Artículo original
CARACTERIZACIÓN QUÍMICA Y ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DEL ACEITE ESENCIAL DE Piper marginatum Jacq.
CHEMICAL CHARACTERIZATION AND ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF THE ESSENTIAL OIL OF Piper marginatum Jacq.
Yaíma Sánchez*, Teresa M. Correa**, Yudith Abreu*, B. Martínez*, Yanisia Duarte*, Oriela Pino*
]]> *Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) Apartado 10, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. Correo electrónico: ysanchez@censa.edu.cu; **Laboratororio Anti-doping, Instituto de Medicina Deportiva (IMD). Dirección Postal: 100 y Aldabó, Boyeros, La Habana. Cuba
RESUMEN
El uso de antimicrobianos de origen natural es una alternativa que está en vía de desarrollo y explotación y, dentro de ellos, los aceites esenciales tienen grandes potencialidades. El objetivo de este trabajo fue determinar la composición química del aceite esencial de Piper marginatum Jacq. y evaluar su actividad antibacteriana y antifúngica frente a microorganismos de importancia en la esfera agrícola. El aceite esencial de P. marginatum se obtuvo por hidrodestilación empleando un equipo Clevenger. Se determinó su rendimiento y su composición química se investigó por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (CG/EM). La actividad antibacteriana se evaluó por el método de difusión en agar frente a Xanthomonas albilineans (Ashby) Dawson, Xanthomonas campestris pv campestris (Pammel) Dawson, Pseudomonas solanacearum Smith, Pseudomonas celebensis Gäumann, Pseudomonas syzygii Roberts et al. y Pseudomonas fluorescens Migula. El efecto antifúngico del aceite se determinó sobre Alternaria solani Sor. El aceite esencial (2,18 % v/p) está constituido fundamentalmente por compuestos oxigenados y dentro de ellos los componentes mayoritarios resultaron ser el isosafrol y el notosmirnol. El aceite mostró un efecto bactericida frente a X. albilineans y X. campestris pv campestris y efecto fungistático frente a A. solani. Existen enormes posibilidades de desarrollo del aceite esencial de P. marginatum como agente antimicrobiano, considerando su elevado rendimiento y su actividad frente a los microorganismos estudiados.
Palabras clave: aceite esencial; Piper marginatum; actividad antimicrobiana; Cuba.
ABSTRACT
The use of natural antimicrobials is an alternative that is in development and exploitation and, among them, the essential oils have a great potential. The aim of this work was to determine the chemical composition of essential oil of Piper marginatum Jacq. and evaluate its antibacterial and antifungal activities against microorganisms of importance in the agricultural sphere. The essential oil of P. marginatum was obtained by hydrodistillation using an apparatus type Clevenger. Its yield was determined and its chemical composition was investigated by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). The antibacterial activity was evaluated by the agar diffusion method against Xanthomonas albilineans (Ashby) Dawson, Xanthomonas campestris pv campestris (Pammel) Dawson, Pseudomonas solanacearum Smith, Pseudomonas celebensis Gäumann, Pseudomonas syzygii Roberts et al. and Pseudomonas fluorescens Migula. The antifungal effect of the oil was determined on Alternaria solani Sor. The essential oil (2,18% v/p) is constituted mainly of oxygenated compounds with isosafrole and nothosmyrnol as the major components. The oil showed a bactericidal effect against X. albilineans and X. campestris pv campestris and a fungistatic effect against A. solani. There are great opportunities for the development of the essential oil of P. marginatum as an antimicrobial agent, considering its high yield and activity against the microorganisms studied.
Key words: essential oil; Piper marginatum; antimicrobial activity; Cuba.
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INTRODUCCIÓN
La resistencia de los microorganismos a los fármacos y plaguicidas existentes, es un problema que tiende a incrementarse, razón por la cual se mantiene la búsqueda de nuevos antimicrobianos para combatir las enfermedades, superar los problemas de resistencia bacteriana y los efectos secundarios de algunos agentes disponibles (1,2). Desde el punto de vista fitosanitario, la demanda creciente de nuevos antimicrobianos responde también a la poca disponibilidad y/o eficacia de los productos existentes para el control de algunos patógenos. Estos problemas han llevado a la búsqueda de alternativas de control y una de las opciones que está en vía de desarrollo y explotación es el uso de antimicrobianos de origen natural y, dentro de ellos, los aceites esenciales tienen grandes potencialidades.
Piper marginatum Jacq., perteneciente al género Piper, familia Piperaceae, es una especie aromática que se encuentra distribuida a lo largo de toda la isla. Se le atribuyen propiedades medicinales: antiséptico, astringente, antihemorrágico y hemostático. Sus hojas contienen gran cantidad de aceite esencial, sustancias tánicas y sustancias de naturaleza alcaloidal de las cuales se derivan fundamentalmente sus propiedades medicinales (3). Sin embargo, el aceite esencial de esta especie constituye una alternativa prometedora y poco explorada en nuestro país como fuente de antimicrobianos y su futura aplicación requiere del desarrollo de investigaciones básicas sobre la química y la actividad biológica de estos compuestos que permitan establecer sus potencialidades, específicamente para el control de enfermedades microbianas de interés agrícola. El objetivo de este trabajo fue determinar la composición química del aceite esencial de P. marginatum, así como su actividad antimicrobiana frente a las bacterias Xanthomonas albilineans (Ashby) Dawson, Xanthomonas campestris pv campestris (Pammel) Dawson, Pseudomona solanacearum Smith, Pseudomona celebensis Gäumann, Pseudomona syzygii Roberts et al. y Pseudomona fluorescens Migula y frente al hongo Alternaria solani Sor.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención del aceite esencial
Las hojas de P. marginatum se recolectaron en la provincia de Guantánamo en el mes de mayo del 2009. El material vegetal se seleccionó, de forma tal que no estuviera dañado, y se procesó fresco. El aceite esencial se extrajo por el método de hidrodestilación empleando un equipo Clevenger según lo establecido en la norma ISO 65-71:84 (4), durante tres horas. El aceite se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se guardó en frío hasta su análisis.
Se calculó el rendimiento mediante la expresión: ]]>
R = (V/M)*100; donde: R: rendimiento (%), V: volumen del aceite esencial (mL) y M: masa del material vegetal (g).Determinación de la composición química
La composición química del aceite se determinó en un cromatógrafo de gases de la serie Agilent 6890 con un inyector del tipo «split splitless» (relación de split 20:1), acoplado con un espectrómetro de masas de la serie Agilent 05973; ambos provenientes de la firma Agilent Technologies. Se utilizó una columna capilar SPB-5 (L=15m; DI=0,25mm; f=0,10mm) con una inyección de 2 mL. La temperatura del horno fue programada: 60°C (2 min isotérmicos), seguido de una rampa de calentamiento hasta 100ºC a razón de 4°C.min-1, otra rampa de 10°C.min-1 desde 100ºC hasta 250°C donde finalmente permaneció durante 5 min isotérmicos. Se usó helio como gas portador con un flujo constante de 1 mL.min-1. El espectrómetro de masas trabajó en modo scan de adquisición a 70 eV. Se utilizó un analizador cuadrupolar a 150ºC de temperatura del cuadrupolo, el detector trabajó en un rango de masas de hasta 800 uma, las temperaturas de la interfase y de la fuente fueron 280°C y 230°C respectivamente. La identificación de los compuestos se realizó mediante el uso combinado de las bases de datos automatizadas NBS-NISTASCI y Wiley 275.
Ensayos de actividad antibacteriana
Se utilizaron las bacterias fitopatógenas X. albilineans (cepa JR), X. campestris pv campestris (cepa XC2), P. solanacearum (cepas 653, 888, 890 y 155), P. celebensis (cepas 223 y 224), P. syzygii (cepas 001 y 008) y P. fluorescens (cepa 042), perteneciente al cepario de bacterias del Laboratorio de Bacteriología Vegetal del CENSA.
Las bacterias se sembraron en medio Agar Nutriente (Biocen), con excepción de X. albilineans, que se sembró en medio Wilbrink (BDH) y se incubaron a 28ºC durante 48 horas. Una vez activadas se prepararon suspensiones bacterianas, hasta lograr una concentración de inóculo de 1-2 x 1010 UFC.mL-1. De este inóculo se tomaron alícuotas de 20 mL y se colocaron en placas estériles con 20 mL del medio agarizado.
Para evaluar la sensibilidad de estos microorganismos al aceite esencial se empleó el método de difusión en agar según la técnica estandarizada por el Comité Nacional para Normas de Laboratorios Clínicos (5), basada en el método de Kirby-Bauer. Pequeños discos de papel de filtro de 6 mm de diámetro fueron cuidadosamente depositados de forma equidistante sobre el medio inoculado con las suspensiones bacterianas y posteriormente se les adicionó 10 µL del aceite. Se colocaron cuatro papeles impregnados con esta dosis del aceite por placa. Las bacterias fueron incubadas durante 48 horas (28°C). Una vez transcurrido este tiempo se midió el halo de inhibición del crecimiento bacteriano y la inhibición se clasificó según la escala de Toda et al. (6). La evaluación se realizó por cuatriplicado y se empleó un control del crecimiento bacteriano.
Posterior a este experimento se procedió a la evaluación de la actividad antibacteriana de aquellas especies que mostraron sensibilidad. Se utilizó el mismo método y se adicionó 10; 5; 2,5 y 1 µL del aceite. Se colocaron dos papeles impregnados en cada dosis de los extractos y dos papeles control (sin extracto) en cada placa. La temperatura y tiempo de incubación coincidieron con el experimento anterior. La evaluación se realizó por cuatriplicado, se empleó un control del crecimiento bacteriano para cada bacteria y controles positivos de Kanamicina (10 µg/disco) (MINSAP) y Gentamicina (10 µg/disco) para X. albilineans y X. campestris pv. campestris respectivamente.
Determinación de la actividad antifúngica
Se utilizó el hongo fitopatógeno A. solani perteneciente al cepario del Laboratorio de Micología Vegetal del CENSA. El hongo se sembró en medio Agar Papa Dextrosa (Biocen) y se incubó a 28ºC (72 horas). ]]>
El efecto antifúngico por contacto directo del aceite se determinó empleando el método de discos de micelio. En cada placa se vertieron 10 mL de Agar Papa Dextrosa y a continuación se depositaron cuatro discos de papel de filtro de 6 mm de diámetro de forma equidistante sobre el medio solidificado. A cada disco se le añadieron 10 mL del aceite esencial y se empleó agua destilada estéril como control negativo. Por último, se colocó sobre cada disco de papel de filtro un disco de micelio. La temperatura y el tiempo de incubación fueron de 28°C y 72 horas respectivamente. Una vez transcurrido este tiempo se midió el diámetro de crecimiento del micelio.Posteriormente, los discos de micelio se invirtieron y transcurridos 10 días se observó si existía crecimiento del fitopatógeno.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El rendimiento del aceite de P. marginatum fue de 2,18 % (v/p). Se plantea que aceites esenciales con más de 1% de rendimiento se pueden obtener en cantidades suficientes para su comercialización a gran escala (7). Teniendo en cuenta este criterio, el aceite evaluado tiene potencialidades para el desarrollo de un producto cuya obtención sea económicamente factible, por el elevado valor del rendimiento obtenido.
Desde el punto de vista químico, de los 33 componentes detectados fueron identificados total o parcialmente 28, lo que representa un 99,9 % de la composición del aceite (Tabla 1).
En este aceite los compuestos oxigenados representan el 98,28 % y el resto corresponde a hidrocarburos sesquiterpénicos. Dentro de esta cantidad considerable de compuestos oxigenados los principales desde el punto de vista de cantidades relativas son el isosafrol (37,31 %) y el notosmirnol o isosmorizol (22,72 %), se encuentran además el metil eugenol (7,32 %) y un derivado de este (7,5 %), el safrol (7,02 %), la trans- a- asarona (5,88 %) y la miristicina (4,33 %) (Figura 1, Figura 2).
La composición química del aceite de esta especie muestra gran variabilidad en cuanto a los componentes principales; así tenemos que se informó 80,5% de trans-anetol como componente mayoritario de este aceite (8). Ramos et al. (9) determinaron la composición química de los aceites esenciales extraídos de hojas y tallos de P. marginatum de la región amazónica de Brasil e informaron como componentes mayoritarios de las hojas 3,4-metileno-dioxi propiofenona (8,01%) y b-cariofileno (4,01%) y como componentes mayoritarios de los tallos: miristicina (9,23%), 3,4-metileno-dioxi propiofenona (8,92%) y b-cariofileno (5,57%).
Más recientemente en un estudio realizado con diferentes quimiotipos de la especie informaron safrol y 3,4-metileno-dioxi propiofenona como principales constituyentes del quimiotipo I. En el quimiotipo II predomina 3,4-metileno-dioxi propiofenona y p-menta-1,8 dieno. Los mayores componentes identificados en el quimiotipo III fueron 3,4-metileno-dioxi propiofenona, miristicina, E-â-ocimeno y ã-terpineno. En el quimiotipo IV los principales constituyentes fueron b-cariofileno, a-copaeno y 3,4-metileno-dioxi propiofenona; por su parte, en el quimiotipo V predominó E-isosmorizol y E-anetol; en el quimiotipo VI se encontró fundamentalmente 2-metoxi-4,5-metileno-dioxi propiofenona y E-isosmorizol, mientras que en el quimiotipo VII se identificó como componentes mayoritarios â-cariofileno, biciclogermacreno y E-asarona (10).
Los resultados obtenidos coinciden con los informados por estos autores en cuanto a la presencia de algunos de los componentes separados e identificados, aunque difieren en las cantidades relativas; sin embargo, el perfil químico del aceite evaluado no puede ser asociado con ninguno de estos quimiotipos. ]]>
Las diferencias encontradas en cuanto a la composición del aceite esencial estudiado y la informada por otros autores para esta especie, pueden estar asociadas a varios factores, entre ellos: las condiciones geobotánicas del medio (clima, altitud, tipo de suelo, precipitaciones, etc), método de cultivo, época de recolección y parte de la planta recolectada, manejo y almacenamiento del material vegetal (seco, fresco, etc), edad y estado fenológico de la planta, así como el método de obtención del aceite (11,12).La composición química de los aceites se encuentra estrechamente relacionada con su actividad biológica y el aceite de P. marginatum mostró una actividad antibacteriana promisoria frente a X. albilineans y X. campestris pv. campestris, con una inhibición total del crecimiento de ambas bacterias al emplear 10 µL del aceite puro, no así para el resto de las bacterias estudiadas.
Para profundizar más en el estudio del aceite frente a las bacterias que mostraron sensibilidad se disminuyeron las dosis a evaluar. Frente a X. albilineans se observó una marcada inhibición del crecimiento bacteriano; con un ligero crecimiento en el borde de las placas hacia la parte de los discos controles. Esta inhibición fue significativamente superior a la observada en el control positivo de Kanamicina (10µg/disco) (diámetro halo de inhibición= 18 mm). En el caso de X. campestris pv. campestris, a las dosis evaluadas, hubo un crecimiento total de la bacteria (Figura 3). Estos resultados demuestran que X. albilineans es la bacteria más sensible a la acción del aceite esencial.
El efecto de la esencia sobre A. solani se puso de manifiesto por la inhibición del crecimiento del micelio en el caso del contacto directo en la primera etapa de evaluación (Figura 4). Sin embargo, al invertir los discos de micelio, no se observó actividad, lo que indica un efecto fungistático y no fungicida del aceite. Estos resultados abren nuevas perspectivas para el manejo de este fitopatógeno.
En general, las propiedades antimicrobianas de los aceites esenciales han sido reconocidas durante muchos años y particularmente, existen estudios relacionados con la actividad antimicrobiana de las especies de Piper; generalmente encaminadas al control de enfermedades infecciosas importantes en humanos como: Staphylococcus aureus Rosenbach, Pseudomona aeruginosa Schroeter, Escherichia coli Migula y los hongos Candida albicans (C.P. Robin) Berkhout, Aspergillus flavus Link y Aspergillus fumigatus Fresenius (13). En cuanto a la relación estructura actividad de estos aceites, existe poca información pero algunos autores coinciden en que la actividad antimicrobiana presentada por los mismos se debe, en gran medida, a la presencia de terpenoides (14,15); fundamentalmente los que contienen grupos alcoholes, aldehídos y cetónicos (16, 17,18). El aceite de P. marginatum está constituido en un 99,9 % por compuestos oxigenados y se pudiera atribuir la actividad biológica observada a sus componentes fundamentales: el notosmirnol, con dos grupos alcohólicos y el fenilpropanoide safrol, a quien se le atribuyen propiedades antimicrobianas.
A pesar del volumen de información existente sobre las características químicas y las propiedades antimicrobianas de especies de este género, la composición química del aceite esencial de P. marginatum, se informa por primera vez en nuestro país. De igual forma, no existen precedentes de su acción frente a las bacterias y el hongo en estudio. Estos resultados son particularmente importantes si consideramos que X. albilineans y X. campestris pv. campestris provocan enfermedades de importancia para el cultivo de la caña de azúcar y hortalizas, respectivamente. X. albilineans provoca la enfermedad llamada escaldadura foliar, considerada la enfermedad bacteriana más importante del cultivo de la caña de azúcar y causante de pérdidas millonarias en la producción cañera de Cuba y el mundo (19), mientras que X. campestris pv. campestris, es la responsable de la pudrición negra de las crucíferas, enfermedad de mayor importancia en estos cultivos (20). Por otra parte, A. solani afecta varios cultivos de importancia económica entre ellos la papa y el tomate, provocando la enfermedad conocida como tizón temprano, que puede llegar a causar estragos desbastadores (21).
Nuevos antimicrobianos, basados en el aceite esencial de P. marginatum, podrían constituir una alternativa para el manejo de plagas de importancia agrícola, tomando en consideración la amplia disponibilidad y facilidad de cultivo de la especie, el elevado rendimiento de extracción de su aceite esencial y actividad biológica frente a microorganismos, así como la gravedad de las afectaciones provocadas por los fitopatógenos estudiados.
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