ARTÍCULO ORIGINAL
Caracterización molecular de cepas de Pasteurella multocida aisladas del ganado bovino
Molecular characterization of Pasteurella multocida strains from cattle
Yenner Sánchez-Enamorado,1* Osney Leiva-Peláez,1 María Belsis Cordero-Ramírez, 1 Magdalena Oliva-López,1 Karen León-Arcia2
1 Grupo Empresarial LABIOFAM,
]]> 2 Centro de Neurociencias de Cubaemail: yunaisi.tamayo@labiofam.co.cu
* Dra Medicina Veterinaria y Zootecnista.
RESUMEN
La Pasteurelosis es una enfermedad producida por la bacteria Pasteurella multocida miembro del género Pasteurella, que afecta a una gran variedad de animales domésticos y salvajes. La bacteria se caracteriza por ser Gram negativa, inmóvil, cocobacilar y anaerobia facultativa. La aplicación de métodos genotípicos resulta de gran utilidad y permiten superar limitaciones de los procedimientos fenotípicos tradicionales. El objetivo de este trabajo fue determinar la relación genética entre las cepas B1, B2 y B3 de P. multocida propuestas como candidatos vacunales. Las cepas procedieron del cepario de la Empresa Productora de Vacunas Virales y Bacterianas, que pertenece a los Laboratorios LABIOFAM. Las cepas en estudio fueron analizadas con las técnicas moleculares de Reacción en Cadena de la Polimerasa y electroforesis en campo pulsado. Se pudo confirmar que las tres cepas pertenecían a la especie P. multocida, subespecie multocida tipo capsular A. De igual manera se detectó que las cepas B1 y B3 son indistinguibles genéticamente entre sí y que la B2 poseía un 91% de similitud con respecto a las dos primeras. Los resultados obtenidos mediante la identificación y clasificación de estas cepas, permitirán el desarrollo de vacunas contra P. multocida.
Palabras claves: Pasteurella multocida, PCR, electroforesis en campo pulsado.
ABSTRACT
Pasteurellosis is a disease caused by Pasteurella multocida bacterium, which affects a variety of domestic and wild animals. P. multocida is a Gram negative, non-motile, and facultative anaerobic cocobacillus, from genus Pasteurella. Genotyping methods are useful to improve the limitations of the traditional phenotyping methods. The aim of this paper was to determine the genetic relationship between P. multocida strains B1, B2 and B3, proposed as vaccine candidates. The strains came from the culture collection of the Viral and Bacterial Vaccine Producing Enterprise, LABIOFAM (acronym in Spanish), and were analyzed with polymerase chain reaction and pulsed field electrophoresis. It was confirmed that the three strains belonged to P. multocida species, capsular type A multocida subspecies. It was also proved that B1 and B3 strains are genetically indistinguishable, and that B2 had a 91% of similarity with B1 and B3. Results obtained by the identification and classification of these strains will permit the development of vaccines against P. multocida.
]]> Keywords: Pasteurella multocida, PCR, pulsed field gel electrophoresis
INTRODUCCIÓN
La Pasteurelosis es una enfermedad producida por la bacteria Pasteurella multocida (P. multocida) miembro del género Pasteurella, y es parte de la microbiota normal del sistema respiratorio superior de muchas especies animales (1). Se considera una enfermedad zoonótica, su principal reservorio son los animales domésticos y silvestres. Los animales domésticos padecen diferentes presentaciones de pasteurelosis: cólera aviar, neumonía porcina, otras infecciones que afectan a conejos, cabras y ovejas; en el ganado bovino ocasiona dos enfermedades de gran impacto, la septicemia hemorrágica bovina y la pasteurelosis neumónica (2).
La especie P. multocida es una bacteria Gram negativa, inmóvil, cocobacilar, anaerobia facultativa, caracterizada por producir catalasa, citocromo oxidasa e indol; utilizar glucosa, manosa y sacarosa, no crecer en agar MacConkey, no produce hemólisis ni ureasa y se ha diferenciado según el tipo de antígenos presentes en la cápsula de la bacteria o en su lipopolisacárido. Así entonces, se han identificado en la actualidad cinco serogrupos basados en la cápsula A, B, D, E y F, y 16 serotipos somáticos basados en la estructura del lipopolisacárido. Se divide en tres subespecies (subsp) según su capacidad de utilizar dulcitol y sorbitol: P. multocida subsp multocida, P. multocida subsp septica y P. multocida subsp gallicida. Las dos primeras se aíslan de mamíferos y aves, la tercera de aves (3, 4).
La necesidad de identificar a los patógenos dio lugar a un potente desarrollo de técnicas por biología molecular, las que resultan de gran utilidad y permiten superar limitaciones de los procedimientos fenotípicos tradicionales (4, 5).
La Pasteurelosis se reporta en casi todos los países del mundo, esporádica o epizoóticamente y si bien no se le concede gran importancia económica en las regiones templadas, sí causa notables estragos en los trópicos. Produce grandes pérdidas económicas en casi todo el mundo, no solo por muerte, sino también por disminución en ganancias de peso, menor eficiencia en la conversión alimenticia y costos elevados de tratamiento en animales enfermos. En Cuba se ve afectado principalmente el ganado bovino, reportándose además en cerdos, aves y conejos. Esta enfermedad presentaba una gran incidencia antes del año 1959, a partir de ese año comenzó un plan sistemático de profilaxis (6, 7). En nuestro país se han realizado investigaciones con relación a la caracterización fenotípica y molecular de cepas de P. multocida en diversas especies animales, pero ninguna, como apoyo en los programas de prevención y control de la Pasteurelosis.
La caracterización fenotípica y genética de la bacteria P. multocida es fundamental para el tratamiento y control de las enfermedades que produce (4), además estos métodos permiten evaluar a las cepas aisladas de casos clínicos, como futuros candidatos vacunales para la obtención de bacterinas.
El objetivo de este trabajo fue determinar la relación genética entre las cepas B1, B2 y B3 de P. multocida propuestas como candidatos vacunales.
]]>MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas
Las cepas de P. multocida utilizadas en la presente investigación fueron aisladas de bovinos a los que se le tomaron muestras de hígado, pulmón, corazón y piel (tejido subcutáneo).
Las muestras se incubaron a 37ºC en placas de agar sangre en el Laboratorio Provincial de Veterinaria de Granma, que pertenece a los Laboratorios Biológicos Farmacéutico (LABIOFAM).
Las cepas obtenidas fueron enviadas al cepario de la Empresa Productora de Vacunas Virales y Bacterianas, que pertenece a LABIOFAM, y se nombraron como cepa B1, B2 y B3 de P. multocida.
Todas las cepas fueron identificadas por las características macroscópicas de las colonias, las características microscópicas por el método de Gram y las pruebas bioquímicas incluidas en la galería multisustrato API 20E (Biomerieux) y otras realizadas de manera tradicional (catalasa, oxidasa, producción de indol, hemolisis, urea, motilidad, dulcitol, sorbitol, lactosa, sacarosa, glucosa, maltosa y manitol).
En este estudio se incluyeron, tres cepas de referencia como controles positivos, todas pertenecientes a la especie P. multocida subespecie multocida: 10322 NCTC tipo capsular A, 10323 NCTC tipo capsular B y 10325 NCTC tipo capsular D. Como control negativo se utilizó Escherichia coli (E. coli) ATCC 25922.
Ensayo de Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP), específico para Pasteurella multocida a las cepas B1, B2 y B3
Los cebadores empleados para realizar la RCP específica de especie P. multocida son los propuestos por Townsend y cols (8), correspondientes al fragmento KMT1, único en P. multocida y son enumerados en la Tabla 1. La RCP se realizó según el procedimiento descrito por Townsend y cols (8), con las mismas condiciones referida por estos autores.
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Condiciones de la RCP
El RCP se realizó directamente a partir de colonias aisladas del microorganismo, crecidas previamente en placas de agar sangre las que fueron incubadas a 37ºC durante 16 h. La muestra se tomó tocando ligeramente una colonia con la punta de una pipeta y luego se resuspendió directamente en la mezcla de amplificación del RCP. La mezcla de RCP que contenía un volumen total de 25 μL, 1 x tampón para RCP, 200 μM de cada desoxinucleótido trifosfato (dNTP), 2 mM de MgCl2, 3,2 pmoles de cada cebador y 0,5 μg de ADN Taq-polimerasa. Los parámetros de ciclación en el termociclador BOYN Industrial fueron: desnaturalización inicial a 95°C durante 5 min 30 ciclos de 95°C durante 1 min, de 55°C durante 1 min, de 72°C durante 1 min; con una extensión final a 72°C durante 7 min. El producto de la reacción se mantuvo a 4°C hasta que se realizó la electroforesis.
Un volumen de 5 μL de cada muestra se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 2% en 1 x tampón de desarrollo Tris-acetato (TAE) a 4 V/cm por 1 h. Luego el gel fue teñido con bromuro de etidio y se visualizaron por luz ultravioleta en un transiluminador. Se utilizó un marcador de peso molecular de 100 pb-1Kb (Biotools, Madrid, España).
Ensayo de RCP para la determinación del tipo capsular a las cepas B1, B2 y B3
Similar procedimiento se realizó para la determinación de los tipos capsulares (A, B y D) por medio de una RCP múltiple, según los descrito por Townsend y cols (9). La secuencia y el tamaño de los fragmentos con los cebadores de tipo capsular se observan en la Tabla 2. Se utilizó un marcador de peso molecular de 3000 pb (GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder 100 a 3000 pb (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA).
Técnica de Electroforesis de Campos Pulsados (ECP)
Preparación de las muestras de ácido desoxirribonucleico (ADN) inmovilizado en agarosa
Se creció cada cepa B1, B2 y B3 en caldo triptona-soya a 37°C en agitación hasta obtener la fase exponencial, se lavaron con NaCl a 0,15 M. Luego, 109 unidades formadoras de colonias (UFC) por mL de células se mezclaron con 1 mL de agarosa al 1,5%. Los bloques se formaron al añadir la mezcla en los moldes del Sistema GUEFAST06® (Neuronic SA, La Habana, Cuba), para luego realizar la ECP y se transfirieron a 1 mL de tampón NDSUPlus (0,01M Tris, 0,1M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 1% w:v Sarcosyl, 1% v:v Nonidet P-40, 4M urea, pH 9,5) por 2 h. Luego se lavaron 2 veces a 45°C con agua destilada y 3 veces con tampón TE (10 mM, Tris and 0,5 mM EDTA pH=8,0) a 45°C por 15 min cada uno. Se guardaron hasta su uso en TE a 4°C.
Digestión del ADN con enzimas de restricción
]]> Cada bloque se lavó con tampón TE-0,5 por 15 min y se equilibró con 0,2 mL del tampón de restricción según lo recomendado por el fabricante de la enzima. Luego se incubaron con 5 U de una endonucleasa de restricción (ApaI) (New England Biolabs, MA, USA) a 25°C por 2 h. Esta enzima de restricción se seleccionó al tener en cuenta el resultado de estudios previos, donde se demostró que es la más adecuada para la caracterización de P. multocida al producir bandas claras y bien separadas y ser los patrones fácilmente traducibles (10).Separación de los fragmentos de restricción en ECP y comparación de las cepas
Los fragmentos de restricción se separaron mediante ECP usando el Sistema GUEFAST, en geles de agarosa 1,5%. La corrida electroforética se realizó en la mini cámara de configuración TAFE aplicando 140v. El tampón de corrida TBE 0,5X (44,5 mM Tris, 44,5 mM ácido bórico y 1 mM EDTA, pH=8,3) se mantuvo a 20°C. Se aplicaron tiempos de pulsos entre 3 y 25 s durante 10 h. La tinción de los geles se realizó añadiendo 0,5 µg/mL de bromuro de etidio durante 30 min y se fotografiaron al iluminarlos con luz ultravioleta. Las imágenes se cargaron en el software GUEFASTScan para detectar las bandas, comparar los patrones y determinar el grado de similitud o asociación ecológica entre las especies, según el coeficiente de DICE (11), el cual expresa la probabilidad de que una banda en un patrón este también en otro, cuantificado como la relación entre el número de bandas coincidentes en dos patrones y el total de bandas. Se utilizó un marcador de peso molecular de concatámeros de fago Lambda (λ)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Ensayo de RCP específico para Pasteurella multocida a las cepas B1, B2 y B3
Como se muestra en la Figura 1, las tres cepas estudiadas y sometidas al RCP específico de especie (8) presentaron una banda de una talla de 460 pb, coincidiendo con la región del fragmento KMT1, por lo que se confirmó que las cepas B1, B2 y B3 pertenecen 100% a la especie P. multocida de forma clara.
Campuzano y cols y Hunt y cols (1, 12) recomiendan el uso de la RCP como la mejor opción en la identificación de aislamientos de P. multocida, en términos de sensibilidad y especificidad, lo cual se demostró con los resultados presentados en este estudio. Varios autores emplean diferentes técnicas moleculares como la ribotipificación y la RCP, ya que permiten detectar con claridad las variaciones genéticas entre las cepas (1, 2, 5, 12). La RCP ha sido ampliamente usada como herramienta para detectar con claridad las variaciones genéticas entre las cepas, para el diagnóstico de rutina de la Pasteurelosis en las diferentes especies en estudios de epidemiología molecular, sin tener que recurrir a las pruebas fenotípicas, las cuales pueden llevar varios días antes de obtener un resultado (1).
Ensayo de RCP para la determinación del tipo capsular a las cepas B1, B2 y B3
]]> Se observa en la Figura 2, que las cepas B1, B2 y B3 sometidas al RCP para determinar los tipos capsulares (9), presentaron una banda de una talla de 1044 pb coincidiendo con la región del fragmento amplificado para el tipo capsular A, confirmándose que las tres cepas corresponden 100% al tipo capsular A. Este resultado coincide con Christensen y cols (4), quiénes declaran que este tipo capsular A, es el más frecuente en todo tipo de hospedadores. Algunos estudios registran elevados porcentajes de identificación para el tipo capsular A, que van de 92,3 a 99%, al utilizar la RCP para la identificación molecular de los tipos capsulares de P. multocida en aislamientos de origen bovino (1).La cápsula de P. multocida está compuesta por carbohidratos. A pesar de que se desconoce con exactitud la composición de la cápsula de cada uno de los diferentes tipos, si son conocidas sus características diferenciales. La cápsula de tipo A está formada en gran parte por ácido hialurónico, responsable del aspecto mucoso de las colonias (6).
La cápsula de tipo D contiene heparina y la de tipo F contiene condroitín sulfato (12). El tipo capsular B contiene arabinosa, manosa y galactosa, entre otros monosacáridos, pero se desconoce su estructura (9).
Es bien conocido que la cápsula tiene un papel importante en la resistencia de los microorganismos a la fagocitosis (13), se conoce que las cepas con tipo capsular A, inhiben la actividad fagocítica de los neutrófilos y de los leucocitos polimorfonucleares en bovinos; probablemente sea el ácido hialurónico el responsable de ello. Además, la cápsula de P. multocida favorece la supervivencia del microorganismo en el medio ambiente y su transmisión al hospedador y confiere resistencia a la desecación (14). La adherencia en la célula hospedera varía según el tipo capsular y del tipo de células; existe controversia entre los investigadores sobre la adherencia para el tipo capsular A, puede disminuir si se elimina la cápsula (15), mientras que otros destacan que se incrementa (6).
Mediante la caracterización de los aislamientos es posible determinar las relaciones genéticas entre ellos, así como el grado de diversidad genética que presenta este microorganismo. Por otra parte, ciertos estudios parecen confirmar que determinadas cepas de P. multocida, independientemente del tipo capsular, bajo determinadas circunstancias, son capaces de diseminarse desde el pulmón a otros órganos o tejidos del hospedador. La mayoría de los investigadores señalan que P. multocida actúa como patógeno secundario (aislada en muchas ocasiones combinada con agentes víricos o bacterianos), aunque pueden existir cepas que actuarían como patógenos primarios, incluso otros autores han indicado que a partir de procesos neumónicos puedan desencadenarse procesos septicémicos (1, 4, 5).
Resultados de la Técnica de ECP
Todas las cepas analizadas en este estudio se caracterizaron mediante la ECP; técnica que permitió determinar la relación genética entre las cepas B1, B2 y B3, basada en la comparación de patrones de bandas que se generaron, luego de la digestión enzimática de todo el genoma bacteriano, al someterlo a una electroforesis multidireccional, utilizando la ApaI (Fig. 3).
]]> Mediante la ECP se observó que los patrones de bandas del ADN de la cepa B2 mostraron una banda con una posición diferente al de las cepas B1 y B3. Además, las cepas B1 y B3 tuvieron un 100% de similitud y ambas con la B2 un 91%.Según los criterios descritos por Tenover y cols (16) y Van Belkum y cols (17), las tres cepas se pueden clasificar en el mismo tipo A, puesto que tienen solo una banda diferente en sus patrones; además que las cepas B1 y B3 son indistinguibles entre ellas y se clasifican en un subtipo diferente al de la cepa B2 dentro del mismo tipo, correspondiente a la especie P. multocida.
Los aislamientos de P. multocida presentan linajes genéticos divergentes. Esta divergencia evolutiva refleja la acumulación de mutaciones no letales al azar, como sustitución de un par de bases, deleción de un gen individual o adquisición de ADN de otras especies microbianas. Con el desarrollo de técnicas moleculares fue posible detectar con precisión alteraciones genéticas mínimas (2, 16).
Los primeros trabajos sobre subtipificación de P. multocida se realizaron mediante la caracterización de uno o varios marcadores fenotípicos; sin embargo, las técnicas de subtipificación fenotípica presentan algunas limitaciones, como por ejemplo tienen baja reproducibilidad y limitado poder discriminatorio (2).
Según Hunter y Gaston (18), el poder discriminatorio que debe presentar una técnica de subtipificación molecular debe ser al menos del 90% (D=0,90). Para cumplir con el 5% de probabilidad aceptable (error tipo I). El valor ideal de D debe ser >0,95, aunque las técnicas para llegar al valor de D=0,95.
Pedersen y cols (10) plantean que esta técnica presenta una elevada sensibilidad para determinar el tipo de cepa y un elevado poder discriminatorio aplicada a la caracterización de este patógeno, y ha demostrado una buena reproducibilidad, siendo estos parámetros superiores a los obtenidos con otras técnicas de tipificación molecular, ya mencionadas anteriormente (19). Esta técnica además se utiliza para la caracterización de aislamientos de P. multocida en diferentes especies de animales y en el hombre (10, 19).
Townsend y cols (8) demostraron la utilidad de la ECP en estudios de epidemiología molecular, al diferenciar cepas indistinguibles por serotipificación, perfil proteico y ribotipificación.
Asimismo, se obtuvieron mejores resultados al subtipificar cepas de P. multocida por ECP con el uso de la ApaI que al hacerlo por ribotipificación mediante el análisis de restricción enzimática y REP-PCR (del inglés, Repetitive Extragenic Palindromic PCR); al mismo tiempo la ECP ha sido utilizada con éxito para evaluar la heterogenicidad de los agentes patógenos involucrados en brotes recurrentes, para monitorear las cepas zoonóticas con el objetivo de lograr un control de la trasmisión a los humanos y para caracterizar la susceptibilidad a agentes microbianos de los aislamientos (19). Además, se demostró que la ECP utilizando la ApaI es una técnica que presenta buena reproducibilidad en diferentes laboratorios (2, 10).
Leotta y cols (2), aplicando la metodología que se realizó en este estudio, la ECP con ApaI, pudieron caracterizar además brotes de pasteurelosis al establecer el origen de los mismos, identificar las vías de transmisión, controlar la diseminación de las cepas resistentes a antibióticos y vigilar los programas de vacunación.
Existen numerosos estudios sobre la utilidad de la caracterización de P. multocida, que suministran una valiosa información que puede ser empleada para ampliar el conocimiento sobre este agente y generar estrategias que permitan controlar las distintas enfermedades producidas por las diferentes variedades de esta bacteria.
]]> Por otro lado, siempre es importante tener en cuenta los métodos fenotípicos y moleculares utilizados para dicha caracterización, así como el número de aislamientos analizados y el del tipo de muestreo utilizado, pudiendo ser útiles para determinar la transmisión de P. multocida entre diferentes especies animales, inclusive el hombre (4).El conocimiento de las características y la identificación de cepas de P. multocida es un paso importante para la prevención y el tratamiento de la pasteurelosis en medicina humana y veterinaria, siendo necesario analizar un mayor número de cepas en el marco de estudios epidemiológicos (3).
Consideramos que los resultados obtenidos en esta investigación con las cepas de P. multocida propuestas como candidato vacunal contra la pasteurelosis bovina, en conjunto con otros resultados ya obtenidos, permitirán hacer una selección adecuada de la cepa con la cual se dará comienzo a los estudios correspondientes para la obtención de una bacterina que cumpla con las referencias internacionales, como apoyo en los programas de prevención y control de dicha enfermedad.
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Recibido: Noviembre de 2014 Aceptado: Febrero de 2015
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