Validación de un ensayo ELISA para la determinación de anticuerpos anti LPS de Vibrio Cholerae.
Validation of an ELISA assay to determine antibodies against LPS of Vibrio Cholerae.
Yadira Pino, Tania Valmaseda, Yudisey Medina, Bárbara Cedré, Gemma Año, Hilda M. García, José Luis Pérez, Arturo Talavera, Irma González, Ileana Delgado y Luis García
Instituto Finlay. Centro de Investigación-Producción de Vacunas y Sueros. Ciudad de La Habana, Cuba. E-mail: ypino@finlay.edu.cu
RESUMEN
Para evaluar la respuesta inmunológica de cualquier candidato vacunal es necesario contar en el laboratorio con técnicas estandarizadas y validadas. Es por ello que en este trabajo se realizaron los ensayos para la estandarización del ELISA indirecto, usado para la determinación de anticuerpos séricos anti-LPS Ogawa contra cólera en suero de humanos inoculados por vía oral, así como la evaluación de los parámetros de validación típicos de este ensayo. Para la selección de las condiciones óptimas se evaluaron la concentración de recubrimiento, condiciones de bloqueo y dilución de conjugado, con el objetivo de seleccionar las mejores respuestas para el control positivo, el control negativo y el blanco en cada caso.Una concentración de 25 μg/mL de LPS Ogawa en PBS, como recubrimiento, durante toda la noche; leche descremada al 0,5% en PBS, 30 min a temperatura ambiente como bloqueo y el conjugado anti-IgA-HRP diluido 1:5000, resultaron las variables óptimas para el ensayo. En cuanto a la validación de la técnica los parámetros evaluados fueron precisión, exactitud, límite de detección, especificidad y robustez. Para ello se siguió un protocolo de validación que permitiera evaluarlos, y en todos los casos el ensayo se consideró adecuado, siempre y cuando el coeficiente de variación resultara ser menor del 20%. En todos los parámetros evaluados se cumplió con este requisito, considerando así los resultados confiables y reproducibles.
]]> Palabras claves: Cólera, ELISA, estandarización, validación.ABSTRACT
In order to evaluate the immunological response to any vaccine candidate, it is necessary to have standardized and validated laboratory techniques. For this reason the standardization of an indirect ELISA, used for determining serum antibodies against Ogawa LPS to cholera in sera of humans inoculated orally, was carried out; as well as the evaluation of the typical validation parameters for this assay. The optimal conditions for the coating concentration, blocking conditions and conjugate dilution were evaluated to select the best results for the positive control, the negative control and the blank. A 25 μg/mL concentration of Ogawa LPS in PBS left overnight for coating, 0,5% skimmed milk in PBS during 30 min at room temperature for blocking and anti-IgA-HRP diluted 1:5000 as conjugate were found to be the optimal variants for the assay. With respect to the technique validation, the parameters evaluated were precision, exactness, detection limit, specificity and robustness. A validation protocol allowing their evaluation was carried out. In all cases the assay was considered adequate, if the variation coefficient was less than 20%. For all the parameters evaluated this requisite was fulfilled, so that the results were considered to be reliable and reproducible.
Keywords: Cholera, ELISA, standardization, validation.
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