Miriam M. Rojas FernándezI, Mylene Corzo LópezI, Yaima Sánchez PérezI, Deyamín BritoII, Rodney Montes de OcaII, Yadira MartínezIII, Oriela Pino PérezI
ICentro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado 10, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. Teléfono: 863014 ext-48. Correo electrónico: mrojas@censa.edu.cu.
IILaboratorio Anti-Doping, Instituto de Medicina Deportiva (IMD). 100 y Aldabó, Boyeros, Ciudad de La Habana. Cuba.
IIIInstituto de Investigaciones Hortícolas Liliana Dimitrova. Carretera Quivicán-Bejucal km 33½, Quivicán, Mayabeque, Cuba.
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RESUMEN
Los aceites esenciales son considerados una importante alternativa para el manejo sustentable de plagas en la agricultura, debido a su reconocida actividad antimicrobiana sobre diversas plagas clave en cultivos de importancia económica. El objetivo de este trabajo fue identificar las potencialidades de aceites esenciales de Thymus vulgaris L., Pimpinella anisum L., Citrus sinensis (L.) Osbeck., Ocimum basilicum L., Curcuma longa L., Ruta chalepensis L. y Melaleuca quinquenervia (Cav) S.T. Blake como candidatos para el desarrollo de nuevos agentes antibacterianos para el manejo de Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum. Los aceites esenciales se extrajeron por hidrodestilación empleando un equipo Clevenger, y su evaluación biológica se realizó por el método de difusión en agar. Las Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMI) y Mínimas Bactericidas (CMB) del aceite más promisorio se establecieron por el método de las diluciones seriadas; su composición química se determinó por CG/EM. Al compuesto mayoritario del aceite más promisorio se le determinó las CMI y CMB. Los aceites de albahaca y anís produjeron una inhibición ligera del crecimiento de la bacteria y el de tomillo mostró la actividad antibacteriana más promisoria (CMI = CMB = 0,1%). En la composición química del aceite prevalecen los compuestos monoterpenoides. Los principales constituyentes identificados fueron el timol (57,0%), el p-cimeno (14,7%) y el g- terpineno (14,1%). El timol evidenció un elevado efecto antibacteriano sobre P. carotovorum subsp. carotovorum (CMI = CMB = 0,2%). Los resultados obtenidos señalan al aceite de tomillo como ingrediente activo promisorio para desarrollar nuevos plaguicidas destinados al manejo de P. carotovorum subsp. carotovorum en cultivos de importancia económica.
Palabras clave: aceites esenciales, Thymus vulgaris, timol, p-cimeno, ã- terpineno, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum.
ABSTRACT
The essential oils have been considered an important alternative to sustainable management of pests in agriculture due to their recognized antimicrobial activity against several pests of important economic crops. The aim of this study was to identify the potential of essential oils of Thymus vulgaris L., Pimpinella anisum L., Citrus sinensis (L.) Osbeck., Ocimum basilicum L., Curcuma longa L., Ruta chalepensis L. and Melaleuca quinquenervia (Cav) S.T. Blake as candidates for the development of new antibacterials. Essential oils were extracted by hydrodistillation using a Clevenger- type equipment and their biological evaluation against Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Jones) Waldee emends. Hauben et al. was carried out by agar diffusion method. The minimal inhibitory concentration (MIC) and the minimal bactericidal concentration (MBC) of the most active essential oil was carried out by the serial dilution method and its chemical composition was determined by GC / MS. The MIC and MBC of the main compound from the most active essential oil were determined by the serial dilution method. Among the tested oils, anise and white basil essential oils showed weak activity, whereas the essential oil of thyme showed strong antibacterial activity against the evaluated bacteria (MIC = MBC = 0.1%). The chemical composition of the oils was characterized by the prevalence of monoterpenoid and sesquiterpenoid compounds. Thymol was the main constituents (57.0%), followed by p-cimene (14.7%) and g- terpinene (14.1%). It exhibited strong antibacterial activity against P. carotovorum subsp. carotovorum (MIC = MBC = 0.2%). The results obtained pointed to the essential oil of thyme as a promising active ingredient for developing new pesticides for the control of P. carotovorum subsp. carotovorum in crops of economic importance.
Key words: essential oils, Thymus vulgaris, thymol, p-cimene, ã- terpinene, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum.
INTRODUCCIÓN ]]>
El cultivo de la papa (Solanum tuberosum L.) es muy importante mundialmente por su elevado rendimiento, y se convirtió en alimento básico por su alto valor nutricional (1). Este cultivo es frecuentemente afectado por enfermedades bacterianas; dentro de las más importantes se encuentra la denominada pudrición blanda, causada por la bacteria fitopatógena Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Jones) Waldee emend. Hauben et al. Esta severa y devastadora enfermedad se presenta, además, en otros cultivos de importancia económica como tomate, pimiento, col y berenjena (2).P. carotovorum subsp. carotovorum provoca la pudrición de los tubérculos, tanto en campo como en almacenes, y las pérdidas estimadas, mundialmente, son de millones de dólares anuales. La vía más importante de transmisión de la enfermedad es a través de los tubérculos contaminados, donde la bacteria está presente de forma latente en la superficie o en las lenticelas (3). Para el manejo de la enfermedad se utilizan plaguicidas sintéticos, aunque no se dispone de un control efectivo (4). Lograr una producción de semillas libres del patógeno es considerado una de las estrategias más importantes en el control de la propagación del patógeno.
Los plaguicidas de origen botánico están ganando atención por su eficacia, espectro de acción, compatibilidad con otros agentes de control biológico y los problemas asociados al efecto de los productos sintéticos en el medio ambiente y la seguridad de productores y consumidores. Consecuentemente, es cada vez más importante la función que pueden desempeñar en el manejo integrado del cultivo, y evidencia de ello es su lugar en nichos como la producción de alimentos más sanos (5). Los aceites esenciales son considerados una importante alternativa para el manejo sustentable de plagas en la agricultura, debido a su reconocida actividad antimicrobiana sobre diversas plagas en cultivos de importancia económica (6).
El objetivo de este trabajo fue identificar las potencialidades de aceites esenciales de plantas presentes en Cuba como candidatos para el desarrollo de nuevos agentes antibacterianos para el manejo de P. carotovorum subsp. carotovorum.
Las plantas evaluadas fueron: Thymus vulgaris L. (tomillo), Pimpinella anisum L. (anís), Citrus sinensis (L.) Osbeck. (naranjo dulce), Ocimum basilicum L. (albahaca blanca), Curcuma longa L. (cúrcuma), Ruta chalepensis L. (ruda) y Melaleuca quinquenervia (Cav) S.T. Blake (melaleuca). Diferentes partes de estas se recolectaron las localizaciones geográficas de la región occidental de Cuba (Tabla 1).
Los aceites esenciales se extrajeron, del material vegetal fresco y no dañado, por hidrodestilación con equipo Clevenger durante tres horas, según lo establecido en la norma ISO 65-71:84 (7). Cada aceite se secó sobre sulfato de sodio (Fluka) y se almacenó a 8°C.
La actividad antimicrobiana de los aceites se evaluó frente a P. carotovorum subsp. carotovorum, perteneciente a la colección del Laboratorio de Bacteriología Vegetal del Centro Nacional Sanidad Agropecuaria. La bacteria se sembró por agotamiento en placas que contenían medio de cultivo ácido casamino peptona glucosa (CPG); y se incubó a 28ºC durante 24 horas. Una vez crecida, se preparó una suspensión bacteriana, a una concentración de inóculo de aproximadamente 108 Unidades Formadoras de Colonia (UFC).ml-1, equivalente a una densidad óptica de 0.5, a una longitud de onda de 600nm en un espectrofotómetro (T90 + UV/Vis Spectrometer PG Instruments Ltd). De este inóculo se tomaron alícuotas de 100µl y se sembró en placas con medio CPG por diseminación con espátula de Drigalski.
Para evaluar la sensibilidad de este microorganismo, a los aceites esenciales, se empleó el método de difusión en agar, según la técnica estandarizada por el Comité Nacional para Estándares de Laboratorios Clínicos (National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) (8), basada en el método de Kirby-Bauer. En cada placa se colocaron cuatro discos de papel de filtro de 6 mm de diámetro; a dos de los discos se les añadió 10µl del aceite esencial y los otros dos se emplearon como controles negativos. Como control positivo se utilizaron discos impregnados con Estreptomicina (30 µg.disco-1) (OXOID).
La evaluación se realizó por cuatriplicado para cada tratamiento. Los resultados de las diferentes dosis evaluadas se compararon a través de un análisis de varianza, empleando la prueba de rangos múltiples de Duncan y el paquete estadístico SAS 9.0. ]]>
Las placas se incubaron a 280C durante 24h. Una vez transcurrido este tiempo se midió el diámetro del halo de inhibición (dhi) del crecimiento bacteriano. La actividad de los aceites se clasificó en marcada (dhi ³16mm), moderada (12mm £ dhi < 16mm), ligera (8 mm £ dhi < 12mm) o sin actividad (dhi < 8 mm), según los rangos de la escala utilizada por Sánchez et al. (9).Para evaluar la sensibilidad de la bacteria fitopatógena frente al compuesto mayoritario del aceite esencial más promisorio, este se disolvió en hexano y se preparó a una concentración de 0,2%. En la evaluación de la sensibilidad se procedió de igual forma a la descrita anteriormente para los aceites. Se emplearon, como controles negativos, discos a los que se añadió 10µl de hexano (Merck).
Para determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) se empleó el método de las diluciones seriadas (10) en medio de cultivo Hugh Leifson (O/F Hugh Leifson) líquido, preparado a partir de sus componentes. Al medio se le adicionó DMSO (1,25%, Merck) para facilitar la solubilización del aceite más promisorio y su compuesto mayoritario.
Las concentraciones evaluadas fueron 0,4% (8µl de aceite esencial en 2 ml de medio); 0,2%; 0,1%; 0,05% y 0,025% y de cada una se realizaron 5 réplicas. Se incluyeron dos controles de crecimiento bacteriano con y sin DMSO. Los tubos con las diluciones de los aceites se inocularon con 100 µl de la suspensión de P. carotovorum subsp. carotovorum (108 UFC.ml-1). Se incubaron a 28°C y, después de 24h, se determinó la CMI del crecimiento de la bacteria. La CMI se tomó como la concentración más baja del tratamiento (aceite y su compuesto mayoritario) que inhibió el crecimiento visible del microorganismo después de la incubación.
En aquellos casos donde se observó inhibición, se tomaron 100 µl y se sembró en tubos que contenían el medio específico Hugh Leifson (O/F Hugh Leifson) libre del agente antimicrobiano. La más baja concentración de la muestra, capaz de producir daño letal en la célula microbiana, se definió como la CMB.
La composición química del aceite bioactivo se determinó en un cromatógrafo de gases de la serie Agilent6890, con un inyector del tipo «split splitless» (relación de split 20:1), acoplado con un espectrómetro de masas de la serie Agilent 05973 (ambos provenientes de la firma Agilent Technologies). Se utilizó una columna capilar SPB-5 (L=15m, DI=0.25mm, f=0.10mm) con una inyección de 2 ml. Se usó Helio como gas portador, y la identificación de los compuestos se llevó a cabo mediante el uso combinado de las bases de datos automatizadas NBS-NISTASCI y Wiley 275 y el Atlas Registry of Mass Spectra Data.
De los aceites evaluados solo el de tomillo produjo inhibición total del crecimiento (Tabla 2), por lo que resultó el aceite de mayor actividad antibacteriana. Esta esencia mostró un efecto superior al del antibiótico utilizado como control; su actividad se clasificó como marcada, mientras que la del antibiótico fue moderada, por tanto, el aceite se consideró promisorio. Los aceites de anís y albahaca produjeron halos de inhibición alrededor del disco, pero la actividad fue clasificada como ligera. Las esencias de naranjo dulce, cúrcuma, ruda y melaleuca no inhibieron el crecimiento de la bacteria fitopatógena.
La bacteria evaluada no fue sensible a los aceites de anís, albahaca, melaleuca, ruda y cúrcuma; sin embargo, la actividad de estos sobre Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Doidge (Dye), Xanthomonas albilineans (Ashby) Dowson y Clavibacter michiganensis subsp michiganensis (Smith) (Davis et al.) se informó previamente por otros autores (11, 12, 13). Otros microorganismos fitopatógenos como Alternaria solani Sorauer y Fusarium sp., también fueron susceptibles a estas esencias (14, 15). ]]>
P. carotovorum subsp. carotovorum se evaluó anteriormente frente a aceites esenciales de diferentes géneros y especies de plantas aromáticas, dentro de los cuales se destacó el aceite de T. vulgaris por su fuerte actividad antibacteriana (4). Nuestros resultados corroboran este efecto para el aceite obtenido a partir de la materia prima recolectada en Cuba. Sin embargo, en estos estudios previos no se menciona la composición química de la esencia, lo cual es muy importante para garantizar la reproducibilidad de los resultados. La actividad biológica de un aceite esencial puede variar en dependencia de la composición química del mismo, unido a esto, los altos niveles de inhibición provocados por el aceite de tomillo condujeron a profundizar en su estudio químico y biológico.En el aceite de tomillo se identificaron 27 compuestos con más de 0,1% de abundancia relativa (Tabla 3). En la composición química del aceite predominaron los monoterpenos (59,26%) y los sesquiterpenos (29,63%), y en ambos grupos se identificaron compuestos oxigenados.
Los constituyentes principales identificados en la mezcla fueron: timol (56,98%), su precursor biosintético p-cimeno (14,67%) y g- terpineno (14,13%) (Figura). Previamente, estos compuestos se identificaron como mayoritarios en otros aceites de tomillo (16, 17). De los varios quimiotipos de T. vulgaris, el aceite estudiado corresponde al de timol, por contener más del 50% de este compuesto (16).
En la mezcla analizada se encontraron con más de 1% de abundancia relativa: a-terpineno (1,65%), L-linalol (1,64%), a-tujeno (1,52%), mirceno (1,38%) y carvacrol (1,33%); compuestos muy frecuentes en la esencia de T. vulgaris (17, 18, 19). El resto de los componentes identificados contribuyen a la composición del aceite con un porcentaje menor a este; sin embargo, algunos de ellos se informaron en mayor abundancia relativa en muestras de otros orígenes geográficos, analizadas previamente. Imelouane et al. (18) informaron alcanfor (38.54%), canfeno (17,19%), a-pineno (9,35%), borneol (4,91%) y g-pineno (3,90%) como compuestos mayoritarios de su esencia. En el aceite esencial, obtenido a partir de hojas de T. vulgaris por Kazemi et al. (20), se identificaron a-pineno, canfeno, b- pineno, alcanfor, timol y carvacrol como los componentes más abundantes.
Las diferencias en cuanto a la abundancia de cada componente de la esencia, con respecto a las informadas por otros autores, acentúan la gran variabilidad que presenta la composición química de la esencia de tomillo y la importancia de determinar la composición química que corresponde a determinado efecto biológico. Estas variaciones pueden estar asociadas a las condiciones medio ambientales, especie, estado fenológico de la planta, parte de la planta que se utilice para extraer la esencia, tiempo de cosecha, método de extracción, del tiempo de extracción del aceite, entre otros (18).
La actividad antibacteriana es frecuentemente correlacionada con la composición química de los aceites esenciales, y en numerosos estudios se plantea que la mayor contribución al efecto antimicrobiano la ejercen sus componentes oxigenados (21). En la esencia de tomillo estudiada, estos compuestos oxigenados representan el 40,7% de los compuestos identificados y, dentro de ellos, el timol aportó más del 50%. En estudios previos, la acción bactericida de timol se demostró y se comparó con otros componentes de aceites esenciales, y de todos los compuestos evaluados fue el que produjo mayor inhibición frente a todas las cepas (22). Consecuentemente, por su contribución cuantitativa a la composición de la esencia bioactiva y antecedentes de actividad biológica, se seleccionó este terpeno para evaluaciones encaminadas a definir si podría asociarse su presencia al efecto antibiótico sobre P. carotovorum subsp. carotovorum.
El timol provocó una inhibición marcada (halo de inhibición=27mm) del crecimiento de P. carotovora subsp carotovora; mientras que el hexano utilizado como control no inhibió el desarrollo bacteriano. Por tanto, se confirmó que este compuesto contribuye al efecto producido por el aceite de tomillo estudiado sobre el agente causal de la pudrición blanda.
Los valores de CMI y CMB del aceite fueron iguales a 0,1% y para el timol a 0,2%; se observa coincidencia en los resultados obtenidos para las réplicas evaluadas. Estos resultados corroboraron la elevada actividad del aceite y su componente mayoritario sobre la bacteria fitopatógena evaluada. Sin embargo, los valores de CMI y CMB del timol fueron mayores que los de la esencia y esto puede indicar la existencia de un efecto sinérgico entre los compuestos de la mezcla que la hacen más activa. Entre los componentes identificados en el aceite, existen precedentes del efecto sinérgico del carvacrol y el timol (23), aunque la determinación precisa de la contribución de cada componente debe abordarse en investigaciones futuras.
La actividad antibacteriana del timol y otros monoterpenos está relacionada a daños estructurales y funcionales que provocan en la fracción lipídica de la membrana plasmática. Estos interactúan con proteínas de membrana y dianas intracelulares, inducen alteraciones en la permeabilidad de la membrana, despolarización y liberación de material intracelular de las bacterias (24). Horvath et al. (25) demostraron la capacidad del aceite esencial de tomillo para cambiar cuantitativamente el perfil de proteínas de membrana de cepas de Erwinia spp.; estos cambios pudieran explicar el efecto antibacteriano del aceite. Los resultados obtenidos señalan al aceite de tomillo como ingrediente activo promisorio para el desarrollo de nuevos plaguicidas destinados al manejo de P. carotovorum subsp. carotovorum en cultivos de importancia económica.
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