Aniel Moya, Adriana Callicó, Bárbara Cedré.

Instituto Finlay. Centro de Investigación-Producción de Vacunas. Ave. 27 No. 19805.

La Lisa. Ciudad de La Habana. Cuba. AP 16017. CP 11600.

Correo electrónico: amoya@finlay.edu.cu

El lipopolisacárido (LPS) de bacterias gramnegativas se emplea en el desarrollo de candidatos vacunales, como antígeno expuesto en la preparación o formando parte de esta para aumentar su poder inmunogénico. Sin embargo, esta estructura química de la membrana externa puede ser también utilizada para clasificar bacterias. Según el LPS, presente en la membrana externa bacteriana, Pseudomonas aeruginosa se puede clasificar en 20 tipos somáticos diferentes, clasificación muy útil para estudios epidemiológicos. P. aeruginosa expone sus LPS en la membrana de forma estable, pero ocurren cambios en el fenotipo del LPS bacteriano durante la infección, sucesos que dificultan su clasificación. En estos momentos, los estudios que se desarrollan en el Instituto Finlay necesitan del empleo de tecnologías modernas de clasificación y del diagnóstico molecular para poder establecer patrones más precisos de expresión de los LPS por métodos que junto a los ya existentes permitan diferenciar cepas bacterianas de la misma especie en cualquier tipo de infección.

Palabras clave: Pseudomonas aeruginosa, serotipificación, lipopolisacárido, banda A y B del lipopolisacárido.

]]> Introducción
Las técnicas de tipificación son herramientas útiles para los estudios epidemiológicos. En la actualidad, para lograr una mejor caracterización de las cepas de Pseudomonas aeruginosa se describen varios métodos, entre los que se encuentran: la clasificación por biotipos, serotipos, antibióticos, piocinotipos bacterianos, el análisis de los plásmidos, así como los estudios del ácido desoxirribonucleico (ADN) cromosómico por electroforesis de campo pulsado (PFGE), el análisis del polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción (RFLP) y por la amplificación de los segmentos repetitivos del ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (REP-RCP) (1, 2).

En la serotipificación de cepas de P. aeruginosa, el lipopolisacárido (LPS) constituye el antígeno de membrana externa más utilizado (2, 3). Esta molécula es la base para los estudios epidemiológicos de clasificación de este microorganismo. Según la estructura de esos antígenos y su frecuencia de aparición en determinados ambientes, la serotipificación permite la selección de inmunógenos lipopolisacarídicos (2).

En el tema de P. aeruginosa y el desarrollo de nuevas vacunas (4), los estudios del LPS se dirigen de manera primordial al entendimiento de los factores relevantes en las etapas iniciales de la colonización por este microorganismo (5), así como a los mecanismos de evasión a las defensas del hospedero y a los eventos químicos que ocurren durante su síntesis (2).

Esta bacteria produce dos tipos de LPS característicos de la especie según la naturaleza del antígeno O de esta estructura antigénica (bandas de LPS A y B) y el antígeno O de la banda A es químicamente similar en todas las cepas de P. aeruginosa (6,7).

En ocasiones, luego del aislamiento de P. aeruginosa de su hospedero (8), los estudios de serotipificación se dificultan por los cambios fenotípicos y la aparición de cepas poliaglutinables, sobre todo en los aislamientos obtenidos de infecciones pulmonares de pacientes con fibrosis quística (FQ) (9).

Los cambios descritos anteriormente ponen en duda la utilidad de la serotipificación como una herramienta útil para los estudios epidemiológicos, aunque la principal causa de esta problemática no radica en la sensibilidad de la técnica, sino en la expresión de diferentes fenotipos bacterianos durante la infección (9), situación que puede enmascarar el resultado buscado.

En este artículo se analizan algunas características que dificultan la clasificación de las cepas de P. aeruginosa con el empleo de antisueros somáticos específicos. Profundizar en esta problemática contribuirá al mejor conocimiento de este microorganismo, permitirá también hacer una mejor interpretación del sistema de clasificación por serotipos y se podrá demostrar la potencialidad del mismo para el desarrollo de nuevas vacunas.

Sistema Internacional de Clasificación Antigénica (IATS)

Este sistema de la clasificación de cepas de P. aeruginosa se utiliza universalmente y basa la estructura química del LPS presente en la membrana externa de esta especie (2).

Liu, et al., prefirieron el esquema de clasificación denominado como “The International Antigenic Typing Scheme” (IATS), sistema muy ventajoso y que designa los antígenos O por numeración continua e incluye 10 serogrupos similares al esquema original de Lanyi y Bergan, método que utiliza la denominación por letras (a, b, c). Aunque también existe el esquema de clasificación de P. aeruginosa, según Homma (11); en estos momentos el esquema de la IATS es el más utilizado para la clasificación de cepas, ocupando después del RFLP, el segundo lugar en especificidad, hecho que queda demostrado en el estudio multicéntrico realizado en 1994 y que incluye la comparación de varios métodos de tipificación (2).

Si bien la posibilidad de clasificar cepas de P. aeruginosa se describe desde 1957 (10), no es hasta 1983 que se publican los primeros resultados del sistema que agrupa las cepas en 17 serotipos diferentes, sistema que establece la existencia de al menos 17 antígenos somáticos termoestables, detectados por anticuerpos específicos (6). A partir de los resultados obtenidos se desarrollan nuevos métodos de clasificación serológica basados en el antígeno O de los LPS, utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales más específicos contra los 17 antígenos somáticos de P. aeruginosa (12).

Al emplear el sistema de la IATS, cerca del 10% de los aislamientos clínicos son no-tipables, hecho que condujo al desarrollo de un nuevo esquema que incluía 3 serotipos más de P. aeruginosa (6) y que pretendía cubrir todas las formas posibles de LPS presentes en este microorganismo.

El Laboratorio de Microbiología del Instituto Finlay emplea estos antígenos somáticos para la obtención de antisueros específicos útiles para la clasificación serológica de cepas aisladas de infecciones pulmonares de casos con FQ, así como en la identificación de cepas obtenidas de pacientes quemados (12, 14). El análisis de las cepas mucoides provenientes de pacientes con FQ mostró que los mayores porcentajes correspondían a cepas poliaglutinables. Esos aislamientos presentan una pobre o variable expresión del LPS bacteriano de la banda B, situación que precisa del perfeccionamiento de los métodos de serotipificación empleados.

Sin embargo, la disponibilidad de los antisueros específicos permite la serotipificación de las cepas de P. aeruginosa y reduce la necesidad de recurrir a cultivos de referencia internacionales para homologar así los resultados.

Obtención de antisueros para el diagnóstico
El Instituto Finlay produce antisueros policlonales específicos en conejo para la serotipificación de cepas de P. aeruginosa aisladas de infecciones hospitalarias (14). Para su obtención se inmunizan conejos con células completas inactivadas y posteriormente, se evalúan frente a las cepas patrones internacionales serotipo específicas, siguiendo la metodología de aglutinación descrita por Lanyi (15). Las reacciones cruzadas se eliminaron por absorción con cepas patrones heterólogas y se logra obtener un producto útil para la serotipificación de este microorganismo.

A partir de 1988, se incorpora en Cuba la serotipificación de las cepas de P. aeruginosa aisladas de casos clínicos y muestras ambientales (16). Al inicio se emplearon sueros diagnósticos elaborados en la República Checa, capaces de reconocer los 12 tipos somáticos del esquema de Habs (10). Sin embargo, debido a la aparición de cepas poliaglutinables o no tipables, este esquema no permitía la clasificación de todos los serotipos. El interés de hacer estudios más completos condujo a la incorporación de antisueros producidos en China, estos mostraron un mayor espectro diagnóstico para los nuevos aislamientos de las cepas de P. aeruginosa circulantes en Cuba (6).

Esnard publica en 1997 los resultados obtenidos en la tipificación de 355 cepas de P. aeruginosa aisladas de muestras clínicas y ambientales durante el período comprendido entre 1988 a 1989, remitidas por los centros provinciales de Higiene y Epidemiología de las diferentes regiones de Cuba (17). En su trabajo aplica la técnica de aglutinación en lámina y un panel con 20 sueros diagnosticadotes, producidos en el Instituto de Productos Biológicos de Chengdu (Ministerio de Salud Pública, República Popular China) (6). Este panel de antisueros permitió reconocer los 17 antígenos somáticos de la IATS y los 3 nuevos antígenos somáticos reportados (6). Se pudo tipificar el 97% de las cepas de P. aeruginosa, se evidenció la factibilidad de estos antisueros y, por primera vez en Cuba se demostró la prevalencia del serotipo O11, así como la circulación de nuevos tipos somáticos O18 (1%), O19 (5%) y O20 (3%) (17).

Empleo de la serotipificación en nuestras investigaciones

El LPS de P. aeruginosa constituye un antígeno de interés para el desarrollo de inmunógenos contra este microorganismo y aunque, esta molécula no ofrece una protección heteróloga permite seleccionar los serotipos más frecuentes y generar vacunas con efectos inhibitorios sobre la colonización bacteriana. Tal es el caso de una vacuna que combina 8 LPS de distintos serotipos con la exotoxina A, estudios que se encuentran en un ensayo clínico Fase III y muestran resultados interesantes respecto al tipo de inmunidad que generan (20).

En Cuba, además de los trabajos de búsqueda de antígenos vacunales, la serotipificación se emplea para la clasificación de cepas aisladas de casos con FQ y en el diagnóstico de infección pulmonar por P. aeruginosa (14). Este aporte, junto con los estudios de susceptibilidad antimicrobiana contribuyen al estudio epidemiológico de las infecciones en casos con FQ, entidad clínica hereditaria autosómica recesiva de elevada mortalidad, que se presenta en edades tempranas de la vida y provoca infecciones pulmonares bacterianas recurrentes, entre las que P. aeruginosa es uno de los agentes etiológicos más frecuente (21).

En el Instituto Finlay, el análisis de muestras de suero humano normal contra LPS de 10 serotipos distintos de P. aeruginosa, mostró al serotipo O11 como uno de los más frecuentes (22, 23), resultado que coincide con el de Esnard. Disponer de toda esta información permite trabajar en la obtención de antígenos que incluyan esta estructura y en la generación de vacunas de subunidades. Debido a la accesibilidad de los LPS y las proteínas de membrana externa en la superficie bacteriana, estas estructuras constituyen moléculas blanco para los estudios de vacunas que realiza esta Institución. Además, para crear nuevos candidatos vacunales contra P. aeruginosa se investiga la búsqueda de antígenos más conservados e inmunogénicos (24).

En otro estudio de clasificación de cepas de P. aeruginosa, aisladas de pacientes quemados, no se observó la presencia del serotipo O11, identificándose como más frecuentes a los serotipos O4 y O5, aunque los tipos O1, O6 y O13 mostraron porcentajes bajos. Se consideró que la acción de los anticuerpos específicos contra el LPS tipo O11, observados en la población, podría haber sido la causa del no aislamiento de ese serotipo en los pacientes quemados infectados (12). Los anticuerpos específicos contra el LPS bacteriano desempeñan un importante papel en las infecciones por P. aeruginosa (25).

Al utilizar sueros serotipo específicos para la clasificación de cepas aisladas de casos con FQ e infectados con P. aeruginosa, así como en aislamientos de infecciones nosocomiales y pacientes quemados, los serotipos prevalentes fueron: O1, O4, O6, O9 y O11 (14). El trabajo clasificó 14 aislamientos de pacientes con FQ y entre ellos predominó el serotipo 09 (85%). Se reconocieron también porcentajes bajos de otros serotipos y hubo cepas poliaglutinables en los casos de FQ; algo común en las infecciones pulmonares debido a la presencia de cepas mucoides formadoras de biopelículas (26). Los microorganismos que aglutinaron con más de un suero se consideraron "poliaglutinables" y por tanto "no tipables", terminología también aplicada a las cepas que no aglutinaron frente a ningún suero.

Efecto del fenotipo bacteriano en la serotipificación

Cuando las cepas no pueden clasificarse por el esquema de la IATS, es difícil obtener un resultado certero, situación que se presenta con frecuencia en las cepas de P. aeruginosa aisladas de pacientes con infección pulmonar crónica. En estos microorganismos se observa una pérdida del antígeno O del LPS y una elevada producción de alginato (27).

P. aeruginosa puede sufrir cambios de su fenotipo, según el ambiente en el cual desarrolle su infección y si este cambio involucra los LPS que componen su membrana externa, es imposible dar una correcta clasificación por serotipificación de la cepa aislada y hay que recurrir a otras técnicas como el análisis del polimorfismo de fragmentos de ADN (RFLP), herramienta muy empleada hoy día en la epidemiología molecular (18) y que basa su caracterización en el análisis comparativo del genoma de las bacterias analizadas con patrones de migración de genes determinados. Igual ocurre cuando se emplean inmunoglobulinas para controlar infecciones por P. aeruginosa (28), donde la gran limitante del empleo de inmunoglobulinas serotipo específico es la variabilidad de la molécula de LPS, que puede incluso determinar el grado de reconocimiento de los anticuerpos antiLPS específicos cuando esta bacteria cambia de fenotipo liso a rugoso y no expone de forma adecuada los antígenos O-sacarídicos del LPS hacia los que el anticuerpo empleado tiene especificidad.

El LPS es una molécula compleja y está formada por tres regiones: la O polisacarídica (antígeno O), región central oligosacarídica (Core) y el lípido A, responsable de la actividad endotóxica de los LPS (29).

El lípido A “como componente hidrofóbico”, asegura el anclaje del LPS en la estructura de la membrana externa, mientras que el núcleo une al lípido A con la región O-polisacarídica (porción más expuesta del LPS) y en contacto con el medio extracelular (7). El Lípido A tiene el mayor efecto biológico, induciendo la aparición de inmunomoduladores en el hospedero y cuando está en exceso puede, por su efecto activador, conducir al shock séptico y la muerte (7).

El LPS de P. aeruginosa es la arquitectura polisacarídica más estudiada. Según las estructuras de sus antígenos O, desde 1960 se realizan intentos para correlacionar la inmunoespecificidad de este microorganismo (7). La estructura más conservada del LPS (el lípido A), muestra similitud con cepas de la familia Enterobacteriaceae.

La región del core oligosacarídico está compuesta por: D-glucosa, L-rhamnosa, 2-amino-2-deoxy-D-galactosa, L-glycero-D-manno-heptosa (Hep), ácido 3-deoxi-D-manno-octulosonico (Kdo), L-alanina y fosfato (30).

La parte más variable del LPS es la región O polisacarídica (antígeno O), estructura que determina el serogrupo o subgrupo y cuya composición se conoce y analiza en Pseudomonas desde la década del 70 (7). El estudio de los monosacáridos de este antígeno reveló la presencia de xylosa, glucosa, rhamnosa, glucosamina, 2,4-diamino-2, 4, 6-trideoxy-D-glucosa y ácido L-galactosaminuronico y como carácter diferenciador se encuentra la baja frecuencia de monosacáridos neutros que la componen (D-glucosa, L-rhamnosa, D-xylosa, D-ribosa), estructuras que la hacen diferente al resto de las bacterias entéricas (7).

Múltiples trabajos describen el poder inmunogénico del LPS al interactuar con el sistema inmune del hospedero (30). Cuando el LPS bacteriano entra en contacto con el tejido del hospedero, usualmente se une por la proteína fijadora de LPS, que se transfiere al receptor CD14 en los macrófagos, induciendo así la secreción de citocinas como el factor de necrosis tumoral alfa, la interleuquina-1(IL-1), Il-6, Il-8, y la Il-10 (citocinas conocidas como marcadores de inflamación). Estos mediadores potencian la reacción inmune del hospedero hacia la infección bacteriana (7). La parte O sacarídica del LPS de P. aeruginosa presenta gran variabilidad y al no estar presente la molécula completa del LPS, este microorganismo puede escapar de algunos de estos mediadores y continuar su infección.

En las infecciones pulmonares crónicas de pacientes con FQ se observa la pérdida completa o parcial del antígeno O (fenotipo rugoso). Esos cambios en las propiedades de la superficie bacteriana ocasionan problemas para los estudios epidemiológicos y la tipificación de las cepas de P. aeruginosa obtenidas de casos con FQ. Se conoce que las modificaciones en el LPS se deben a la presencia o ausencia de uno de los tipos de región O sacarídica del LPS (A o B), que P. aeruginosa expresa en su membrana externa (7); donde la banda A es menos inmunogénica. Además, la pérdida de la banda B del antígeno O le confiere resistencia a algunos antimicrobianos (aminoglucósidos) (29), permitiéndoles también evadir las defensas del hospedero.

Banda A y B de la región antigénica O del LPS ]]> P. aeruginosa produce dos formas de antígeno O, conocidas también como banda A (homopolímero) y banda B (heteropolímero); ambas estructuras son antigénica y químicamente diferentes. La banda A de P. aeruginosa está compuesta por residuos de D-rhamnosa (D-Rha), dispuestos como unidades repetitivas de trisacáridos. Esta banda es un componente común en todos los serotipos de P. aeruginosa notificados (7) y al ser evaluadas con sueros serotipificadores, se les atribuye la poliaglutinación presente en las cepas heterólogas (30). La estructura del polisacárido D-rhamnano está compuesta por alrededor de 70 residuos D-Rha y es mucho más corta que la banda B del antígeno O.

Cada unidad repetitiva de la banda B, puede ser di o pentasacarídica y su extensión está determinada por el estadío de crecimiento y por la temperatura (31). La banda A está presente en todas las cepas de P. aeruginosa de manera estable; mientras que, en ocasiones, la banda B es diferente.

Estudios realizados en animales indican que, mientras los anticuerpos específicos a la banda B del LPS protegen a ratones neutropénicos contra el reto usando cepas con LPS fenotipo liso, los anticuerpos específicos contra la banda A no tienen el mismo efecto (32).

Durante su clasificación se han identificado cepas de P. aeruginosa no aglutinables frente a los antisueros disponibles para la serotipificación. En estos momentos se conoce mejor esta actividad y la presencia de cepas no aglutinables pudiera atribuirse a la ausencia del LPS tipo B, estructura responsable de la seroespecificidad de este microorganismo. Quiere decir que la serotipificación de P. aeruginosa se basa en el reconocimiento de la banda B del LPS y es diferente en cada uno de los serotipos notificados (7). La banda B varía de un serotipo a otro debido a la composición de los azúcares que conforman su estructura, de ahí la diversidad de reconocimiento. Al no estar presente la banda B, el método de serotipificación no tiene ningún valor diagnóstico, pues no permite la diferenciación entre los mismos.

Esta característica junto a la formación de biopelículas constituye la causa principal del fracaso de la serotipificación como herramienta diagnóstica. Ambas podrían constituir las formas de evadir el papel de algunos efectores de la respuesta inmune del hospedero y al no tenerse en cuenta la clasificación por los métodos tradicionales, se pueden obtener resultados contradictorios.

La transformación de Pseudomonas en cepas mucoides, por la síntesis de alginato, la convierten en un microorganismo no tipable por los métodos de tipificación tradicionales. Esta realidad representa una limitación para los estudios epidemiológicos y conduce al desarrollo de métodos moleculares, técnicas mucho más completas por incluir características contenidas en el genoma de este microorganismo.

Las investigaciones actuales se dirigen a dilucidar los mecanismos moleculares de la expresión del LPS tipo B durante las infecciones, evaluando qué genes están vinculados con la expresión o inhibición de su producción. Se sabe que los cambios en el fenotipo del LPS afectan las propiedades de adherencia y su influencia en la formación de la biopelícula (27).

P. aeruginosa puede expresar cambios en sus factores de virulencia. Los cambios fenotípicos se observan con frecuencia en las infecciones pulmonares de los casos con FQ. La transformación más dramática es la conversión de la forma no mucoide al fenotipo mucoide, alteración que se presenta cuando P. aeruginosa se establece en los pulmones de los pacientes con FQ y se correlaciona con una pobre función pulmonar. Además de la producción de alginato, dentro de los pulmones se inicia un crecimiento de P. aeruginosa en forma de microcolonias, formación que recibe el nombre de biopelícula. En esta estructura, formada por células embebidas dentro de la matriz del alginato (33), las células dejan de producir de forma completa o parcial la banda B del antígeno O del LPS; aunque mantienen la producción de la banda A. Tales cambios son problemáticos para estudios epidemiológicos de serotipificación, específicamente en los pacientes con FQ.

Síntesis del LPS en P. aeruginosa

La conservación de los genes para la síntesis de la banda A se ha determinado para todos los serotipos de P. aeruginosa que define la IATS (7,30). La banda A y B, se sintetizan por mecanismos independientes. La heterogeneidad de la región O del LPS está influenciada por el ambiente. Las elevadas temperaturas de crecimiento disminuyen el tamaño de las cadenas O sacarídicas (31), apareciendo un aumento en la producción del fenotipo rugoso o semirrugoso. Igual ocurre con altos niveles de NaCl, MgCl2, glicerol y sacarosa, los bajos valores de pH y de fosfato. Esta influencia es modesta cuando se miden los cambios que ellas provocan sobre la banda A del LPS, cuya expresión en la membrana externa bacteriana es más estable (31).

La secuencia completa de los cluster de todos los genes para los LPS pertenecientes a los serotipos definidos por la IATS se ha publicado y es posible, teniendo la secuencia de primers (cebadores), emplear el PCR para amplificar los genes de los LPS de cualquier serotipo. Contar con esta herramienta posibilitaría emplear métodos basados en PCR para definir el serotipo bacteriano, independientemente de sí el fenotipo es liso o rugoso, sí la cepa es mucoide o no; solo aislando el DNA cromosómico será posible determinarlo (36).

Los estudios epidemiológicos y de resistencia a los antimicrobianos realizados en los pacientes de riesgo necesitan con urgencia del empleo de tecnologías modernas de clasificación y del diagnóstico de los agentes etiológicos de las enfermedades infecciosas para poder establecer así los patrones epidemiológicos más precisos. En estos momentos los métodos convencionales basados en la serotipificación no son muy exitosos en los estudios epidemiológicos de cepas multirresistentes. Los cambios ocurridos en el espectro de los agentes infecciosos, las epidemias intrahospitalarias y los pacientes inmunocomprometidos han forzado el empleo de nuevas estrategias moleculares como el RFLP en los estudios epidemiológicos que complementen o sustituyan los métodos tradicionales utilizados para P. aeruginosa (37).

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Considerations about somatic antisera uses in classifying Pseudomonas aeruginosa strains by serotypes

Abstract

Lipopolysaccharides (LPS) of gramnegative bacteria are used for developing vaccine candidates as a complete exposed antigen in the preparation or as essential part of vaccines to improve its immunogenic power. Nevertheless, this outer membrane structure can also be used in bacterial classification according to the LPS chemical structure in outer membrane structure. Twenty different LPS have been reported as somatic antigens useful in P. aeruginosa strains classification in epidemiological studies. Current studies of Finlay Institute need the introduction of up-dated classification technologies and molecular diagnosis tools to establish more accurate epidemiological standards to improve the reports about the presence of new strains at the infection site.

Keywords: Pseudomonas aeruginosa, Serotyping assay, Lipopolysaccharides, LPS A and B bands.