Validación de un ELISA tipo inhibición para cuantificar polisacárido Vi en la vacuna antitifoídica cubana vax-TyViââ.

Validation of an inhibition-type ELISA for quantifying Vi polysaccharide content in the Cuban Typhoid Vaccine vax-TyViä

Esther María Fajardo, Ileana Delgado, Luis Riverón, Luis Izquierdo, Nuris Iglesias, Eduardo Álvarez, Alicia Perojo, Nadia Costa, Yolexis Tamayo, Eylín Jorge, Belkis Hernández, Yonaydi Díaz, Argentina Cruces, Niurka Gutiérrez, Ana Cristina Puig, Aleida Mandiarote, Roselyn Martínez, Daniel Cardoso

Instituto Finlay. Centro de Investigación-Producción de Vacunas. Ave.27 No. 19805. La Lisa. A.P. 16017, C.P. 11600. Ciudad de La Habana, Cuba. E-mail: efajardo@finlay.edu.cu

RESUMEN

Se describe la validación de un ELISA tipo inhibición, reportado por primera vez en la literatura científica para cuantificar un antígeno vacunal: el polisacárido Vi de Salmonella Typhi, para ser empleado en el control de la calidad de la vacuna antitifoídica cubana vax- TyViâ. El ensayo consta de seis pasos: 1) Recubrimiento de placa de reacción con poli-L-lisina y posteriormente polisacárido Vi; 2) Bloqueo con leche descremada; 3) Inhibición o neutralización en tubos de suero anti-Vi de conejo, respectivamente, con polisacárido Vi de Curva de Calibración (concentraciones desde 1–32 μg/mL), control positivo y muestras de vacuna (3 diluciones); 4) Neutralización de anticuerpos anti-Vi libres, presentes en las mezclas anteriores, por el Polisacárido de Recubrimiento; 5) Reconocimiento de anticuerpos anti-Vi unidos a la placa (conjugado anti-IgG de conejo-fosfatasa alcalina) y 6) Revelado por reacción enzima-sustrato. Los parámetros de validación estudiados y sus resultados fueron: 1) Precisión, expresada como coeficiente de variación a tres niveles de concentración de polisacárido, comprendidos en el rango de su especificación (35, 50 y 70 μg/mL) y evaluada en términos de repetibilidad; precisión intraensayos (cuatro analistas) y reproducibilidad (seis analistas): £ 20%; 2) Linealidad (100*R2): 99,68 %; 3) Límite de detección: 0,5 μg/mL; 4) Exactitud (recuperación para las tres diluciones de la muestra: entre 100 y 118%), y 5) Robustez: no influye 1,5 h de bloqueo (p = 0,52) ni ± 5 min para leer placa (p = 0,56); influye grandemente la calidad del agua (p = 0,026), a favor del agua para inyección. El ensayo es adecuado para los fines propuestos y es una medida de la inmunogenicidad in vitro del polisacárido Vi.

ABSTRACT

Validation of an inhibition-type ELISA intended for quantifying a vaccine antigen, Vi polysaccharide from Salmonella typhi, is reported here for the first time in a scientific paper. It is devoted to the quality control of the Cuban typhoid vaccine vax-TyViä. The test requires six steps: (1) Coating the plate with poly-L-lysine and then Vi polysaccharide; (2) Blocking with skimmed milk; (3) Inhibition (or neutralization) in tubes of rabbit Vi antiserum with Vi polysaccharide contained in the Standard Curve (concentrations from 1 – 32 μg/mL), Positive Control and vaccine samples (3 dilutions) respectively; (4) Neutralization of free Vi antibodies existing in the previous mixtures by the coating polysaccharide; (5) Recognition of Vi antibodies bonded to the plate (Anti-rabbit IgG-alkaline phosphatase) and (6) Revealing by means of the enzyme-substrate reaction. The studied validation parameters and their results were: (1) Precision, expressed as the coefficient of variation, at three different polysaccharide concentration levels comprising the vaccine specification range (35, 50 and 70 μg/mL) and evaluated in terms of Repeatability, Intermediate Precision (four analysts) and Reproducibility (six analysts): £ 20%; (2) Linearity (100*R2): 99.68%; (3) Detection Limit: 0.5
μg/mL; (4) Accuracy (recovery at three different sample dilutions): between 100 y 118%, and (5) Robustness: neither 1.5 h blocking nor ± 5 min for plate reading influences the test (p = 0.52 and 0.56 respectively); however, water quality greatly influences the results (p = 0.026); water for injection showed the best results. The test is appropriate for the purpose it was validated; it also allows evaluating in vitro immunogenicity of Vi polysaccharide.

Keywords: ELISA, Vi polysaccharide, Salmonella typhi, Typhoid Vaccine

Texto completo formato PDF

REFERENCIAS

1. WHO Background document: The diagnosis, treatment and prevention of typhoid fever. WHO/V&B/03.07, 2003.
2. Levine MM, FerreccioC, Black RE, Germanier R. Large-scale field trial of Ty21a live oral typhoid vaccine in enteric-coated capsule formulation. Lancet 1987; 1(8541):1049-1052.
3. Klugman KP, Gilbertson IT, Koornhof HJ, Robbins JB, Schneerson R, Schulz D, Cadoz M, Armand J. Protective activity of Vi capsular polysaccharide vaccine against typhoid fever. Lancet 1987; 2(8569):1165-1169.
4. Plotkin SA, Bouveret-Le Cam N. A new typhoid vaccine composed of the Vi capsular polysaccharide. Arch Intern Med 1995; 55:2293-2299.
5. Riverón L, Cardoso D et al. Vax-TyViâ: Vacuna Cubana de Polisacárido Vi de Salmonella typhi. Biotec Aplicada 2003; 20(4):245-247.
6. Ochoa R, Baró M, Martínez JC, Mirabal M, Armesto M, Domínguez F. Seguridad e inmunogenicidad de una Vacuna de Polisacárido Vi de Salmonella typhi en Cuba. Rev Cub Med Trop 2003; 55(2):83-87.
7. Ochoa R, Martínez JC, Ginebra M, Ferriol X, Rodríguez V, Sotolongo F. Immunogenicity of a new Salmonella typhi Vi polysaccharide vaccine – vax-TyViâ - in Cuban school children and teenagers. Vaccine 2003; 21:2758-60.
8. Requirements for Vi polysaccharide typhoid vaccine. WHO Tech Rep Series 1994; 840:14-33.
9. Typhoid polysaccharide vaccine. European Pharmacopoeia 2002, 4th Edition, Version 4.2, 07/2002:1160.
10. Tijssen P. Practice and theory of enzyme immunoassays. En: Burdon RH, van Knippenberg PH (Eds.). Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol 15. Amsterdam, New York, Oxford, Elsevier, 1985.
11. Voller A, Bidwell DR, Bartlett A. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). A guide with abstracts of microplate applications. Dynatech Europe, Borough House, Guernsey GB, 1979.
12. Szu AC, Li X, Stone AL, Robbins JB. Relation between structure and immunologic properties of the Vi capsular polysaccharide. Infect Immun 1991, 59 (12):4555-61.
13. Ochoa R, Martínez JC, Ferriol X, García AM, Estrada E, Blanco R et al. Sensibilización de placas para ensayos inmunoenzimáticos con antígenos vacunales. VacciMonitor 2001; 10(4):14-17.
14. Plikaytis BD et al. Comparisons of Standard Curve-Fitting Methods to quantitate Neisseria meningitidis Group A Polysaccharide Antibody levels by Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay. J Clin Microb 1991; 29(7):1439-1446.
15. Plikaytis BD, Holder PF, Carlone GM. Program ELISA for Windows User’s Manual, version 1.00. Center for Disease Control and Prevention, Atlanta GA, USA, 1996.
16. PNO 12-157. Determinación de la concentración de polisacárido Vi de Salmonella Typhi en la Vacuna Antitifoídica vax-TyVi, mediante ELISA. Instituto Finlay, Vicepresidencia de Calidad,Cuba 2001.
17. Chaloner-Larson G. Guía de la OMS sobre los requisitos de las Prácticas Adecuadas de Fabricación (PAF). Segunda parte: Validación. WHO/VSQ/97.02. Ginebra, OMS, pp: 70-83, 1998.
18. Harmonised Tripartite Guideline. Validation of analytical procedures: Methodology. ICH, Nov. 1996.
19. PNO 15-011. Tarea Técnica para la preparación de Materiales de Referencia. Instituto Finlay, Dirección de la Calidad. 2001.
20. PNO 15-002. Preparación, caracterización e identificación de Materiales de Referencia. Instituto Finlay, Dirección de la Calidad.Cuba 2001.
21. Balls M, Fentem JH. Progress toward the validation of alternative tests. ATLA 1997, 25:33-43.
22. ImmunoELISAä.www.orgenics.com