Usefulness of lung-mouse animal model to evaluate the virulence of Shigella spp candidate vaccine straims

Olga M. Martínez1, Luis A. Riverón2, Juan F. Infante2, Viviana Pérez2, Sergio Sifonte2, Carmen Soto2, Ranset Diez2, Isis Montano2, Leopoldo Araujo3.

1 Centro de Investigaciones Clínicas. Calle 34 Rpto. Coly. Playa, Ciudad de La Habana, Cuba.
2 Instituto Finlay. Centro de Investigación-Producción de Vacunas. Ave. 27 No. 19805 e/ 198 y 202. La Lisa, Ciudad de La Habana, Cuba.
3 Hospital "Hermanos Ameijeiras". San Lázaro y Belascoaín. Centro Habana, Ciudad de La Habana, Cuba.
Correo electrónico: lriveron@finlay.edu.cu

RESUMEN ]]>

Shigella flexneri y Shigella sonnei, como cualquier otra especie del género Shigella, se sitúan entre los principales agentes etiológicos de las enfermedades diarreicas agudas, sobre todo aquellas que ocurren en los países en vías de desarrollo, aunque por la baja dosis infectante de este enteropatógeno no se excluyen los países desarrollados. Esta situación conlleva a la elaboración de vacunas para prevenir esta enfermedad y la necesidad de un modelo animal que pruebe la eficacia protectora e inmunogénica de posibles candidatos vacunales contra la shigellosis, situación que ha motivado numerosos estudios por la dificultad de demostrar la enteropatía intestinal en los monos y humanos. Lo anteriormente expuesto, más la capacidad de Shigella spp para mostrar resistencia a los antimicrobianos, motivó la realización de este trabajo. En el mismo se constató la utilidad del modelo animal ratón-pulmón para evaluar la virulencia de candidatos vacunales a partir de este microorganismo. Se utilizó la técnica de inoculación intranasal con una concentración entre 107 y 109 UFC de cepas de Shigella flexneri y Shigella sonnei. Por todos los resultados obtenidos con el modelo animal ratón-pulmón se concluyó que este modelo puede ser eficiente para los estudios preclínicos de cualquier candidato vacunal a partir de Shigella spp.

Palabras clave: Shigella flexneri, Shigella sonnei, enteropatía intestinal, modelo ratón-pulmón.

ABSTRACT

Shigella flexneri and Shigella sonnei, as other species of Shigella, are among the main etiological agents of acute diarrhoeal diseases worldwide, specially in developing countries, although we do not exclude developed ones, because of their low infective dose, between 10 and 100 colonies. This leads to the preparation of vaccines to prevent this illness and the need for an animal model to demonstrate the protective and immunogenic effectiveness of the shigellosis candidate vaccines. Many studies have been carried out since the intestinal enteropathy is difficult to demonstrate in monkeys and humans. The aforementioned and the capacity of Shigella sp to become resistant to antibiotic treatments motivated our study. In it we demonstrated the usefulness of the mouse-lung animal model to evaluate the virulence of vaccine candidates. Intranasal inoculation with Shigella flexneri and Shigella sonnei in concentration on between 107 and 109 CFU was used. The conclusion was that the lung-mouse animal model can result efficient for preclinical studies of any Shigella spp vaccine candidate.

Keyswords: Shigella flexneri, Shigella sonnei, intestinal enteropathy, lung-mouse model.

Introducción ]]>

Las enfermedades diarreicas agudas (EDA) constituyen un problema de salud para numerosas regiones del mundo. Su incidencia y elevada morbimortalidad en los niños y ancianos hacen de esta entidad clínica un tópico de especial interés. Entre su agentes etiológicos se encuentran las bacterias del género Shigella y al cuadro clínico que ocasionan se le denomina disentería bacilar o shigelosis. Las EDA por Shigella se presentan principalmente en los países en vías de desarrollo, regiones donde afectan fundamentalmente a los niños menores de 10 años. Se calcula que anualmente ocurren alrededor de 200 millones de casos en el mundo y que la cifra de fallecidos asciende hasta los 2,2 millones. El 69% de todos los episodios y 61% de las defunciones ocasionadas por Shigella se presentan en los niños menores de cinco años, aunque suele producir también un gran impacto en los adultos, grupo donde afecta entre el 20-30% de los individuos con más de 20 años.

La shigelosis es una infección bacteriana aguda autolimitada del intestino humano que afecta predominantemente al colon y el recto, invadiendo las células epiteliales y el epitelio colónico, sitios donde puede producir una colitis que afecta principalmente al colon rectosigmoideo, produciendo diarreas mucopiosanguinolentas y un cuadro disentérico severo que favorece el desarrollo de complicaciones graves (perforaciones intestinales, convulsiones y anorexia prolongada) (1, 2, 3, 4).

La elaboración de vacunas para prevenir la shigelosis es de trascendental importancia puesto que las medidas empleadas para controlar y evitar esta afección, en especial las terapéuticas, tienen una eficacia limitada. Las cepas de Shigella presentan con frecuencia resistencia antimicrobiana, situación que impide la recuperación rápida de los casos clínicos y en ocasiones, conduce al fallecimiento de los mismos (5).

El desarrollo de un modelo animal para probar la eficacia protectora, así como la inmunogenicidad de una cepa vacunal contra la shigelosis, facilitaría la evaluación de los posibles candidatos vacunales (6). Solo los humanos y primates no humanos son susceptibles a las especies de Shigella. La eficacia de los posibles candidatos vacunales contra este microorganismo se evalúa en los monos, animales que proporcionan un modelo adecuado y muestran una completa protección contra algunas especies (7).

Por razones económicas y éticas se requiere la búsqueda de otros modelos animales que permitan valorar resultados con condiciones diferentes a las creadas intencionalmente y que muestren la habilidad de Shigella para producir keratoconjuntivitis en los curieles, ratones y conejos (Test de Sereny), prueba que evalúa la capacidad de las cepas virulentas para invadir las células epiteliales de la conjuntiva (6, 8). Todo hizo pensar que el ratón pudiera simular la extensa y letal enteropatía intestinal que se produce en los monos. No obstante, conociendo que algunos estudios realizados en ratones lo excluyen como modelo de shigellosis intestinal, su práctica no ha sido descartada y, posteriormente, otras investigaciones emplean la técnica de inoculación intranasal para evaluar la reactogenicidad, inmunogenicidad y eficacia de diferentes candidatos vacunales de Shigella (9, 10). ]]>

Otros estudios en ratón inoculados oralmente permitieron observar que accidentalmente una suspensión de Shigella introducida en el Sistema Respiratorio, podía ser aislada en cultivo puro del pulmón, y observarse en cortes histológicos la patogénesis de la infección pulmonar por Shigella (11), siendo un buen indicativo de que este microorganismo invade el epitelio pulmonar provocando infiltrados agudos supurativos y necrosis epitelial semejante a la shigellosis intestinal (10). Este método es conocido como el modelo ratón-pulmón.

En este trabajo se demostró que el uso de la técnica de inoculación intranasal en ratones es adecuado para estudiar cepas de Shigella flexneri y Shigella sonnei. Además, con el empleo de este modelo se pudiera complementar los resultados que proporciona el Test de Sereny, considerado, hasta este momento, la prueba de oro de la shigelosis para los animales.

Materiales y Métodos

Ratones

Se utilizaron ratones Balb/c machos de 18 semanas de edad y con un peso entre 20-25 g, suministrados por el Centro Nacional para Animales de Laboratorio de Cuba (CENPALAB). Durante todo el experimento los animales se alimentaron con pienso concentrado para ratones, procedente de la misma fuente que los animales y agua ad limitum. Para su manutención se utilizaron cajas de polipropileno tipo T2 y como material de encamado se utilizó al bagazo desmeollado de la caña de azúcar, el que se removió dos veces por semana. ]]>

Los protocolos de trabajo se analizaron y aprobaron por una comisión de ética institucional para el cuidado y uso de los animales de laboratorio.

Cepa bacteriana

Las cepas de Shigella que se emplearon en este estudio fueron donadas gentilmente por el Centro Provincial de Higiene y Epidemiología de Ciudad de La Habana, Cuba. Previo al ensayo, estas se sembraron en medio Caldo Triptona Soya (TSB) y se identificaron por pruebas bioquímicas de Kligler y LIA, obteniéndose la imagen característica de Shigella sp. Posteriormente, se les realizó la identificación serológica mediante la técnica de aglutinación en láminas portaobjetos con antisueros elaborados por la Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay", Cuba. De esta forma se determinó la identidad de las cepas de S. flexneri y S. sonnei.

Inoculación intranasal de ratones

Los ratones se anestesiaron con Pentobarbital Sódico por vía intraperitoneal. Los animales se inocularon con 30 L de una u otra cepa bacteriana, a una concentración de 5 x 107-109 UFC. Después de 72 h., mediante dislocación cervical, se les practicó la eutanasia diariamente, tanto a ratones inoculados como a los controles, hasta completar los 10 días de duración del ensayo. Posteriormente, se realizó la necropsia y se describieron las lesiones observadas, extrayéndose los pulmones para realizar estudios histopatológicos y cultivos bacterianos. ]]>

Estudio microbiológico del pulmón

Los pulmones extraídos fueron lavados tres veces con Solución Salina Estéril (SSE), y macerados en morteros de porcelana estériles para su posterior siembra en placas de Petri con medio Agar Triptona Soya (TSA) más Rojo Congo (RC) al 0,01% y se incubaron posteriormente a 37 0C de 18 a 24 h.

Estudio anatomopatológico

Todos los animales se sometieron a un análisis anatomopatológico macroscópico, con el objetivo de constatar la existencia de cambios en los órganos o tejidos, realizándose las correspondientes descripciones en los casos donde se observó alguna alteración.

Para los análisis histopatológicos se tomaron muestras de los pulmones de cada uno de los ratones que intervinieron en el ensayo, estas fueron procesadas posteriormente por la técnica de inclusión y cortes de parafina, se tiñeron con Hematoxilina-eosina y se les realizó una descripción detallada (12).

La infección natural por Shigella confiere inmunidad y protección contra las infecciones subsiguientes ocasionadas por microorganismos virulentos homólogos (13, 14, 15). Los epítopes antigénicos que confieren protección contra las cepas virulentas no están completamente definidos; por lo tanto, este modelo animal ratón-pulmón para medir la eficacia de una vacuna contra la shigellosis requiere que la infección del animal proporcione una respuesta inmune similar a la que se presenta en los humanos que contraen la enfermedad. En este modelo Shigella invade los pulmones de manera similar a lo que ocurre en el epitelio intestinal (10). Otros autores demuestran también que la vía de inoculación intranasal en los ratones puede ser o establecer un balance entre la eficacia y reactogenicidad de una vacuna (16).

Shim y colaboradores, al retar curieles con cepas virulentas de S. flexneri serotipo 2a y 5a por vía rectal, demostró el desarrollo de una colitis rectal aguda y severa que provocó una pérdida aproximada del 20% del peso corporal, tenesmo en las 24 h siguientes a la inoculación y la consecuente invasión y colonización distal del colon, aunque estas manifestaciones desaparecieron a las 48 h posteriores (17).

En este estudio preliminar los animales se infectaron con una concentración de 107-109 UFC y fueron inspeccionados diariamente para observar posibles alteraciones clínicas. La evaluación de las mismas se basó fundamentalmente en la sintomatología presentada y esta se caracterizó por: decaimiento, disminución de la actividad, pérdida del apetito, fiebre y erizamiento de los pelos, hasta shock séptico mortal en el transcurso de los 10 días. Los animales controles se inocularon con SSE y no presentaron esta sintomatología.

A las 24 h de la inoculación, en los ratones inoculados se observaron algunas de las manifestaciones clínicas ya mencionadas (decaimiento y pérdida de su actividad) y a las 72 h en un número elevado de los mismos se constató: erizamiento de los pelos, fiebre, anorexia y algunos fallecieron. Este fue el comportamiento general de todos los ratones durante los 10 días del experimento.

La presencia de estas lesiones permitió diagnosticar una neumonía fibrinopurulenta aguda grave de las lesiones descritas. Sin embargo, en los ratones controles no se observaron lesiones de valor diagnóstico, lo que permitió establecer una relación causa-efecto directa entre las lesiones antes descritas y las inoculaciones practicadas en todos los ratones infectados con Shigella; lesiones similares se describen por Mallett (10) quien las diagnostica como una neumonía fibrinopurulenta grave en condiciones similares a las empleadas en este trabajo.

En el cultivo microbiológico de todas las muestras se obtuvo un aislamiento puro de Shigella. No obstante, Antonella Cersini incluye el conteo de colonias en un trabajo similar a este, aunque lo realiza con diferentes cepas mutantes de Shigella, modificación que le permite establecer diferencias de virulencia entre ellas (16).

Figuras 1 y 2: Se observan infiltrados agudos supurativos, necrosis epitelial, fibrosis purulenta y bronquiectasias producidas por la inoculación de los ratones con S. sonnei por vía intranasal.

Conclusiones

Por los resultados obtenidos en este estudio con el modelo animal ratón-pulmón se puede concluir que este modelo puede ser eficiente para los estudios preclínicos de cualquier candidato vacunal de Shigella spp. En el caso que se usara paralelamente el Test de Sereny, el modelo ratón-pulmón serviría para correlacionar ambos resultados.

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2. Joille M, Farah KB, Phillippe JS. Secretion of Shigella flexneri Ipa invasions on contact with epithelial cells and subsequent entry of the bacterium into cells are growth stage dependent. Infection and Immunity 1997:774-782
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Recibido: Diciembre de 2007

Aceptado: Marzo de 2008