Sobreexpresión de genes en la interacción de Spongospora subterranea (Wallr.) Lagerh. y dos cultivares de Solanum phureja Juz. et. Buk
Verónica Rodríguez FuerteI, Mauricio Marín MontoyaI, Juan Gonzalo Morales OsorioII, José Miguel Cotes TorresII, Pablo Andrés Gutiérrez SánchezI
IUniversidad Nacional de Colombia - Sede Medellín, Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias, Laboratorios de Microbiología Industrial y Biología Celular y Molecular, Calle 59A No 63-20, Medellín, Colombia. Correo electrónico: verodriguezf@gmail.com, mamarinm@unal.edu.co, paguties@unal.edu.co.
IIUniversidad Nacional de Colombia - Sede Medellín, Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Ciencias Agronómicas, Laboratorio de Mejoramiento Genético de Plantas, Calle 59A No 63-20, Medellín, Colombia. Correo electrónico: jgmoraleso@unal.edu.co, jmcotes@unal.edu.co.
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RESUMEN
Con el fin de contribuir a un mejor conocimiento de los mecanismos que rigen la interacción entre Solanum phureja Juz. et. Buk. y Spongospora subterranea (Wallr.) Lagerh, agente causal de la sarna polvosa de la papa, se realizó en esta investigación el análisis del transcriptoma de dos cultivares: Criolla Colombia (susceptible) y Criolla Latina (tolerante), mediante pirosecuenciación 454. Los resultados indicaron diferencias entre los genes sobreexpresados en cada cultivar ante la infección con el patógeno. En el cultivar susceptible, la respuesta ocurre a partir de la activación transcripcional de genes asociados a la integridad de la pared celular, transducción de señales y genes involucrados en la respuesta a diferentes tipos de estrés. Los genes que codifican para metalotioneína (3297 veces), fosfatasa 2C (2128 veces) y un inhibidor de pectinmetilesterasa (2127 veces) fueron los más sobreexpresados en este cultivar. Por su parte, en el cultivar tolerante los niveles de sobreexpresión de genes fueron moderados, con sólo dos genes (un gen putativo y a-Galactosidasa) siendo transcritos más de 1000 veces, con respecto a las plantas sin inocular. Estos resultados sugieren que la tolerancia a S. subterranea de este cultivar, incluye también mecanismos de defensa constitutivos. Finalmente, mediante ensayos de qRT-PCR se confirmó la sobreexpresión de tres de los genes identificados en el transcriptoma del cultivar Criolla Latina.
Palabras clave: NGS, PCR en tiempo real, sarna polvosa, transcriptoma.
ABSTRACT
For a better understanding of the molecular mechanisms involved in the interaction between Solanum phureja Juz. et. Buk. and Spongospora subterranean (Wallr.) Lagerh, the causal agent of powdery scab disease, a 454 transcriptome analysis was carried out using one susceptible (Criolla Colombia) and one tolerant (Criolla Latina) potato cultivars. The results revealed a marked difference in the overexpression pattern for each cultivar. In the susceptible cultivar, the response was based on the activation of genes associated with cell-wall integrity, signal transduction and stress-related genes. The most overexpressed genes were those coding for methalothionein (3297 times), phosphatase 2C (2128 times) and a pectin methylesterase inhibitor (2127 times). Overexpression in the tolerant cultivar was moderate with only two genes (a putative gene and a-Galactosidase) being transcribed more than 1000 times compared with the non-inoculated control suggesting an important constitutive defense response. Overexpression of three genes in the Criolla Latina transcriptome was confirmed by qRT-PCR.
Key words: NGS, powdery scab, real time PCR, transcriptome.
INTRODUCCIÓN ]]>
La sarna polvosa es una de las enfermedades más limitantes del cultivo de la papa (Solanum tuberosum L. y Solanum phureja Juz et Buk) en Colombia y otros países del mundo (1). Esta enfermedad es causada por el protozoo Spongospora subterranea (Wallr.) Lagerh, un parásito obligado que se dispersa eficientemente a través de sus estructuras de resistencia (quistosoros) en los suelos. La sarna polvosa afecta tanto el sistema radicular de las plantas como la calidad de los tubérculos, reduciendo los rendimientos de los cultivos y la posibilidad de comercializar los tubérculos o de utilizarlos como semilla (2). S. subterranea es además el vector del virus mop-top de la papa (Potato mop-top virus, Pomovirus), lo que genera un mayor impacto sobre los cultivos infectados con este protozoo (3).La sarna polvosa fue descrita por primera vez en 1841 en Alemania y desde entonces se expandió rápidamente a las zonas productoras de papa de todo el mundo (2). En Colombia, esta enfermedad fue informada en 1965 por Orjuela (4) y en la actualidad afecta cultivos en los departamentos de Boyacá, Cundinamarca, Nariño y Antioquia, donde puede ocasionar pérdidas entre 30 y 80%, dependiendo de la susceptibilidad de los cultivares, los genotipos del patógeno y las condiciones medioambientales que rigen su interacción (5, 6).
A pesar del fuerte impacto que ocasiona este patógeno en la agroindustria de producción de papa, existen pocas alternativas efectivas para su manejo, dada la ausencia de cultivares comerciales resistentes, a la latencia en el suelo de sus quistosoros y a su difícil detección en tubérculos-semilla asintomáticos (1). El tratamiento químico de suelos infestados con el patógeno mostró ser muy poco rentable, altamente contaminante y de baja efectividad (2). Por esto, se considera que las estrategias para manejar la sarna polvosa, deben incluir la combinación de medidas como la rotación de cultivos, la siembra de tubérculo-semilla certificados en suelos no contaminados y la siembra de clones tolerantes/resistentes a S. subterranea (2,7). Aparentemente, la resistencia a la sarna polvosa ocurre bajo control poligénico (2), siendo identificadas algunas fuentes de resistencia en las especies silvestres Solanum bulbocastanum Dunal y Solanum hougasii Corr.(8, 9). En Colombia, recientemente Ramírez et al. (10), realizaron una evaluación en invernadero de la resistencia a la sarna polvosa de 105 genotipos de S. phureja (papa criolla), encontrando que el material más susceptible correspondió al cultivar comercial Criolla Colombia, mientras que 30 genotipos se presentaron como altamente resistentes, al no presentar síntomas de la enfermedad ni signos del patógeno después de 75 días de la inoculación. En dicho estudio también se destacó que dos de los cultivares (Criolla Paisa y Criolla Latina) fueron definidos como tolerantes a la enfermedad, al presentar niveles de incidencia de sarna polvosa inferiores al 20%, lo cual fue confirmado posteriormente en evaluaciones bajo condiciones de campo, en donde dichos cultivares presentaron un bajo número de agallas en raíces (10).
En los últimos años, se desarrollaron metodologías moleculares de alto rendimiento para obtener una gran proporción, o la totalidad, de las secuencias del genoma de un organismo o de los transcriptos que se expresan bajo diferentes condiciones de evaluación. Dichas tecnologías se conocen en forma genérica como Secuenciación de Nueva Generación (NGS), siendo algunas basadas en principios de pirosecuenciación (11). Existen diferentes formatos de NGS, incluyendo 454 LifeSciences (Roche, Suiza), illumina (Illumina Inc, EEUU) y Solid (Applied Biosystems, EEUU) (12).
En el campo agronómico, estas metodologías ofrecen la posibilidad de evaluar la expresión de genes en plantas sometidas a diferentes condiciones abióticas y bióticas, como por ejemplo la infección por un microorganismo fitopátogeno. Sin embargo, hasta el momento no se cuenta con información sobre los genes y/o mecanismos implicados en las reacciones de defensa de los genotipos de S. phureja a S. subterranea, a pesar de que, dos cultivares de esta especie (Criolla Colombia y Criolla Latina), mostraron fenotipos contrastantes por su resistencia al patógeno. El objetivo de este estudio fue evaluar la sobreexpresión de genes en ambas variedades como resultado de la infección por S. subterranea utilizando el sistema NGS 454 LifeSciences y la posterior confirmación de dicha sobreexpresión en seis genes, mediante RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR).
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Para este estudio se utilizaron dos cultivares de la especie S. phureja: Criolla Latina y Criolla Colombia, identificadas previamente en bioensayos como tolerante y susceptible a S. subterranea, respectivamente (10). Las plántulas evaluadas se obtuvieron a partir de esquejes de tallo lateral, siguiendo el procedimiento de Cotes y Ñustez (13). Para ello, se sembraron los tubérculos-semilla de cada cultivar y dos semanas después de la germinación se indujo la producción de esquejes de tallo lateral por corte del meristemo apical. Luego de 15 días, se extrajeron los esquejes producidos, haciendo un corte transversal en su base y posteriormente se indujo el enraizamiento con aplicación de hormonas vegetales (Hormonagro No. 1; Colinagro, Colombia), sembrándose en bandejas con arena estéril.
El ensayo se realizó bajo condiciones de casa-malla en el Laboratorio de Mejoramiento Genético de Plantas en la Estación Agraria Paysandú de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín, corregimiento de Santa Elena (Medellín, Antioquia), ubicado a una altitud de 2550 msnm y con una temperatura media 14°C. El riego de las plántulas se realizó manualmente, hasta la capacidad de campo con una periodicidad de 3 días. ]]>
Inoculación y colección de tejidos infectadosSe obtuvo una solución de zoosporas de S. subterranea al inducir su liberación a partir de quistosoros procedentes del municipio de La Unión (Antioquia) presentes en agallas de raíces sumergidas en 150 ml de agua destilada a 20ºC durante 4 días. Después de este tiempo, se introdujeron las plántulas de ambos cultivares en la solución de zoosporas y se tomaron muestras de raíz de cada planta de forma aleatoria en diferentes tiempos después de la inoculación (1 hora post-inoculación (hpi), 3 hpi, 6 hpi, 12 hpi, 24 hpi y 48 hpi). Después de 48 hpi, las plantas se retiraron de la solución de zoosporas y se mantuvieron en solución nutritiva de Hoagland hasta el final del ensayo para evaluar la presencia de la enfermedad (30 días post-inoculación -dpi).
Para cada material, se utilizaron tres réplicas inoculadas y un testigo sometido a las mismas condiciones de crecimiento, pero sin inoculación de zoosporas. Las muestras y sus testigos fueron divididas en dos, la primera parte se tiñó con azul de tripano al 0,05% para la observación por microscopía óptica de estructuras y monitoreo del proceso de infección. La segunda parte se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -80°C hasta su uso posterior en las pruebas moleculares.
Aislamiento de ARNm y generación de librerías de ADNc
La extracción del ARN total se realizó utilizando el método del trizol-cloroformo (14),a partir de un conjunto de raíces seleccionadas para los diferentes tiempos de post-inoculación, generándose una librería para cada material inoculado y su respectivo testigo. Para esto, se pesó aproximadamente 1 g de raíz, se maceró con un mortero utilizando nitrógeno líquido y por cada 100 mg de tejido macerado se adicionó 1 ml de trizol (Invitrogen, EEUU). Luego se centrifugó a 12000 g por 10 min a 4ºC, se tomó el sobrenadante y se le adicionaron 200 µl de cloroformo por cada ml de trizol utilizado. Se agitó por 15 s, se incubó a temperatura ambiente durante 3 min y posteriormente se centrifugó por 15 min a 12000g y 4ºC. La fase acuosa fue transferida a un nuevo tubo y el ARN fue precipitado con 500 µl de isopropanol por cada ml de trizol. La mezcla anterior fue incubada a temperatura ambiente durante 10 min y posteriormente se centrifugó a 12000 g por 10 min a 4ºC. El ARN total fue lavado con etanol al 75%, utilizando 1ml por cada ml de trizol. El ARNm fue purificado con el kit Oligotex Direct mRNA (Qiagen, EEUU) y utilizado para la síntesis de ADNc con el kit DNA Synthesis System (Roche, Alemania), para así proceder a la preparación de las librerías con el sistema GS Rapid Library Prep (Roche, Alemania).
Cada librería para cada material inoculado con S. subterranea y su testigo no inoculado, fue marcado con adaptadores diferentes mediante el kit GS FLX Titanium Rapid Library MID (Roche, Alemania). Las librerías se titularon por fluorimetría utilizando el estándar del kit Library Prep-Rapid y Library Rgt/adaptors. El tamaño de los fragmentos se estimó con un equipo Bioanalyzer con el sistema Chip High Sensitivity DNA (Agilent, EEUU).
Pirosecuenciación
La amplificación de la librería genómica se llevó a cabo en fase sólida individualizando cada esfera y uniendo sólo una molécula de la librería. El ADN unido a las esferas fue amplificado por PCR en emulsión y sólo fueron utilizadas aquellas que hibridaron con el cebador de secuenciación. Para la carga de las esferas en el PTP (PicoTiter Plate) se utilizó centrifugación y el dispositivo BDD (Bead Deposition Device). El PTP se cargó en tres fases: primero se cargaron esferas recubiertas de las enzimas necesarias para la reacción de pirosecuenciación, en la segunda fase se cargaron las esferas con el ADN amplificado de la librería y finalmente se cargaron esferas recubiertas de pirofosfatasa.Para la secuenciación se utilizó un equipo GS FLX 454 (Roche, Alemania) y los reactivos TITANIUM (Roche, Alemania), haciendo 200 ciclos de los cuatro nucleótidos (nt).
Análisis bioinformático
Previo al ensamblaje de las secuencias, se eliminaron los adaptadores, el ARN ribosomal y las secuencias que presentaron una longitud inferior a 50 nucleótidos (nt), utilizando rutinas programadas en el lenguaje informático Perl, diseñadas específicamente para este fin. Las lecturas seleccionadas fueron ensambladas empleando el programa CAP3 usando los parámetros preestablecidos por defecto (15). Para la determinación de los niveles de sobreexpresión se construyó una base de datos no redundante con todas las secuencias de proteínas de papa depositadas en GenBank. Esta base de datos fue utilizada para cuantificar el número de ESTs (Expressed Sequence Tags) asociados a cada secuencia de proteína putativa mediante BLASTX y para contabilizar el número de lecturas que presentaron resultados significativos (hits) con las secuencias obtenidas en esta investigación. La información anterior fue utilizada para establecer los niveles relativos de abundancia de cada ARNm como se explica a continuación. En una librería de ADNc, la probabilidad de que un fragmento seleccionado corresponda al transcrito de un gen particular es: ]]>
donde: L corresponde a la longitud media de los fragmentos de la librería (lecturas), l a la longitud del CDS (Coding DNA Sequence), n es el número de copias de cada transcrito y T es el tamaño del transcriptoma definido como la sumatoria del número de copias, ni, copias, ni (i=1,2,…,N), de todas las N secuencias de ARNm presentes. Sí p es lo suficientemente pequeño, la probabilidad de que una secuencia de la librería sea muestreada k veces en un total de N fragmentos de la librería, se aproxima con una distribución de Poisson:
donde: P(k, µ) corresponde a la probabilidad de que un fragmento sea muestreado k veces y µ= N x g. Experimentalmente, el valor de g para un gen determinado se puede calcular a través del conteo del número de hits de BLAST para dicho gen dividido por N, lo cual resulta en la siguiente expresión:
donde: ai corresponde a la razón ni/T para el gen i; el valor de a puede ser determinado numéricamente a partir de la ecuación anterior utilizando procedimientos clásicos como el método Newton-Raphson (16). Si se asume que el valor de T es igual para dos librerías con subíndices i y j, la razón entre los valores de a permite establecer el nivel relativo de sobreexpresión, Rij, de cualquier gen, así:
RT-PCR en tiempo real
Con el fin de confirmar la sobreexpresión de seis de los genes identificados en los resultados de la pirosecuenciación, se realizaron pruebas de qRT-PCR. Para esto, se generaron nuevos brotes de plantas de los cultivares Criolla Colombia y Criolla Latina, realizándose inoculaciones con S. subterranea, tal como se describió anteriormente, pero en este caso obteniéndose ARN total en forma individual luego de 0, 1, 2 y 12 hpi.
Los cebadores utilizados fueron diseñados a partir de las secuencias obtenidas en el estudio para los genes que codifican para metalotioneína (MET), inhibidor de la pectinmetilesterasa (PM), a-galactosidasa (ALP), proteína putativa de resistencia a tinzón tardío (LBR), fitolquinasa (Fitol), y una proteína putativa con función desconocida (C572). Además, se diseñaron cebadores específicos para una porción del gen del factor de elongación 1a de S. phureja, para su utilización como control interno de expresión (17). Para el diseño de los cebadores se empleó el software primer3 (18) y se comprobó su especificidad con la herramienta PrimerBlast (19). Las secuencias de los cebadores se presentan en la Tabla 1. ]]>
Las reacciones de qRT-PCR se llevaron a cabo en dos pasos. Para la síntesis de ADNc se utilizaron 2 µl del cebador oligo-dT (10mM), 2 µl de ARN y 7,5 µl de agua tratada con DEPC, incubándose a 65°C durante 5 min, para continuar con la adición de 4 µl de buffer de reacción 5X, 0,5 µL de inhibidor de ARNasa (40U/µl), 2µl de dNTPs (10mM) y 2 µl de la enzima M-MuLV Transcriptasa Reversa (20 U/µl) (Fermentas, Lituania). Se incubó a 37°C durante 30 min y posteriormente se detuvo la reacción a 70°C por 10 min.El ADNc se cuantificó utilizando un equipo Nanodrop 2000C (Thermo, EEUU). Las reacciones de qPCR se llevaron a cabo con el kit Maxima SYBR Green/RoxqPCR Master Mix (Thermo, EEUU), siguiendo las instrucciones del fabricante, en un equipo Rotor-Gene Q-5plex Platform (Qiagen, EEUU), con un programa de amplificación que consistió en una desnaturalización inicial de 95°C durante 10 min, seguida por 45 ciclos de desnaturalización a 95°C por 15 s, y anillamiento/extensión a 60°C durante 1 min. Los niveles de expresión fueron determinados por el método de 2-ÄÄC, reportado por Livak y Schmittgen (20). Se establecieron para cada uno de los pares de cebadores diseñados, curvas estándar a partir de diluciones seriadas con base 10 del ADNc, iniciando con 1,6 µg hasta 1x10-4. El valor de Ct se estableció empleando los parámetros por defecto del equipo; mientras que para la determinación del cambio en la expresión de genes se realizó la normalización de los datos de Ct en el tiempo 0 y con relación al gen de referencia Factor de elongación 1a (EF1a) para cada muestra en cada tiempo evaluado.
Pirosecuenciación
Se confirmó la infección de S. subterranea en los dos cultivares de S. phureja evaluados, al encontrarse estructuras del patógeno (plasmodios y quistosoros en formación) luego de 24 días de la inoculación (Fig. 1).
En total se obtuvieron 47,5 Mpb de datos de secuencias, con una longitud promedio de 318 pb. Para el caso del cultivar Criolla Colombia sin inocular, luego del ensamblaje, se obtuvieron 3956 secuencias únicas (810 contigs, 3146 singlets), 936 (23,7%) de estas secuencias tuvieron por lo menos un hit de BLASTX. En las plantas de este cultivar inoculadas con S. subterranea, se obtuvieron 8407 secuencias únicas (2106 contigs, 6301 singlets), presentándose 2913 (34,8%) con al menos un hit de BLASTX. Además, se identificaron un total de 1168 secuencias codificantes expresados en el transcriptoma de raíz de Criolla Colombia, siendo identificadas 53 proteínas exclusivamente en las plantas no inoculadas y 683 en las plantas inoculadas.
Genes sobreexpresados en el cultivar Criolla Colombia
En la Tabla 2 se presenta la lista de las 50 proteínas putativas con valores más altos de expresión, identificadas en el cultivar Criolla Colombia, luego de la inoculación con S. subterranea. Los genes con mayores niveles de sobreexpresión respecto a la planta sin inocular fueron la metalotioneína (3297 veces), el gen de proteína fosfatasa 2C (2128 veces) y el inhibidor de pectinmetilesterasa (2127 veces). Un análisis gráfico de los perfiles de expresión según la función y ponderado según los niveles de sobreexpresión sugiere que Criolla Colombia responde frente a la infección con S. subterranea mediante la activación transcripcional de genes asociados a la integridad de la pared celular, transducción de señales y genes involucrados en la respuesta a diferentes tipos de estrés (Fig. 2).
Con relación al estrés oxidativo, se identificaron ARNm codificantes para metalotioneína, tiorredoxina, peroxidasa y glutatión-S-transferasa. Esta es una de las principales respuestas de defensa de las plantas frente al ataque de los fitopatógenos y consiste en la rápida liberación de especies reactivas de oxígeno (ROS), como el peróxido de hidrógeno y radicales superóxido (21). Las ROS pueden afectar directamente a los microoorganismos patógenos, actuar como agentes modificadores de la pared celular e incluso servir como moléculas señalizadoras (22).Como se indicó anteriormente, el gen más sobreexpresado en este cultivar fue el que codifica para un homólogo de la metalotioneína, una proteína de bajo peso molecular rica en cisteína implicada en la liberación de ROS y homeostasis de metales. Ya que trabajos previos informaron acerca de la sobreexpresión de esta proteína en presencia de diferentes fitopatógenos(23), el presente estudio permite postular la participación activa de ROS como una de las respuestas más importantes ante el inicio de la infección de S. subterraneaen Criolla Colombia; sin embargo, es claro que la producción masiva de estas sustancias no logra contener el proceso de colonización de las raíces por parte del patógeno, por cuanto este cultivar es altamente susceptible a la sarna polvosa de la papa (10).
Por otra parte, los genes asociados a procesos de señalización celular fueron identificados en este estudio como otro importante grupo de respuesta frente a la infección con S. subterranea, destacándose la sobreexpresión de la fosfatasa 2C, además de una proteína tipo Ras-RABd2a, una tirosina fosfatasa, un homólogo del receptor de etileno, calmodulina y una proteína de unión a calcio (Tabla 2). La fosfatasa 2C resulta fundamental en el desarrollo y crecimiento de las plantas, a través de su acción en rutas de señalización de ácido abscísico y adaptación al estrés biótico y abiótico (24). Recientemente, Widjaja et al. (25) identificaron en A. thaliana una fosfatasa 2C que se acumula después de la infección con Pseudomonas syringae y activa la proteína de resistencia NB-LRR RPM1. Por otra parte, Hu et al. (24) encontraron que la expresión del gen de la proteína fosfatasa 2C de arroz en plantas de tabaco, puede mejorar la resistencia a enfermedades y es inducida por moléculas señal relacionadas con defensa en plantas. Sin embargo, no se encontraron evidencias que sugieran la presencia de un ARNm codificante para un homólogo de este gen en Criolla Latina, por lo que su acción aparentemente no es fundamental para desencadenar la reacción de resistencia en S. phureja ante S. subterranea.
Otro grupo importante de genes sobreexpresados en este cultivar corresponde a proteínas relacionadas con la integridad de la pared celular; cuatro de estos genes se encuentran entre los 10 con mayores niveles de sobreexpresión en Criolla Colombia, e incluyen un inhibidor de pectinmetilesterasa (PMEIs), xiloglucanendotransglucosilasa, cinamil alcohol deshidrogenasa y una b-glucosidasa tipo 8.Las PMEs son enzimas que permiten que la pectina sea susceptible a la hidrolisis por endopoligalacturonasas y su regulación por parte de proteínas inhibidoras específicas (PMEIs) desempeñan una importante función en el desarrollo de las plantas, así como en la defensa ante patógenos que degradan la pared celular durante su proceso de ingreso al hospedante (26). Los altos niveles de sobreexpresión detectados en este estudio para este gen (2127 veces) son un claro indicativo de que en S. phureja, se activan rápidamente PMEIs que buscan contener la degradación de la pared celular ante endopoligalacturonasas microbianas, como las putativamente producidas por S. subterranea. Sin embargo, ya que hasta el momento no hay informes de la producción de estas enzimas en S. subterranea, en el futuro será necesario evaluar las características de las PMEs de este patógeno y su participación en los eventos tempranos de infección en papa. ]]>
Finalmente, en el estudio se encontró que la producción de metabolitos secundarios es otra importante línea de defensa de las plantas de Criolla Colombia ante la infección de S. subterranea, al detectarse la sobreexpresión de dos tipos de S-adenosilmetionina de carboxilasa,de una decarboxilasa de aminoácidos aromáticos, de Guanina deamidasa y de fenilalanina amonialiasa, ésta última una enzima clave en la síntesis de fenilpropanoides y responsable del incremento de los niveles ácido salicílico,dos aspectos bien conocidos como respuestas generales de defensa de las plantas ante el ataque de fitopatógenos (27).Genes sobreexpresados en el cultivar Criolla Latina
Para el caso de Criolla Latina, el total de secuencias únicas para las plantas con y sin inocular con S. subterranea, fue de 8246 (1985 contigs, 6261 singlets) y 5253 (1280 contigs, 3973 singlets), respectivamente. De éstas, 2796 (33,6%) tuvieron un hit de BLASTX en las plantas sin inocular y 1044 (19,9%) en las plantas inoculadas; 735 genes fueron transcritos únicamente en las plantas no inoculadas y 107 en las plantas inoculadas. Contrario a lo encontrado en el cultivar susceptible Criolla Colombia, los niveles de sobreexpresión en el cultivar resistente fueron moderados, ya que tan sólo dos genes fueron transcritos más de mil veces respecto a la planta sin inocular, mientras que de los primeros 50 genes evaluados, sólo 12 presentaron niveles de entre 100 y 1000 veces (Tabla 3). Esta situación conduce a plantear la hipótesis de que la respuesta de Criolla Latina frente a la infección con S. subterranea, podría presentar un importante componente constitutivo, siendo necesario realizar estudios histológicos en las raíces de este cultivar, que permitan definir sí esta reacción se debe a la presencia de barreras físicas preestablecidas, a la síntesis de compuestos antimicrobiales o a una combinación de ambos mecanismos. Sin embargo, la participación de genes inducidos, como los encontrados en el presente estudio, hacen parte integral de la defensa de este cultivar ante la infección de S. subterranea y su análisis individual y en conjunto con los otros mecanismos preestablecidos debe ser abordado en estudios posteriores.
Los análisis de sobreexpresión de genes en Criolla Latina identificaron a la sobreactivación del metabolismo central, en particular del metabolismo de carbohidratos y de la cadena transportadora de electrones, como componente clave de la interacción temprana de estas plantas con S. subterranea (Fig. 2). Es bien conocido que la respiración y la síntesis de carbohidratos son estimuladas como parte de la respuesta ante procesos infectivos microbianos, al estar relacionadas íntimamente con la generación de esqueletos de carbono necesarios para la síntesis de varios metabolitos, así como para brindar una fuente de energía adicional que permita abastecer todas las necesidades de la célula, incluyendo aquellas de defensa física y química (28). Además, en el estudio se encontraron diferentes genes de función desconocida, que abren una puerta importante de análisis moleculares y funcionales, que requieren ser abordados próximamente, para lograr obtener un panorama más completo de la reacción de defensa inducida a S. subterranea en este cultivar de S. phureja. En este sentido, el gen más sobreexpresado en Criolla Latina codifica una proteína no caracterizada de 114 aminoácidos y de la cual no se encontraron homólogos en otras plantas. Dados los altos niveles de sobreexpresión detectados (1377 veces), será de gran interés realizar una caracterización molecular del gen que codifica para esta proteína y de sus posibles funciones en la interacción de S. phureja-S. subterranea.
El segundo gen más sobreexpresado en este cultivar, fue el que codifica para a-Galactosidasa, una proteína que es parte de una serie de enzimas glicosil-hidrolasas (GH) o carbohidratasas y que tienen la capacidad de hidrolizar el enlace glicosídico de los azúcares. Debido a esto, desarrollan una función importante en el metabolismo de la pared celular, y por lo tanto, en el crecimiento y desarrollo de las células vegetales. Las GH fueron aisladas generalmente de semillas, donde están involucradas en el clivaje hidrolítico de residuos de a-Galactosa de polisacáridos, glicoproteínas, glicolípidos y oligosacáridos almacenados durante la germinación (29). También fueron frecuentemente asociadas a los mecanismos de defensa de las plantas, ya que los polisacáridos conforman alrededor del 90% del apoplasto y de la pared celular, participando en las interacciones célula-célula y de respuestas de defensa (30). Así por ejemplo, en un estudio realizado por Cheng et al. (31), se observó que proteínas como la a y b-Galactosidasa, se sobreexpresaron en presencia del factor de transcripción NtWIF, normalmente inducido bajo condiciones de estrés bióticos. Por otra parte, en un estudio realizado por Goodenough y Kempton (32), se evidenció la sobreexpresión de enzimas degradadoras de la pared celular, como la a-Galactosidasa, en raíces de tomate después de la infección con el hongo Pyrenochaeta lycopersici Schneider & Gerlach.
El tercer gen con mayores niveles de sobreexpresión en Criolla Latina codifica para una proteína putativa de resistencia al tizón tardío. Esta proteína, cuya función específica aún se desconoce, contiene un dominio ATPasa y confiere resistencia a razas de Phytophthora infestans (Mont.) de. Bary conteniendo el gen de avirulencia Avr1.
Finalmente, a pesar de presentar un nivel moderado de sobreexpresión (378), resulta llamativo la activación del gen codificante para fitol quinasa, una enzima que participa en el metabolismo del fitol, y que hace parte de las rutas biosintéticas de la clorofila, ésteres de lípidos y tocoferol (33). Este último es un antioxidante lipofílico sintetizado exclusivamente en organismos fotosintéticos y cuya acumulación sirve como uno de los mecanismos para contrarrestar los efectos del estrés oxidativo ocasionado por la liberación de ROS en condiciones de estrés biótico o abiótico (34). En este sentido, Keles y Oncel (35), encontraron, en plántulas de trigo, que los niveles de a-tocoferol se incrementaron notablemente con el estrés por tratamientos con productos químicos, concentración salina y altas temperaturas. Asimismo, se encontró que el cambio diferencial en los niveles de a-tocoferol en respuesta a limitaciones ambientales, depende de la magnitud del estrés y de la sensibilidad de la especie vegetal a esta condición, siendo planteado que el incremento del a-tocoferol contribuye con la tolerancia de las plantas al estrés, mientras que su disminución favorece el daño oxidativo (36). Por esto, aparentemente en Criolla Latina, la regulación del efecto deletéreo de ROS sobre las células donde comienza la infección de S. subterranea, es un factor a considerar en los eventos tempranos de la reacción de defensa de S. phureja.
RT-PCR en tiempo real
Con el fin de verificar algunos de los resultados presentados anteriormente, se eligieron seis genes sobreexpresados en uno de los dos cultivares y presentes en ambos transcriptomas. Los genes seleccionados fueron metalotioneína (MET), inhibidor de la pectinmetilesterasa (PM), a-galactosidasa (ALP), proteína putativa de resistencia a tinzón tardío (LBR), el gen hipotético correspondiente al contig 572 (C572) y fitolquinasa (PHYTOL). En este análisis no se incluyó la fosfatasa 2C, al no encontrarse evidencia de su transcripción en el cultivar tolerante.
El diseño de los cebadores resultó efectivo, al lograrse en las reacciones de qPCR productos específicos únicos y del tamaño esperado para los seis genes evaluados en el estudio, lo que resultó evidente en las curvas de fusión y en las corridas electroforéticas de los amplicones que se realizaron a modo confirmatorio. Previo al análisis cuantitativo de expresión de los genes con el método 2-ÄÄCt, se calcularon las eficiencias para cada gen amplificado y para el gen de referencia EF1a, encontrándose que dichos valores se presentaba en el rango de 1 a 1,07. ]]>
Los resultados de la qRT-PCR indicaron que en tres de los genes evaluados (PM, MET y C572) no se presentaban diferencias en los niveles de expresión de las plantas inoculadas con S. subterranea, independientemente del cultivar y de los tiempos de evaluación (Tabla 4). Por el contrario, los genes ALP y PHYTOL, se presentaron sobreexpresados en las plantas inoculadas del cultivar Criolla Latina en los tres tiempos de evaluación (1,2 y 12 hpi) (Fig. 3), mientras que del gen que codifica para una proteína putativa de resistencia a tinzón tardío (LBR), fue detectada la sobreexpresión sólo después de 12 hpi. Estos resultados confirman la validez de los resultados de la pirosecuenciación del transcriptoma obtenidos en el presente estudio y permiten plantear la utilidad de dichos genes como marcadores de selección en programas de mejoramiento genético de S. phureja por resistencia a S. subterranea; siendo además necesario continuar el estudio de la expresión de dichos genes en otros cultivares de papa, incluyendo aquellos deS. tuberosum, bajo diferentes niveles de infección de S. subterranea, etapas fenológicas del cultivo y condiciones ambientales.
Esta investigación se realizó a través del proyecto 220101007287- Evaluación fenotípica y genotípica de la colección colombiana de Solanum phureja por resistencia a Spongospora subterranea cofinanciado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural (MADR), Fondo Nacional de Fomento Hortofrutícula (FNHF), Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid, Federación Colombiana de Productores de Papa (FEDEPAPA) y Universidad Nacional de Colombia Sedes Bogotá y Medellín. Los autores expresan sus agradecimientos a los integrantes de los grupos de investigación de Mejoramiento y Producción de Especies Andinas y Tropicales (COL0039484) y al Grupo de Investigación en papa (COL0010065), que aportaron el material vegetal y el conocimiento previo sobre los cultivares evaluados.
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Recibido: 2-9-2013. ]]>
Aceptado: 7-11-2013. ]]>
