ACTIVIDAD PROMISORIA DE ACEITES ESENCIALES ESPECIES PERTENECIENTES A LA TRIBU PIPEREAE FRENTE A Artemia salina Y Xanthomonas albilineans
PROMISORY ACTIVITY OF ESSENTIAL OILS FROM SPECIES BELONGING TO PIPEREAE TRIBU AGAINST Artemia salina AND Xanthomonas albilineans
Yaíma Sánchez, Oriela Pino, Fanny Jorge Lazo, Yudith Abreu, E. Naranjo, Aleika Iglesia
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Departamento de Plagas Agrícolas, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) Apartado 10, San José de las Lajas, La Habana. Cuba. Correo electrónico: ysanchez@censa.edu.cu
RESUMEN
Los géneros Piper y Lepianthes han sido empleados como fuente de insecticidas y en la medicina natural. Son conocidas las propiedades antifúngica, insecticida, antialimentaria, estimulante, bactericida y citotóxica de muchos de sus extractos. El objetivo de este trabajo fue establecer las potencialidades de tres aceites esenciales de especies de estos géneros como candidatos para el desarrollo de productos con actividad plaguicida y antitumoral. Los aceites esenciales de P. auritum (CA1), P. aduncum subsp. ossanum (PAO1) y L. umbellata (LU1) fueron obtenidos por hidrodestilación empleando un equipo Clevenger y se evaluaron frente a Artemia salina, organismo indicador de actividad plaguicida y antitumoral. La actividad antibacteriana de los aceites esenciales frente a Xanthomonas albilineans (los serovares I y III) se evaluó empleando los métodos de difusión en agar y envenenamiento del medio. La evaluación de la actividad plaguicida y antitumoral de los aceites esenciales evidenció un 100% de mortalidad de las artemias, a las 24 horas a las concentraciones de 250, 500 y 1000 µg/mL (LC50<100 µg/mL; LC50<125 µg/mL; LC50<250 µg/mL) para CA1, LU1 y PAO1 respectivamente. Al evaluar la acción antimicrobiana de los aceites esenciales PAO1 y CA1 se observó una inhibición del crecimiento bacteriano a una concentración mínima inhibitoria (CMI) menor de 1,25 µL/mL frente al serovar I y una concentración mínima inhibitoria de 0,5 y 1 µL/mL de CA1 y PAO1 respectivamente, frente al serovar III. CA1, LU1 y PAO1 son candidatos botánicos con actividad plaguicida y antitumoral promisorias.
Palabras clave: aceite esencial; Piper; Lepianthes; Artemia salina; Xanthomonas albilineans.
ABSTRACT
The genera Piper and Lepianthes have been used as a source of insecticides and natural medicines. The antifungal, insecticide, antifeeding, stimulant, bactericidal and cytotoxic properties of many of their extracts are known. The aim of this study was to establish the potential of essential oils from three species of these genera as candidates for the development of products with pesticide and antitumoral activity. The essential oils from P. auritum (CA1), P. aduncum subsp. ossanum (PAO1) and L. umbellata (LU1) were obtained by hydrodistillation in a Clevenger-type apparatus and they were studied for their antitumoral activity by the brine shrimp lethality bioassay. The essential oils were tested against Xanthomonas albilineans (serovars I and III) for antibacterial properties using agar diffusion and poisoning medium methods. The essential oils showed 100 % of mortality of Artemia at 24 hours at concentrations of 250, 500 y 1000 µg/mL (LD50<100 µg/mL; LD50<125 µg/mL; LD50<250 µg/mL) for CA1, LU1 and PAO1 respectively. The bioassay for antimicrobial activity showed that the essential oils PAO1 and CA1 had a strong bactericidal activity. An inhibition of bacterial growth was at a minimum inhibitory concentration (MIC) less than 1,25 mL/mL against serovar I and a minimum inhibitory concentration of 0,5 and 1 mL/mL of CA1 and PAO1, respectively, against serovar III observed. CA1, LU1 and PAO1 are botanical candidates with pesticide and antitumoral potential.
Key words: essential oil; Piper; Lepianthes; Artemia salina; Xanthomonas albilineans.
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Las plantas constituyen la mayor fuente de productos orgánicos que se conoce, entre los cuales se distinguen alcaloides, flavonoides, glicósidos, fitoesteroles, terpenos, carotenoides y aceites esenciales. Todos estos compuestos tienen una utilidad potencial, ya sea como aditivos de alimentos, fármacos y/o plaguicidas de origen natural, estos últimos son de gran aceptación en el mercado por ser de probada eficacia y prácticamente inocuos al medio ambiente (1,2).
Los aceites esenciales son empleados como aromatizantes y/o saborizantes y como ingredientes de algunos preparados farmacéuticos, son la base de perfumes y productos cosméticos, desodorantes, lociones, jabones líquidos y pastas dentífricas (3,4). Algunos poseen propiedades antifúngicas y antibacterianas frente a microorganismos patógenos, son tóxicos a nematodos, un amplio espectro de insectos plagas y parecen ser particularmente efectivos contra plagas de productos almacenados (3,5). Además de sus efectos tóxicos agudos, producen numerosos efectos subletales, actúan como inhibidores del crecimiento larval, antialimentarios y repelentes para un amplio rango de insectos y ácaros (6,7).
Existen excelentes oportunidades para el desarrollo de plaguicidas basados en aceites esenciales; su eficacia, baja toxicidad y su disponibilidad general son características claves para llegar a un producto potencialmente comercializable. Aceites esenciales extraídos de plantas pertenecientes a la tribu Pipereae, familia Piperaceae, inhiben el crecimiento de un amplio grupo de microorganismos que causan infecciones importantes en el hombre, plantas y animales (8). Sin embargo, los aceites esenciales constituyen una alternativa poco explorada en nuestro país como fuente de plaguicidas y su futura aplicación requiere del desarrollo de investigaciones básicas sobre la química y la biología de estos compuestos que permitan establecer las potencialidades de diferentes aceites para el desarrollo futuro de productos fitosanitarios.
El objetivo de este trabajo fue establecer las potencialidades de los aceites esenciales de Piper auritum Kunth, Piper aduncum subsp. ossanum (C. DC.) Saralegui y Lepianthes umbellata (L.) Raf. como candidatos para el desarrollo de productos con actividad plaguicida y antitumoral.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de los aceites esenciales:
Las hojas de P. auritum, P. aduncum subsp. ossanum y L. umbellata se recolectaron en San José de las Lajas, provincia La Habana. Se partió del material vegetal fresco, no dañado y la extracción se realizó por el método de hidrodestilación, empleando un equipo Clevenger, según lo establecido en la norma ISO 65-71:84 (9). El tiempo de destilación fue de 3 horas. Los aceites esenciales obtenidos a partir de P. auritum, P. aduncum subsp. ossanum y L. umbellata se denominaron CA1, PAO1 y LU1 respectivamente, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se guardaron en frío hasta su evaluación biológica. ]]>
Ensayo de evaluación de la actividad frente a Artemia salina Leach:El ensayo frente a A. salina, indicador de actividad plaguicida y antitumoral, se realizó según lo descrito por Meyer et al. (10). Se utilizaron placas plásticas de 96 pocillos; a cada uno de ellos se le adicionó sucesivamente 200µL de agua de mar (conteniendo 5-10 larvas de A. salina) y una solución (50µL) de la muestra disuelta en una mezcla de acetona:Tween 20:Solución de Sal de mar.
Los aceites esenciales fueron evaluados a las concentraciones finales de 1000, 500, 250, 100, 50 y 10 µg/mL y aquellos con valores de LC50 <1000 µg/mL fueron considerados activos (10). Un total de 8 pozos (repeticiones) fueron utilizados para cada concentración. La mortalidad de las larvas se evaluó a las 6 y 24 horas. La muerte se estableció por la falta total de movimientos durante 10 segundos de observación bajo el esteriomicroscopio (11,12). Se utilizaron dos controles negativos: uno con el agua de mar y otro con la mezcla acetona-Tween 20-agua utilizada para evaluar las muestras. La prueba se consideró válida si el porcentaje de mortalidad en el control no excedió el 10% (11). Como plaguicida de referencia se utilizó la rotenona (control positivo).
Ensayo de evaluación de la actividad antibacte-riana frente a Xanthomonas albilineans (Ashby) Dawson:
Se utilizaron los serovares I y III de la bacteria fitopatógena X. albilineans, pertenecientes al cepario de bacterias del Laboratorio de Bacteriología Vegetal del CENSA, aislados de muestras procedentes de la Estación Territorial de Investigaciones de la Caña de Azúcar de Jovellanos, e identificados mediante métodos moleculares (13). La bacteria se sembró en medio Wilbrink (BDH) y se incubó a 28ºC durante 48 horas. Una vez activada, se prepararon suspensiones bacterianas hasta lograr una turbidez comparable al patrón 0,5 en la escala de Mc Farland. Esta comparación se realizó visualmente y mediante lecturas en el espectrofotómetro, a longitud de onda de 625 nm, se ajustó en el rango de 0,08 a 0,1 que equivale a 1-2 x 108 UFC/mL-1. De este inóculo se tomaron alícuotas y se colocaron en placas Petri estériles con 20 mL del medio de cultivo.
Para evaluar la sensibilidad de estos microorganismos a los aceites esenciales se empleó el método de difusión en agar según la técnica estandarizada por el Comité Nacional para Estándares de Laboratorios Clínicos (14), basada en el método de Kirby-Bauer. Un volumen de 15 µL de cada aceite puro se dejó secar sobre pequeños discos de papel de filtro de 6 mm de diámetro, que posteriormente se centraron cuidadosamente sobre el medio inoculado con las suspensiones bacterianas. La bacteria se incubó durante 48 horas a una temperatura de 28°C. Una vez transcurrido este tiempo se midió el halo de inhibición del crecimiento bacteriano. La actividad de los aceites se clasificó en marcada, moderada, ligera o sin actividad, según los rangos de la escala utilizada por Toda et al. (15).
Posterior a este experimento se realizó el envenenamiento del medio o diluciones seriadas en medio sólido; se utilizaron dosis de 5; 2,5 y 1,25 µL/mL frente al serovar I y dosis de 4; 2; 1; 0,5 y 0,25 µL/mL frente al serovar III de los aceites esenciales activos en el experimento anterior. Los aceites se añaden en placas Petri cuando el medio aún está líquido. Las placas se inocularon con la bacteria una vez que este se solidificó y los resultados se expresan como la concentración mínima inhibitoria (CMI) (16). Las condiciones del cultivo e incubación coincidieron con las del experimento anterior. En ambos casos la evaluación se realizó por tripliplicado y se empleó un control del crecimiento bacteriano y un control positivo de Cloranfenicol (30 µg/disco-1) (Imefa).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La evaluación de la actividad de los aceites esenciales frente a Artemia salina evidenció un 100% de mortalidad de las artemias, a las 24 horas, a una concentración de 250, 500 y 1000 µg/mL (LC50<100 µg/mL; LC50<125 µg/mL; LC50<250 µg/mL) para CA1, LU1 y PAO1 respectivamente. El efecto tóxico agudo de estos aceites se observó a las seis horas de evaluación. ]]>
El ensayo de evaluación de la actividad frente a A. salina se usa para la pre-evaluación de extractos vegetales en el descubrimiento de compuestos antitumorales (17). Es útil además, para predecir actividades plaguicidas y responde a un amplio rango de compuestos química y biológicamente diversos; es por ello que resulta tan importante su uso en programas de descubrimiento y desarrollo de nuevos plaguicidas de origen natural (18). Tiene las ventajas de ser rápido, barato y sencillo. Se pueden utilizar fácilmente un gran número de organismos para la validación estadística, no necesita equipamiento especial y se emplean pequeñas cantidades de muestras. Además, los defensores de los derechos de los animales no han objetado el uso de estos invertebrados para el trabajo experimental (18).Estos aceites esenciales, fundamentalmente el de P. auritum que mostró una mayor actividad frente a artemia, pueden ser objeto de estudios más profundos empleando bioensayos más específicos para determinar su actividad antitumoral y plaguicida pues demostraron ser promisorios en este sentido; más aún si se tiene en cuenta que existe información sobre diferentes extractos de las especies evaluadas, relacionada con estas actividades. Por ejemplo, extractos acuosos y metanólicos de P. aduncum, P. hostmannianum y P. tuberculatum se evaluaron empleando el bioensayo de artemia y mostraron una LC50 menor de 50 µg/mL (19). El aceite esencial de la parte aérea de P. aduncum, obtenido mediante destilación por arrastre con vapor, se evaluó frente al mismo organismo y mostró una LC50 de 41,3 µg/mL (20). Las diferencias en la actividad biológica pueden estar asociadas a diferencias en la sensibilidad del organismo empleado y/o en la composición del aceite esencial. P. aduncum subsp. ossanum se describió por Saralegui (21) como una especie endémica de Cuba occidental y los resultados de actividad biológica de su aceite esencial frente a A. salina se informan por primera vez en este trabajo.
Por otra parte, el extracto diclorometánico de las hojas de L. umbellata y tres de sus fracciones resultaron muy potentes en la inhibición de diferentes líneas celulares de cáncer humano a bajas concentraciones (menos de 10 µg/mL) (22).
Existen varios compuestos descritos en la literatura como sustancias citotóxicas frente a células tumorales, tal es el caso de ß-cariofileno, ß-elemeno, d elemeno y a -humuleno (23,24,25,26,27). Tatman y Mo (28) verificaron que el linalol y apineno presentan actividad citotóxica frente a células de melanoma en ratones y de leucemia en humanos. Muchos de estos componentes están presentes en los aceites evaluados (29,30,31).
Además de su actividad antitumoral los aceites de la tribu Pipereae están constituidos por fitoquímicos promisorios con actividad insecticida (32), alelopática (33,34) y antimicrobiana (35). Al respecto, numerosas especies han sido utilizadas en el control de diversos insectos y microorganismos responsables de la transmisión de enfermedades o como plagas en todos los cultivos del mundo.
La actividad detectada a través del ensayo de Artemia puede ser usada además como un indicador conveniente de la toxicidad frente a microorganismos (36). La evaluación de la acción antimicrobiana de los aceites esenciales CA1, PAO1 y LU1 sobre los serovares I y III se observa en la Tabla 1.
Al evaluar el aceite CA1 se observó una inhibición total del crecimiento bacteriano, y no la formación de halos de inhibición alrededor del disco, en el caso de PAO1 la inhibición fue marcada, siendo el serovar III el más sensible (Fig. 1). Sin embargo, en el caso del aceite LU1, no se observó inhibición del crecimiento bacteriano.
PAO1 y CA1 fueron los aceites que mostraron actividad en el experimento de difusión en agar por lo que se realizó un análisis más profundo donde se estimó la concentración mínima inhibitoria (menor concentración del aceite capaz de inhibir el crecimiento bacteriano) mediante el método de envenenamiento del medio. En este estudio, se observó la inhibición total del crecimiento del serovar I de la bacteria analizada en todas las dosis evaluadas, CMI<1,25 µL/mL. En el caso del serovar III, la CMI fue de 0,5 µL/mL y 1,0 µL/mL para CA1 y PAO1, respectivamente.
El género Piper es bien conocido como fuente de compuestos biológicamente activos como monoterpenos, sesquiterpenos y fenilpropanos, isobutilamidas y con frecuencia alcaloides del grupo de las piridinas, alcaloides aporfinos del grupo de las isoquinolinas y aminas alcaloidales (21). Varios metabolitos aislados de especies pertenecientes al género poseen utilidad potencial como antimicóticos, insecticidas, antialimentarios, estimulantes, bactericidas y citotóxicos. Sus aceites esenciales inhiben el crecimiento de un amplio grupo de microorganismos patógenos al hombre, plantas y animales, siendo particularmente útiles como antivirales, antifúngicos y antibacterianos (8). ]]>
La actividad antimicrobiana presentada por los aceites esenciales se debe, en gran medida, a la presencia de terpenoides (37,38). Así mismo, algunos autores plantean que los aceites con un alto porcentaje de compuestos terpenoides del tipo fenólicos poseen notables propiedades antimicrobianas (39,40,41).Se demostró la actividad frente a microorganismos de compuestos terpenoides, tales como el timol, carvacrol, linalool, eugenol, safrol, a-pinene y b-pinene (37,42). Compuestos de este tipo se identificaron como componentes de los aceites esenciales estudiados (30,31). En una publicación realizada anteriormente se informó la composición química y actividad biológica del aceite esencial de P. auritum (caisimón de anís) frente a la bacteria estudiada y la acción bactericida y/o bacteriostática del aceite esencial se atribuye a sus componentes terpenoides, fundamentalmente a los oxigenados y la mayor contribución a este efecto puede deberse al safrol, componente mayoritario del aceite (29).
Considerando la gran variedad de compuestos químicos presentes en los aceites esenciales, es muy probable que su actividad antimicrobiana no sea atribuible a un mecanismo específico, sino a la acción combinada de varios de ellos sobre distintos orgánulos de la célula (43). El mecanismo de acción de estos compuestos aún hoy no ha sido claramente caracterizado. Algunos autores plantean que su actividad bacteriostática y/o bactericida se debe, fundamentalmente, a la sobrecarga a la que es sometida la membrana celular de los microorganismos de forma tal que la hace perder el control y la integridad (4,42).
Estos resultados son de gran importancia, no solo desde el punto de vista cognoscitivo, sino también práctico, pues X. albilineans es la responsable de la escaldadura foliar, considerada la enfermedad bacteriana más importante de la caña y que provoca pérdidas millonarias en la producción cañera de Cuba y el mundo. La caña de azúcar es uno de los cultivos más extendidos a nivel mundial no solo por su uso en la producción de azúcar, sino además por servir como materia prima en la fabricación de papel, alcohol, maderas y enzimas industriales. Hasta este momento, las medidas fitosanitarias utilizadas para el control de la escaldadura de la hoja no resultan efectivas y esta enfermedad continúa causando pérdidas elevadas desde el punto de vista económico (44). El efecto biológico de PAO1 y CA1 sobre esta bacteria, establecido a nivel de laboratorio como resultado del presente trabajo, permite valorar las potencialidades de estos aceites como candidatos para el desarrollo de plaguicidas botánicos en el control fitosanitario de esta enfermedad bacteriana.
Estos resultados demuestran el enorme potencial de la tribu Pipereae y la familia Piperaceae como una fuente promisoria en el descubrimiento y desarrollo de nuevos agentes antitumorales, antibacterianos y compuestos bioactivos novedosos. Nuevos plaguicidas, antibacterianos y antitumorales basados en estos aceites podrían constituir un punto de partida para el desarrollo futuro de productos comercialmente competitivos.
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