Densidad superficial nuclear de hepatocitos de hígados sometidos a un factor estimulante humoral en ratones
Superficial nuclear density of hepatocytes of livers subjected to a humoral stimulating factor in mice
Dra. Marielín Concepción Osorio; Dr. Pedro A. Díaz Rojas; Lic. Tania Rodríguez Amador.
Universidad de Ciencias Médicas de Holguín. Holguín. Cuba.
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RESUMEN
Fundamento: la regeneración hepática es la respuesta fundamental del hígado frente a los diversos estímulos internos y externos. Es multifactorial inducida, que origina cambios secuenciales en la expresión génica, la estructura y organización de las células hepáticas.
Objetivos: analizar el comportamiento de la densidad superficial de los núcleos de los hepatocitos según la posición que ocupan en las zonas del lóbulo hepático medio de ratones sometidos a citosol regenerativo.
Método: se estudió la densidad superficial de los núcleos de hepatocitos con el uso de la morfometría en 14 lóbulos medios de hígados de ratones, que fueron sometidos a dosis de citosol de hígado regenerativo al inicio del experimento. Las muestras fueron tomadas cada 12 horas durante ocho días. El corte se dividió en zonas proximal, medial y distal al hilio donde se realizaron las determinaciones.
Resultados: los valores promedios y su desviación estándar en la zonas fueron: proximal 701,23 ± 135,83 (μm2.103), medial 707,48 ± 46,87 (μm2.103) y distal 682,48 ± 125,21 (μm2.103). Al comparar los resultados mediante el análisis de varianza se aprecia que no existen diferencias en el comportamiento de los promedios en las tres zonas. Al comparar la fase inicial con la fase final del experimento se aprecia diferencias significativas (p ≤ 0,05) en las mismas zonas, con un predominio de la zona proximal y distal.
Conclusiones: en las tres zonas del lóbulo el comportamiento de la densidad superficial de núcleos de hepatocitos ocurre de manera similar, con un sentido al incremento al final del experimento, lo que se corroboró con la aplicación de la prueba de la t de Student. Los incrementos más significativos ocurrieron en la zona proximal y distal, aunque en todas las zonas existen diferencias significativas entre los valores obtenidos en la primera mitad de tiempo del experimento respecto a la parte final.
DeCS: MEDICIONES, MÉTODOS Y TEORÍAS; HEPATOCITOS/citología; REGENERACIÓN HEPÁTICA; ANIMALES; EPIDEMIOLOGÍA EXPERIMENTAL.
ABSTRACT
Background: hepatic regeneration is the basic answer of the liver to various internal and external stimuli. It is multifactorial and induced and originates sequential changes in the gene expression, the structure and organization of hepatic cells. ]]>
Objective: to analyze the behaviour of the superficial density of the nuclei of the hepatocytes according to the position they have in the areas of the middle hepatic lobes of mice subjected to regenerative cytosol.
Method: the superficial density of the nuclei of the hepatocytes was studied with the use of morphometry in 14 middle hepatic lobes of mice subjected to a dose of regenerative liver cytosol at the beginning of the experiment. The samples were taken every 12 hours during eight days. The cut was divided into proximal, medial and distal areas to the hilum, where the determinations were made.
Results: the average values and their standard deviations in the areas were: proximal 701,23 ± 135,83 (μm2.103), medial 707,48 ± 46,87 (μm2.103) y distal 682,48 ± 125,21 (μm2.103). When comparing the results through the analysis of variance, it could be seen that there are not differences among the averages in the three areas. When comparing the initial stage with the final stage of the experiment major differences (p ≤ 0,05) could be seen in the same areas, predominating the proximal and distal area.
Conclusions: in the three areas of the lobe the behaviour of the superficial density of the nuclei of the hepatocytes is similar, with a tendency to increase at the end of the experiment. This could be corroborated with the application of the Student’s t- test. In spite of the fact that there were major differences between the values obtained in the first part and the final part of the experiment in all the areas, the most significant increases occurred in the proximal and distal areas.
DeCS: MEASUREMENTS, METHODS AND THEORIES; HEPATOCYTES/cytology; LIVER REGENERATION; ANIMALS; EPIDEMIOLOGY, EXPERIMENTAL.
INTRODUCCIÓN
El hígado es capaz de regular su crecimiento en función de sus necesidades, por lo que puede proliferar o sufrir apoptosis, lo que depende de la situación a la que se enfrente. La capacidad de regeneración hepática es extraordinaria, ya que es capaz de recuperar su tamaño óptimo tras hepatectomías parciales. 1
La regeneración hepática es la respuesta fundamental del hígado frente al daño tisular. Es un proceso multifactorial inducido y controlado por estímulos específicos, tanto endógenos como exógenos, que originan cambios secuenciales en la expresión génica y en la estructura de las células hepáticas. Su duración es relativamente corta, tanto en animales de experimentación como en humanos. 2
]]> Los eventos celulares que ocurren en este proceso no sólo están en relación con los hepatocitos y las células madres, también desempeñan un papel importante las células no parenquimatosas, como las células de Kupffer, las células endoteliales y las células estrelladas o estelares; las que proporcionan las citoquinas y los factores de crecimiento como son el hepático, el transformante beta, y el epidérmico de unión a la heparina, necesarios para la replicación de los hepatocitos mediante un proceso perfectamente sincronizado. 3-5La investigación en este campo ha experimentado un gran avance en los últimos años, basado fundamentalmente en el desarrollo de modelos animales y debido al gran interés que suscita la posibilidad de su aplicación a la clínica. 6-7
Se han realizado varias investigaciones con métodos morfométricos en animales de experimentación. Estos estudios se fundamentan en el análisis de los datos obtenidos en las zonas del lobulillo hepático clásico. 8-11
No encontramos estudios que analicen los resultados de indicadores morfométricos nucleares desde la perspectiva estructural de un lóbulo hepático dividido en zonas en relación a la cercanía al hilio del órgano.
Por lo antes expuesto, los autores de esta investigación se propusieron como objetivo analizar el comportamiento de la densidad superficial de los núcleos de los hepatocitos según la posición que ocupan en las zonas proximal, medial y distal del lóbulo hepático medio de ratones isogénicos línea IOR sometidos a citosol regenerativo.
MÉTODOS
Se realizó un estudio experimental donde se utilizaron 66 ratones blancos isogénicos línea IOR certificados, machos con un peso aproximado entre 25 y 35 gramos. Previo al experimento fueron sometidos a un periodo de adaptación de tres semanas en condiciones de laboratorio, con régimen día/noche normal, comida y agua at libitum y temperatura ambiente controlada entre 21 y 24 grados Celsius en un local preparado para este fin.
Se estableció un grupo de 20 ratones para la obtención de un macerado hepático de hígados en fase regenerativa posthepatectomía parcial.Una vez obtenido el citosol se procedió a su inoculación en un grupo experimental de 46 ratones, en una dosis diaria de 1, 5 ml por vía transperitoneal durante tres días. La inoculación se realizó siempre a partir de las 10:00 pm. Veinticuatro horas después del último día de inoculación se procedió a la toma de muestra durante ocho días con un intervalo de 12 horas, que provocó la muerte por decapitación y se disecó el lóbulo medio del hígado.
El fragmento de lóbulo hepático medio se fijó en mezcla de formalina, alcohol y ácido acético y se incluyó con la técnica clásica de la parafina.Los cortes de aproximadamente de seis a ocho micrómetros de espesor fueron teñidos con hematoxilina y eosina bajo control de pH. Se capturaron cinco imágenes por cada preparación histológica de la zona proximal, medial y distal respecto a la cercanía al hilio hepático, con una cámara digital marca Canon de ocho Mpx con un lente óptico de 3X, acoplada a un microscopio JENAMED 2 con lente objetivo 40X y lente ocular de 10X para un aumento total de 1200X.
]]> Para realizar el cálculo de la densidad superficial de los hepatocitos, se utilizó el software ImageJ del National Institutes of Health calibrado con un objetivo micrométrico de la Karl Zeits. La densidad superficial se midió a través de una rejilla cuadriculada de 70 x 76, 56 µm de lados, para un área total de 6737, 28 µm2. Se superpuso sobre la imagen y se procedió a contar los núcleos de hepatocitos sobre los cuales cayeron los puntos de los interceptos de los segmentos de la rejilla. El valor de la densidad superficial se obtuvo por la fórmula: ? n
Dn = ---------- x A
N
Donde corresponde a los puntos que inciden en los núcleos, N los puntos totales de la rejilla cuadriculada y A el área total de la rejilla. Los datos se procesaron con la versión 12 del programa MyStat para Windows. Se comprobó la normalidad de los datos lo que permitió el cálculo de la media y desviación estándar, el comportamiento de las tres zonas se determina por al análisis de varianza, la comparación de los datos de la fase inicial y la fase final del experimento mediante la prueba de la t de Student de diferencias de medias, se ilustra en gráficos de plexograma.
RESULTADOS
La densidad superficial es un indicador estereológico que representa la cantidad de núcleos de hepatocitos que se encuentran en un área determinada, es una medida adicional que está dada por la fracción de puntos de un testaje que caen sobre los núcleos dividido por el total de puntos que posee el test respecto al área total de la rejilla utilizada para el conteo.
Se observa un ejemplo de la manera en que se realiza el conteo de núcleos de hepatocitos con la superposición de la rejilla cuadriculada. (Figura)
]]> Se observan los resultados de la densidad superficial nuclear de los hepatocitos en cada una de las zonas estudiadas según el tiempo de la toma de la muestra.El valor promedio y su desviación estándar en la zona proximal fue de 701, 23 ± 135, 83 (μm2.103), en la zona medial 707, 48 ± 46, 87 (μm2.103) y en la zona distal 682, 48 ± 125,21 (μm2.103). (Tabla 1)
El coeficiente de variación en las tres zonas se encontró por debajo de 0,20; lo que permite inferir la poca variabilidad de indicador medido. (Tabla 2)
Al observar el comportamiento de la densidad superficial de núcleos de los hepatocitos según el tiempo se puede apreciar dónde se superponen las tres zonas, que los resultados son los siguientes:
En la zona proximal la densidad superficial oscila alrededor del valor de 600 μm2.103 hasta las 84 horas aproximadamente, a partir de la cual comenzó a ascender y mantiene esa tendencia hasta el final del experimento. (Gráfico)
En el caso de la zona medial los valores se comportan entre los 600 μm2.103 y 700 μm2.103 y oscilan entre estos valores hasta las 96 horas aproximadamente, a partir de aquí se observa una ligera tendencia a su elevación y se acercó a los 800 μm2.103 al final del experimento.
La zona distal la densidad superficial de núcleos de hepatocitos presenta valores por debajo de los 600 μm2.103 en las primeras 72 horas, luego se observó una evidente tendencia a elevar los valores por encima de esta cifra hasta concluir el experimento.
]]> Al comparar los resultados mediante el análisis de varianza, se aprecia que no existen diferencias en el comportamiento de los valores promedios en las tres zonas, lo que puede interpretarse como un proceso de respuesta general uniforme de la población de hepatocitos, independientemente que exista una ligera tendencia al aumento de la densidad superficial luego de concluido el período de estudio.Al comparar la fase inicial con la fase final del experimento y comparar su medias, se aprecia diferencias significativas en la misma zona, con un predominio evidente de la zona proximal y distal en cuanto al desenlace final. (Tabla 3)
DISCUSIÓN
La regeneración hepática es la respuesta fundamental del hígado frente al daño tisular. Es un proceso multifactorial inducido y controlado por estímulos específicos, tanto endógenos como exógenos, que originan cambios secuenciales en la expresión génica y en la estructura de las células hepáticas. 1,10
En nuestro medio se han realizado métodos de estudios para potenciar la regeneración hepática en animales de experimentación, se destacan entre ellos la hepatectomía parcial y la acción de citosol de hígado regenerativo, este último como portador de factores estimulantes de este proceso. 11
Diversos estudios morfométricos e inmunohistoquímicos se han empleado para la determinación de diferentes parámetros relacionados con la regeneración hepática. Los indicadores más utilizados se corresponden con el volumen nuclear de los hepatocitos, su relación núcleo-citoplasma y la densidad superficial nuclear como elementos que permiten inferir dos procesos de vital importancia en la célula. 12
El primero es el incremento de la demanda metabólica y el segundo la tendencia a la proliferación de los hepatocitos que induce a la organización cromosomal para su entrada en el ciclo de mitosis, ambos se fundamentan en la replicación del material genético. 13,14
Muchos de los hepatocitos inducidos a dividirse duplican el ADN nuclear y llegan a ser tetraploides y poliploides, al detener el proceso de división sin causa conocida y duplicar el material genético dentro del mismo núcleo. También puede ocurrir que el núcleo se divide y no se produce la división del citoplasma, lo que da lugar a la presencia de células binucleadas en el tejido hepático, que se conoce como amitosis. 14
Entre los modelos descritos por Cascales, 15 se encuentran el de Higgins y Anderson en 1931, basado en la eliminación por cirugía de dos tercios del hígado y el hígado remanente crece hasta que se restaura la masa hepática original. Otro muy utilizado en investigaciones farmacológicas es la pérdida de células hepáticas debido a la administración de fármacos hepatotóxicos necrogénicos como el paracetamol, el CCl4 y la tioacetamida.
]]> Un modelo descrito por este mismo autor que presenta gran interés por su aplicación a la clínica, es el que se origina por embolización o ligadura de la vena porta, lo que permite eliminar el riego sanguíneo portal en la porción del hígado que se va a extirpar, proporciona mayor flujo hemodinámico a la porción restante, con la consiguiente inducción de la proliferación hepatocelular. Tiene su aplicación en caso de cirrosis, tumores y también en trasplantes de hígado de pequeño tamaño.En todos los casos, el factor de estimulación de la regeneración se hace presente en el torrente circulatorio y comienza a ser efectivo en las regiones hepáticas mejor nutridas, estudios sobre isquemia, 16 muestran las alteraciones que se producen al realizar los transplantes hepáticos que guardan relación con la respuesta vascular del órgano.
La mayoría de los estudios morfométricos basan su análisis en las zonas del lobulillo hepático clásico y no toman en consideración la cercanía o lejanía de las zonas estudiadas al hilio hepático. Nuestra experiencia, favorece la comprensión del proceso a nivel macroscópico tomando en consideración el principio planteado anteriormente. Estudios como el de Hoyos, 17 sobre regeneración hepática postransplante expresan el comportamiento de éste órgano. En nuestro caso, los factores humorales presentes en el citosol administrado vía intraperitoneal son absorbidos por los vasos que drenan al sistema porta-cava circulando a través del parénquima hepático donde actúan.
El análisis del comportamiento de la densidad superficial de núcleos de hepatocitos mostró valores bajos al inicio con una tendencia a subir hasta el final del experimento. La densidad superficial de núcleos de los hepatocitos en la zona medial fue la que presentó una respuesta tardía e irregular respecto al resto de las zonas estudiadas.
Este comportamiento general del lóbulo medio se explica por el hecho de que a medida que avanza el tiempo el estímulo decrece y ello se debe a que los posibles factores estimulantes de la regeneración existentes en el citosol que se inocularon antes del experimento son metabolizados por los propios hepatocitos y por ello hay una tendencia a disminuir su concentración en sangre, lo que es corroborado por los valores de la correlación.
CONCLUSIONES
Las tres zonas del lóbulo hepático medio responden de igual manera al estímulo humoral inducido, con un comportamiento de la densidad superficial de núcleos de hepatocitos con valores similares. Dentro de la propia zona se observa un sentido al incremento al final del experimento, lo que se corroboró con la aplicación de la prueba de la t de Student. Los incrementos más significativos ocurrieron en la zona proximal y distal, aunque en todas las zonas existen diferencias significativas entre los valores obtenidos en la primera mitad de tiempo del experimento respecto a la parte final.
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Recibido: 7 de mayo de 2014
Aprobado: 17 de septiembre de 2014
Dra. Marielín Concepción Osori. Especialista de I Grado en Histología. Profesor Asistente. Facultad de Ciencias Médicas Mariana Grajales Coello. Universidad de Ciencias Médicas de Holguín. Holguín, Cuba. Email: marielin@ucm.hlg.sld.cu.
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