Efecto del aceite esencial de Piper auritum Kunth y sus componentes sobre Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson y Xanthomonas campestris pv. campestris (Pammel) Dowson
Effect of the essential oil of Piper auritum Kunth and its components against Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson and Xanthomonas campestris pv campestris (Pammel) Dowson
Yaíma SánchezI, Teresa M. CorreaII, Yudith AbreuI, Oriela PinoI
IDepartamento de Plagas Agrícolas, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) Apartado 10, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. Correo electrónico: ysanchez@censa.edu.cu.
IILaboratorio Anti-doping, Instituto de Medicina Deportiva (IMD). Dirección Postal: 100 y Aldabó, Boyeros, La Habana, Cuba. ]]>
RESUMEN
El objetivo de este trabajo fue identificar el(los) componente(s) del aceite esencial de Piper auritum asociado(s) al efecto antibacteriano sobre Xanthomonas albilineans y Xanthomonas campestris pv. campestris. El aceite esencial de P. auritum se obtuvo por hidrodestilación empleando un equipo Clevenger. Se realizó la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB) por el método de las diluciones seriadas frente a ambas bacterias. Se identificaron los componentes responsables de la actividad biológica mediante el análisis por CG/EM y evaluación de la actividad antibacteriana de las fracciones del aceite esencial, obtenidas por cromatografía seca. El aceite mostró una fuerte actividad antibacteriana con CMI y CMB de 0,12 y 0,25 mg.ml-1 frente a X. albilineans y X. campestris pv. campestris, respectivamente. El principal componente responsable de la actividad biológica observada fue el safrol; sin embargo, el aceite esencial en su conjunto reúne todos los requisitos para ser utilizado como antibacteriano promisorio.
Palabras clave: aceite esencial, Piper auritum, Xanthomonas albilineans, Xanthomonas campestris pv. campestris, productos naturales.
ABSTRACT
The aim of this study was to identify the component (s) of the essential oil of Piper auritum associated with the antibacterial effect against Xanthomonas albilineans and Xanthomonas campestris pv. campestris. The essential oil of P. auritum was obtained by hydrodistillation in a Clevenger type apparatus. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and the Minimum Bactericidal Concentration (MBC) against both bacteria were determined by the method of serial dilutions. The components responsible for the biological activity were identified by fractionating the essential oil by dry chromatography, and the fractions were investigated by GC / MS and tested against the above mentioned bacteria. This oil has a strong antibacterial activity with MIC and MBC of 0,12 and 0,25 mg.ml-1 against X. albilineans and X. campestris pv. campestris, respectively. The principal component responsible for the observed biological activity was safrole; however, the whole essential oil met all the requirements for being used as a promissory antibacterial agent.
Key words: essential oil; Piper auritum; Xanthomonas albilineans; Xanthomonas campestris pv. campestris; natural products.
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INTRODUCCIÓNEl género Piper ha sido objeto de estudios fitoquímicos y biológicos, motivados por sus numerosas aplicaciones etnobotánicas (1) y por ser particularmente útiles como antivirales, antimicóticos y antibacterianos (2,3,4). Existen estudios relacionados con la actividad antimicrobiana de las especies de Piper, pero generalmente encaminados al control de agentes etiológicos de enfermedades infecciosas importantes en humanos, como Staphylococcus aureus Rosenbach, Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn, Pseudomona aeruginosa (Schroeter) Migula, Pseudomonas putida Trevisan, Escherichia coli (Theodore von Escherich) Migula y los hongos Candida albicans (C.P. Robin) Berkhout, Aspergillus niger P.E.L. Van Tieghem, Aspergillus flavus Link y Aspergillus fumigatus Fresenius (5,6).
Dentro de este género se destaca la especie Piper auritum Kunth, natural de México, América Central, América del Sur y las Antillas y naturalizada en toda Cuba (7). Se estudió extensamente la actividad insecticida, antibacteriana y antifúngica de diferentes extractos de la planta, dentro de ellos, sus aceites esenciales (8,9,10). Existe información relacionada con las propiedades antibacterianas de esta especie sobre Mycobacterium tuberculosis Koch, Mycobacterium smegmatis Lehmann y Neumann y B. subtilis (11,12). La acción de su aceite esencial frente a bacterias fitopatógenas fue menos estudiada, aunque se informó su efecto sobre Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson (los serovares I y III) y Acidovorax avenae subsp. avenae (Manns) Willems et al. (4,9).
X. albilineans es la responsable de la escaldadura foliar, considerada la enfermedad bacteriana más importante del cultivo de la caña de azúcar (13), mientras que Xanthomonas campestris pv. campestris (Pammel) Dawson es la responsable de la pudrición negra de las crucíferas; enfermedad de relevancia en estos cultivos (14). Resultan insuficientes aún las opciones para el control de estas enfermedades bacterianas, y la búsqueda de alternativas, basadas en productos naturales, específicamente en aceites esenciales y sus componentes; podría ofrecer solución a algunos de los problemas que actualmente existen, lo que resultará de inestimable valor para la protección fitosanitaria de los sistemas afectados.
El objetivo de este trabajo fue identificar el(los) componente(s) del aceite esencial de P. auritum asociado(s) al efecto antibacteriano sobre X. albilineans y X. campestris pv. campestris; responsables de daños en los cultivos de caña de azúcar y crucíferas, respectivamente, en Cuba y el resto del mundo.
Obtención del aceite esencial
Las hojas de P. auritum se recolectaron en la provincia de Mayabeque entre los meses de enero a octubre del 2009. El material vegetal se procesó fresco. El aceite esencial se extrajo por el método de hidrodestilación, empleando un equipo Clevenger según lo establecido en la norma ISO 65-71:84 (15), durante tres horas. El aceite se secó sobre sulfato de sodio anhidro (puro para análisis, AppliChem) y se almacenó a 4ºC hasta su análisis.
Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) del aceite esencial
Se utilizaron las bacterias fitopatógenas X. albilineans (JR) y X. campestris pv. campestris (XC2) pertenecientes al cepario del Laboratorio de Bacteriología Vegetal del CENSA. La bacteria X. albilineans se aisló de muestras procedentes de la Estación Territorial de Investigaciones de la Caña de Azúcar de Jovellanos y se identificó mediante métodos moleculares (16); mientras que X. campestris pv. campestris, procedente de muestras de tomate, se aisló y caracterizó mediante técnicas morfológicas y bioquímicas en el Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal (INISAV). ]]>
X. albilineans se sembró en medio Wilbrink (BDH) y se incubó a 28ºC durante 48 horas, mientras que X. campestris pv. campestris se sembró sobre placas de agar nutriente (Biocen) y se incubó a igual temperatura durante igual período de tiempo. Una vez activadas las bacterias, se prepararon suspensiones bacterianas en solución salina estéril (Cloruro de sodio (Merck) al 0,85%), hasta lograr una concentración de inóculo de 1-2 x 1010 Unidades Formadoras de Colonias (UFC)/ml, equivalente a una densidad óptica de 1, a una longitud de onda de 540 nm en un espectrofotómetro (T90 + UV/Vis Spectrometer PG Instruments Ltd).Se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del aceite. La CMI se estableció usando el método de las diluciones seriadas (17). Las pruebas se realizaron en medio líquido Wilbrink, utilizando Tween 80 (Merck) (0,5%) como agente solubilizante. Diluciones dobles seriadas del aceite se prepararon en tubos de ensayo, a partir de una solución madre al 0,4% (rango de concentraciones de 0,025 a 0,4%).
Los tubos se inocularon con las suspensiones bacterianas, ajustando la concentración para que cada tubo contuviera aproximadamente 1-2 x 108 UFC.ml-1 después de la inoculación. Cada prueba se realizó por triplicado y se incluyeron controles de crecimiento bacteriano que contenían Tween 80 en igual concentración. La temperatura y tiempo de incubación fueron los establecidos para el crecimiento de las bacterias. La CMI se determinó como el primer tubo, en orden ascendente de concentraciones, en el cual no se observó cambio de turbidez.
La confirmación de las CMI y el establecimiento de la CMB se realizaron removiendo 20 µl de cada tubo donde no se observó crecimiento e inoculándolos en placas frescas de medio sólido. La CMB se determinó como la concentración capaz de inhibir el 99,9% o más de las bacterias.
Fraccionamiento del aceite esencial
El aceite esencial (1 ml) se fraccionó usando una columna seca de Sílica Gel 60H (Merck) (30 g) empaquetada en un embudo con frita (porosidad 3, diámetro 40 mm). Como fase móvil se utilizaron combinaciones de Hexano y EtOAc de polaridad creciente: Hexano (100%), EtOAc/Hexano (2,5%; 5% y 10% de EtOAc en Hexano) y EtOAc (100%); sistema de fase móvil óptimo para lograr un perfil de separación de los componentes del aceite según un análisis de Cromatografía de Capa Delgada (CCD) anterior, finalmente la columna se lavó con metanol. Los reactivos utilizados fueron de calidad puro para análisis, provenientes de la firma Merck. Se recolectaron 6 fracciones de 25 ml. Estas fracciones se secaron por separado y se determinó su masa y rendimiento.
Determinación de la composición química
La composición química del aceite y sus fracciones se determinó en un cromatógrafo de gases de la serie Agilent 6890 con un inyector del tipo «split splitless» (relación de split 20:1), acoplado con un espectrómetro de masas de la serie Agilent 05973; ambos provenientes de la firma Agilent Technologies. Se utilizó una columna capilar SPB-5 (L=15m, DI=0,25mm, f=0,10mm) con una inyección de 2 ml. La temperatura del horno se programó: 60°C (2 min isotérmicos), seguido por una rampa de calentamiento hasta 100ºC a razón de 4°C.min-1 y otra de 10°C.min-1 desde 100ºC hasta 250°C, donde finalmente permaneció durante 5 min isotérmicos. Se usó helio como gas portador con un flujo constante de 1,0 ml.min-1. El espectrómetro de masas trabajó en modo scan de adquisición a 70 eV. Se utilizó un analizador cuadrupolar a 150ºC de temperatura del cuadrupolo. El detector trabajó en un intervalo de masas hasta 800 uma, las temperaturas de la interfase y de la fuente fueron 280°C y 230°C respectivamente. La identificación de los compuestos se realizó mediante el uso combinado de las bases de datos automatizadas NBS-NISTASCI y Wiley 275.
Ensayo de actividad antibacteriana del aceite y sus fracciones
Para evaluar la sensibilidad de estos microorganismos al aceite esencial y sus fracciones se empleó el método de difusión en agar, según la técnica estandarizada por el Comité Nacional para Normas de Laboratorios Clínicos (18), basada en el método de Kirby-Bauer. ]]>
Discos de papel de filtro Whatman de 6 mm de diámetro se depositaron cuidadosamente de forma equidistante sobre el medio inoculado con 20 µl de las suspensiones bacterianas (concentración de inóculo de 1-2 x 1010 UFC.ml-1) y posteriormente se les adicionó 10; 5 y 2,5 µl del aceite y sus fracciones. Se colocaron dos papeles impregnados en cada dosis de los extractos y dos papeles control (sin extracto) en cada placa. Las bacterias se incubaron durante 48 horas a 28°C. Una vez transcurrido este tiempo se midió el halo de inhibición del crecimiento bacteriano. La evaluación se realizó por cuatriplicado y se empleó un control del crecimiento bacteriano y controles positivos de Kanamicina (10 µg/disco) y Gentamicina (10 µg/disco), producidos por el Ministerio de Salud Pública (MINSAP, Cuba), para X. albilineans y X. campestris pv. campestris respectivamente.En el bioensayo se emplearon las soluciones obtenidas al disolver por separado los residuos correspondientes a cada fracción en el mismo volumen de acetona (puro para análisis, Merck). Se utilizó un control de acetona. Los resultados de las diferentes dosis del aceite evaluadas y sus fracciones, se compararon a través de un análisis de varianza, empleando la prueba de rangos múltiples de Duncan, paquete estadístico SAS 9.0.
Aligiannis et al. (19) consideraron que la actividad antibacteriana es fuerte cuando los valores de CMI se encuentran entre 0,05-0,5 mg.ml-1, moderada para valores entre 0,6- 1,5 mg.ml-1 y valores superiores a 1,5 mg.ml-1 corresponden con una actividad débil. La actividad del aceite de P. auritum sobre las dos bacterias estudiadas es fuerte, con CMI, que coincide con la CMB en ambos casos, de 0,12 y 0,25 mg.ml-1 frente a X. albilineans y X. campestris pv. campestris respectivamente.
Este resultado es importante desde el punto de vista práctico, si se consideran las afectaciones ocasionadas por estas bacterias en la agricultura. Además, las medidas fitosanitarias y la disponibilidad de productos eficaces para su manejo, son insuficientes, lo que aumenta la necesidad de nuevas alternativas para la disminución de las pérdidas que ellas ocasionan.
Las fracciones de P. auritum con mayor actividad frente a X. albilineans fueron F4 y F5, con una inhibición total del crecimiento bacteriano a la máxima dosis evaluada. En el caso de X. campestris pv. campestris solamente fue ligeramente activa la fracción F4. Se destacan además, con una actividad elevada frente a X. albilineans las fracciones F3 y F6 (Tabla 1). Estas fracciones coinciden con el mayor contenido de compuestos oxigenados en el fraccionamiento, específicamente safrol (Figura).
La actividad antimicrobiana presentada por los aceites esenciales se debe, en gran medida, a la presencia de terpenoides (20), fundamentalmente los que contienen grupos oxigenados (21,22). De igual forma, se demostró el efecto antimicrobiano de fenilpropanoides presentes en aceites esenciales (10), su carácter lipofílico es capaz de afectar la fluidez y permeabilidad de las membranas celulares (23) y pueden inhibir enzimas o procesos celulares específicos (24).
En todas estas fracciones, al igual que en el aceite puro, el componente mayoritario es el fenilpropanoide safrol; en el caso de las fracciones F4 y F5, están constituidas por un 100 % de safrol y coinciden con una mayor inhibición del crecimiento bacteriano (Tabla 2). La fracción 4 resultó ser la más activa frente a ambas bacterias. Esta diferencia se debe a que esta fracción es la de mayor rendimiento en el fraccionamiento, por lo que la cantidad de safrol es superior a la del resto de las fracciones. La fracción F1, a pesar de tener un contenido de safrol de aproximadamente 82%, su rendimiento fue tan bajo que la cantidad total no resultó suficiente para provocar la inhibición a las dosis evaluadas.
El safrol es uno de los componentes a los que se le atribuyen propiedades antibacterianas (9,25,26), pero no es el único, existen otros como el linalol, timol, carvacrol, eugenol, a-pinene y b-pinene, a-humuleno, b-cariofileno, b-elemeno, germacreno, p-cimeno, g-terpineno, mirceno, entre otros (27,28), algunos de los cuales se encuentran en el aceite de caisimón de anís evaluado y sus fracciones.
El aceite sin fraccionar logra una mayor inhibición del crecimiento bacteriano que sus fracciones por separado, lo que sugiere que existen otros componentes que potencian la acción del safrol dentro del aceite. Se plantea que algunos compuestos que no presentan actividad antimicrobiana de manera independiente, incrementan la acción cuando se mezclan con otros (29). ]]>
Además de las propiedades antibacterianas del safrol, se demostró que puede actuar como sinergizante (30,31) y esta pudiera ser la causa de la mayor actividad antibacteriana del aceite inicial, pues es capaz de potenciar la actividad de otros agentes antimicrobianos presentes en el aceite. Se reconoce que en mezclas de compuestos como los aceites esenciales, la interacción entre los componentes resulta importante en la determinación de la actividad biológica y por lo general son varios los constituyentes responsables del efecto (29,32).Teniendo en cuenta todos estos antecedentes encontrados en la literatura consultada y los resultados obtenidos, se pudiera atribuir al safrol la mayor contribución a la acción bactericida y/o bacteriostática del aceite esencial de P. auritum. Esto permite disponer de un conocimiento sobre la composición química de los aceites que se correlaciona con el efecto biológico deseado, aspecto importante para enfrentar el reto que representa la estandarización de mezclas complejas de materiales vegetales.
Sin embargo, la mayor actividad del aceite en comparación con sus fracciones resulta importante desde el punto de vista económico. En la práctica, la adición de pasos de fraccionamiento en el proceso de obtención de principios activos para el desarrollo de plaguicidas, encarece el proceso de producción; y resulta conveniente que en estos casos el principio activo sea precisamente la mezcla de componentes que constituyen el aceite y no uno o varios de ellos por separado. El conocimiento de los componentes responsables de la actividad representa un elemento clave a tener en cuenta para el monitoreo del principio activo del antibacteriano a desarrollar, pues permite contar con indicadores específicos para el control de la calidad en la obtención de productos eficaces y confiables.
Todo esto, unido a la posibilidad de producción de este aceite en cantidades adecuadas sobre bases sostenibles, tanto por la disponibilidad de materia prima (biomasa abundante silvestre y cultivable), como por el proceso de obtención (relativamente simple), hacen del aceite esencial de P. auritum un candidato promisorio para el desarrollo de antibacterianos destinados al control de la escaldadura foliar de la caña de azúcar y la podredumbre negra de las crucíferas.
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Recibido: 6-9-2013.
Aceptado: 30-10-2013. ]]>
