del experimento fue de 24,3±5°C.Determinación del potencial reproductivo de H. bacteriophora (cepa HC1) sobre C. formicariusvar. elegantulus
En placas Petri de 50 x 20 mm con papel de filtro estéril en el fondo y la tapa, se añadió 1 mL de una suspensión de nematodos de la cepa HC1 a una concentración ajustada a 1000 JI.mL-1 utilizando agua destilada estéril. Se sometieron a este tratamiento 10 adultos de C. formicarius var. elegantulus por placa Petri y a los 12 días de inoculados se colocaron de forma individual en trampas White para lo cual se utilizaron placas Petri de 50 mm de diámetro forradas con papel de filtro y se ubicaron dentro de placas Petri de 150 mm de diámetro, añadiéndose suficiente agua hasta hacer contacto con los bordes del papel. Con esto se logró obtener una descarga de juveniles infectivos (J3) por medio de migración por el papel hacia el agua para lo cual se dejaron transcurrir 48 horas. Estas descargas se contaron de forma individual y posteriormente se calculó el valor promedio. La temperatura promedio registrada durante el desarrollo del experimento fue 23,0±5°C.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Determinación de la patogenicidad de H. bacteriophora (cepa HC1) sobre C. formicarius var. elegantulus
El análisis estadístico mostró diferencias significativas entre el tratamiento y el control, lo que de-muestra el carácter patogénico del nematodo sobre el insecto. Se observa que H. bacteriophora fue ca-paz de provocar un 87,5% de mortalidad en la muestra de insectos a una concentración de 1000JI.mL-1 . La susceptibilidad de C. formicarius a nematodos incluyendo a la especie H. bacteriophora se ha demostrado en distintos experimentos (4).
En un experimento desarrollado por Moriya y Miyatake (11) sobre larvas y adultos de C. formicarius se encontró que H. bacteriophora, entre otras especies de nematodos, resultó muy patogénico sobre el insecto. Estos autores consideraron estos resultados de gran valor para seleccionar nematodos para el control biológico de C. formicarius. Mannion y Jansson (12) cuando evaluaron la patogenicidad de H. bacteriophora sobre C. formicarius también encontrando resultados positivos. Sánchez (13) demostró el carácter entomopatógenico de H. bacteriophora sobre los estadios de larva, pupa y adultos de C. formicarius en laboratorio.
Determinación de la virulencia de H. bacteriophora (cepa HC1) sobre C. formicarius var. elegantulus
Las cinco concentraciones probadas mostraron tasas de mortalidad, incluso las más bajas. El análisis estadístico no mostró diferencias significativas entre las diferentes concentraciones estudiadas; sin embargo si existen diferencias significativas con el control (Tabla 1). El nematodo mostró variabilidad en los porcentajes de mortalidad condicionado por la concentración utilizada. Los mayores valores de mortalidad se registraron a las concentraciones más altas, notándose un decremento a medida que la concentración disminuyó.
]]> Al estar el insecto expuesto a un mayor número de juveniles infectivos aumenta las probabilidades de contraer la infección por el nematodo. En este sentido Moriya y Miyatake (11) en sus trabajos con C. formicarius encontraron que los porcentajes de mortalidad que provoca este nematodo sobre el insecto dependen de la concentración de juveniles infectivos aplicados. No obstante, Grewal y Georgis (14) plantean que el insecto puede quedar infectado y morir si un solo nematodo logra penetrarlo. Esto explica por qué aun a bajas dosis se observan valores de mortalidad elevados. También influye en esto las características patogénicas del nematodo en cuestión y la fase de su bacteria simbionte.Como se observa en la Tabla 2, el 50% de mortalidad en la muestra de insectos se alcanza con una concentración de 115,398 JI.mL-1. En investigaciones con varios aislamientos de nematodos de diferentes especies Moriya y Miyatake (11), encontraron valores de DL50 que varían significativamente para cada aislamiento con relación a C. formicarius, lo cual se acentuó más al probar el efecto sobre diferentes estadios del ciclo de vida del insecto; detectaron que los estadios de larva y pupa mostraron más susceptibilidad que los adultos y sobre los estadios inmaduros obtuvieron mayores valores de mortalidad con menor concentración de juveniles infectivos. Alegan que estas diferencias pueden deberse a la talla y origen de los nematodos. También se informa que los adultos de C. formicarius son menos susceptibles a H. bacteriophora que las fases juveniles del insecto (13).
Los valores de DL50 y DL90 que se muestran en la Tabla 2 referido al efecto del nematodo sobre el insecto son mayores a los encontrados por estos auto-res; sin embargo hay que tener en cuenta que el experimento se realizó con adultos que parece ser una fase del insecto que ofrece resistencia para que pueda ser penetrado.
Las pruebas realizadas con otros curculionidos demuestran una tendencia similar a la observada en esta investigación, así por ejemplo para el caso de Cosmopolites sordidus Germar los valores de DL50 se registran en el orden de 14 751 JI, con límites de confianza de 12 290 y 17 918 (15). Estos valores indican que el obtenido en este trabajo suponen que H. bacteriophora es 33 veces más efectivo sobre adul-tos de C. formicarius que sobre adultos de C. sordidus.
Los resultados obtenidos sugieren que, para aplicaciones en campo, donde las posibilidades de infec-ción son menores debido a barreras ecológicas la dosis de aplicación de los nematodos tendrá que ser elevada.
Como se observa, el 50% de mortalidad en la muestra de insectos se produce en 107,523 horas. La mortalidad del insecto se incrementa a medida que transcurre el tiempo, es decir, existe una relación directa entre el tiempo transcurrido y la mortalidad (Tabla 3).
En todos los casos se comprobó la muerte de los insectos por los nematodos mediante disecciones de los cadáveres a los cinco días de la inoculación, detectándose la presencia de adultos hermafroditas. La habilidad para reproducirse en los cadáveres es muy importante para el establecimiento y persistencia de esta especie de nematodo en condiciones de campo. Esta es una cualidad muy deseada a los efectos del control biológico de esta plaga porque todas sus fases biológicas se desarrollan en el suelo.
Los resultados de este trabajo resultan muy importantes desde el punto de vista práctico. El hecho que esta cepa muestre valores de DL50 de 115,398 JI.mL-1 y una TL50 de 107,52 horas postinfección, y que esta especie se reproduzca en los cadáveres del insecto es bastante significativo, pues constituye una característica deseable para la aplicación en el campo.
En la Tabla 4 se muestran los resultados del análisis de Probit Dosis-Mortalidad y Tiempo-Mortalidad. En el primer caso (Dosis-Mortalidad) se evidencia que existe una correlación positiva entre la concentración de juveniles infectivos y la mortalidad, según indica el coeficiente de regresión. En el caso del análisis Tiempo-mortalidad, realizado con los datos de la dosis 1000 JI.mL-1 también se evidencia una correlación positiva entre el tiempo y la mortalidad.
]]> Determinación del potencial reproductivo de H. bacteriophora (cepa HC1) sobre C. formicariusvar. elegantulusEl rendimiento de nematodos por adultos de C. formicarius alcanzó un valor promedio de 1832 JI. Estos resultados no fue posible compararlos con otros, porque en este sentido existen escasos informes de otros autores. Es destacable que en la muestra de insectos que se sometieron a la descarga de los nematodos se pudieron constatar valores máximos de 2675 JI.insecto-1.
Según Grewal y Georgis (14) en insectos grandes como G. mellonella los rendimientos pueden oscilar entre 50 000 y 200 000 JI. Poinar (16) informa un promedio de 141 562 con un rango de 50 905-271 593 JI.larva-1. C. formicarius es un insecto pequeño, esto pudiera explicar la diferencia numérica en cuanto al rendimiento de nematodos entre una especie de insecto y la otra.
Es criterio de algunos autores, que el potencial reproductivo está determinado por las características de la cepa y por la calidad del hospedante que se utilice. En correspondencia con esto Sánchez (13) plantea que pueden existir diferencias dentro de una misma especie de nematodo lo cual está dado por su comportamiento y fisiología. Esto sugiere que siempre habrá que comprobar constantemente las potencialidades de la cepa como agente de control biológico y tratar de estandarizar en el mayor grado posible el proceso de reproducción.
REFERENCIAS
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(Recibido 23-9-2010; Aceptado 30-5-2010)
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