Incremento en la capacidad de procesamiento para la producción de N-Glicolil GM₃

Increase in processing capacity for N-Glicolil GM₃ production

Julia M. Gutiérrez-Anillo^1,2*, José A. González-Lavaut,¹ Layda González-Villanueva,¹ Yanelis Navarrete-Pita,¹ Jesús Cancio-Méndez,¹ Nelson García-González¹

¹ Instituto Finlay de Vacunas. Ave. 27 No. 19805, La Lisa, La Habana, Cuba.

² Facultad de Ingeniería Química, Instituto Superior Politécnico José Antonio Echevarría. Boyeros, La Habana, Cuba.

email: jgutierrez@finlay.edu.cu

* Ingeniera Química, Especialista en Investigación, Innovación y Desarrollo.

RESUMEN

El N-Glicolil GM₃ es un monosialilgangliósido utilizado como antígeno y adyuvante en preparaciones vacunales para uso terapéutico contra cáncer de mama, pulmón y melanoma. La obtención de este gangliósido a partir de eritrocitos equinos consta de dos etapas: extracción y purificación, en las que se trabaja para incrementar los volúmenes de procesamiento. La evaluación del incremento en la capacidad de procesamiento, su influencia en el rendimiento y la evaluación del comportamiento del proceso de purificación utilizando Cromatografía Líquida de Alta Resolución Preparativa constituyeron objetivos del presente trabajo. Se compararon los resultados obtenidos entre el procedimiento aprobado y la propuesta de cambio. Se controló el proceso evaluando las características organolépticas y el peso del extracto liofilizado, así como la detección y contenido de N-Glicolil GM₃ por Cromatografía de Placa Delgada cualitativa y análisis colorimétrico de ácido siálico; se utilizó el Software STATGRAPHICS para evaluar la variabilidad del proceso. El incremento del volumen de procesamiento respecto al procedimiento establecido mantuvo el rendimiento en la etapa de extracción y aumentó ligeramente el de la purificación, reduciéndose el tiempo de procesamiento con la utilización de la Cromatografía Líquida de Alta Resolución Preparativa. El aumento de la capacidad de procesamiento mantuvo el rendimiento global del proceso en 0,006 g de N-Glicolil GM₃/g de Eritrocitos y el producto obtenido mediante el procedimiento propuesto cumplió las especificaciones de calidad establecidas para el mismo; permitiendo un aumento en la productividad de 30%, menor consumo de energía y desgaste de los recursos humanos, siendo factible implementar el cambio.

Palabras clave: gangliósidos, vacunas, cáncer.

ABSTRACT

The N-Glicolil GM₃ is a monosialilganglioside used as antigen and adjuvant in vaccines preparations for therapeutic use against breast, lung and melanoma cancer. The obtaining process of this ganglioside from equine erythrocytes comprises two stages: extraction and purification, in which we work to increment processing volumes. The assessment of increment in the processing capacity, its influence on the performance and the evaluation of purification process behavior by Preparative High-Performance Liquid Chromatography (Prep HPLC) constituted the objectives of this paper. The results obtained from the approved procedure and the proposal of change were compared. The process was controlled by evaluating the organoleptic characteristics and weight of lyophilized extract, as well as the detection and content of N-Glicolyl GM₃ by Qualitative Thin Layer Chromatography and colorimetric analysis of sialic acid; STATGRAPHICS software was used to assess the process variability. The increment in processing volume regarding the established procedure remained the extraction stage performance and incremented slightly the purification performance, by reducing the processing time with the use of Prep HPLC. The increment of processing capacity maintained the overall performance of the process in 0,006 g of N-Glicolyl GM₃/g of erythrocytes and the product obtained by means of the proposed method fulfilled the quality specifications established for the same; allowing an increment in productivity by 30%, less energy consumption and less exhaustion of human resources, being feasible to implement the change.

INTRODUCCIÓN

Los gangliósidos son constituyentes normales de la membrana plasmática de las células de vertebrados, involucrados en la regulación de importantes funciones celulares como el crecimiento y desarrollo embrionario, transducción de señales, receptores para virus y toxinas bacteriales, tumorogénesis y metástasis siendo uno de los sistemas antigénicos más estudiados y candidatos atractivos para la inmunoterapia del cáncer (1-7).

N-Glicolil GM₃ (NGcGM₃) es un monosialilgangliósido utilizado como antígeno y adyuvante en diversas preparaciones vacunales para uso terapéutico contra el cáncer de mama, pulmón y melanoma, las cuales producen un incremento significativo en la supervivencia y una reducción en el crecimiento tumoral, sin generar toxicidad aparente o mortalidad (2, 8-13). La importancia socioeconómica que reviste la vacuna terapéutica NGcGM₃/VSSP para el país, demanda una capacidad de producción superior de este gangliósido. La obtención de NGcGM₃ a partir de eritrocitos equinos se realiza mediante dos etapas fundamentales: extracción (sólido-líquido y líquido-líquido) y varios procesos de purificación (diálisis, liofilización, cromatografía de adsorción e intercambio iónico). Los métodos descritos por diferentes autores para la extracción y purificación de gangliósidos a partir de fuentes naturales coinciden, generalmente en cuanto a las operaciones empleadas y difieren en los disolventes, su polaridad y la proporción en que son utilizados, así como las relaciones entre la masa de material a extraer y el volumen de disolvente, la forma de adición de los mismos y el número de etapas de extracción (14-16).

La evaluación del incremento en la capacidad de procesamiento en las etapas de extracción y purificación, su influencia en el rendimiento y la evaluación del comportamiento del proceso de purificación utilizando Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) Preparativa KNAUER constituyen objetivos del presente trabajo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se evaluaron 25 lotes de producción de NGcGM₃ en los cuales se utilizaron como materia prima eritrocitos equinos suministrados por Internegocios S.A., Argentina. Se realizaron 17 lotes mediante el procedimiento que permite procesar 1,5 kg de eritrocitos y ocho lotes se desarrollaron procesando 3 kg de eritrocitos que constituye el cambio propuesto. La etapa extractiva se realizó mediante una extracción sólido-líquido de eritrocitos equinos en dos etapas, utilizando una mezcla cloroformo: metanol 1:1 (v/v) en la primera extracción y 2:1 (v/v) en la segunda extracción, durante 24 a 36 h a temperatura ambiente controlada y agitación de 300 a 500 rpm. La suspensión resultante fue filtrada al vacío y concentrada por rotoevaporación hasta sequedad. Posteriormente se realizó un proceso de eliminación de impurezas por hidrólisis básica con disolución de hidróxido de sodio/metanol 0,2 mol/L y extracción líquido-líquido con n-hexano; la fase metanólica se concentró hasta sequedad, se sometió a un proceso de diálisis durante 72 horas a 4°C. El producto se distribuyó en matraces de fondo redondo a razón de 100 mL, se congeló en nitrógeno líquido y se liofilizó en un liofilizador de mesa CHRIST ALPHA 1-4 durante 24 a 48 h, con un vacío de 0,1 a 0,2 mbar, obteniendo un polvo seco de color pardo o carmelita.

Las fracciones que contienen el gangliósido se concentraron por rotoevaporación hasta sequedad y se dializaron por 72 h a 4 °C. Se estableció el contenido de NGcGM₃ en el producto final dializado de acuerdo a la determinación de ácido siálico por colorimetría, se dosificó en matraces la cantidad requerida para garantizar 500 mg de NGcGM₃ por envase y se liofilizó durante 24 a 36 h en iguales condiciones de operación quedando el producto como un polvo de apariencia esponjosa o granulada de color blanco a crema.

Paralelamente se evaluó la introducción de un HPLC Preparativo KNAUER en el proceso de purificación por adsorción. Se realizó un proceso isocrático con un flujo de 30 mL/min, utilizando un detector UV a una longitud de onda de 242 nm y el programa ChromGate para la adquisición de datos. Se compararon los resultados para la propuesta de cambio evaluada entre los dos procesos cromatográficos (MPLC y HPLC). Se controló cualitativamente el comportamiento del proceso en la etapa extractiva, evaluando las características organolépticas y el peso del extracto liofilizado, estableciéndose el rendimiento de la etapa expresado como Masa de Extracto Liofilizado obtenido/ Masa de Eritrocitos consumidos. El desempeño del proceso durante la etapa de purificación se evaluó mediante CCD cualitativo y determinación del contenido de NGcGM₃ por el método Svennerholm (17), al concluir la purificación por adsorción y antes de liofilizar el producto final dializado para determinar los rendimientos de la etapa de purificación y el global del proceso expresados como Masa de NGcGM₃ obtenido/ Masa de Extracto Liofilizado purificado y Masa de NGcGM₃ obtenido/ Masa de Eritrocitos consumidos, respectivamente. De manera gráfica se muestra el comportamiento del proceso mediante gráficos de control para los datos obtenidos de rendimiento de la etapa de extracción, rendimiento de la etapa de purificación y rendimiento global del proceso para ambos procedimientos; utilizando el Software STATGRAPHICS Plus Versión 5.1 para la evaluación de la variabilidad del proceso. Los ensayos de identidad mediante la técnica espectroscópica de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) constituyen parámetros de calidad establecidos para este producto. El RMN se registró en un espectrómetro Bruker/Avance DPX-250. El FID (Free Induction Decay o Caída Libre de Inducción) de RMN 1H se obtuvo a una frecuencia de 250,13 MHz con 16 barridos, 32 k de adquisición de datos y un ancho espectral de 2000 Hz.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La evaluación del incremento en los volúmenes de procesamiento para satisfacer la demanda de producto requerida, partió del análisis de la posibilidad de duplicar la cantidad de eritrocitos procesada mediante el procedimiento establecido, tomando como base el equipamiento disponible. La información referente a cada uno de los lotes procesados con ambos procedimientos y los resultados de los principales parámetros del proceso se refleja en las Tablas 1 y 2.

Se considera oportuno señalar que las variaciones observadas en los resultados para lotes procesados con igual procedimiento se deben en gran medida al hecho de que el tipo y la concentración de gangliósidos presentes en la membrana plasmática dependen de variados factores tales como la especie, edad, grado de desarrollo, el tejido considerado, estados fisiológicos, alimentación, temperatura ambiente y el efecto de compuestos químicos, entre otros; tributando de esta forma a la variabilidad propia de un proceso productivo desarrollado a partir de fuentes naturales (6, 16). El peso promedio del extracto liofilizado para los lotes procesados según el procedimiento establecido fue de 11,393 g mientras para la propuesta de cambio analizada fue 23,094 g. Puede notarse que el peso del extracto liofilizado en esta última es el doble del obtenido para el procedimiento aprobado; sin embargo, se mantiene el rendimiento promedio de la etapa de extracción en 0,008 g de extracto liofilizado/ g de eritrocitos utilizados, para ambos.

Analizando el comportamiento del proceso en la etapa de purificación se observa que el contenido de NGcGM₃ en el volumen total de fracciones colectadas en la adsorción para la propuesta de cambio es 2,4 veces superior al obtenido con el procedimiento establecido, incrementándose el rendimiento de este proceso en un 15%. Al realizar igual análisis para la etapa de purificación incluyendo la adsorción, intercambio iónico y la diálisis se detecta que el peso de NGcGM₃ obtenido para la propuesta de cambio es 2,2 veces el alcanzado con el procedimiento establecido mientras el rendimiento de la etapa es ligeramente superior para el cambio evaluado (incremento aproximado de 5%).

Comparando el rendimiento global del proceso para la propuesta de cambio con el del procedimiento aprobado, puede notarse que este parámetro se mantiene para ambos procedimientos en 0,006 g de NGcGM₃/g de eritrocitos, obteniéndose con el cambio evaluado 2,2 veces la cantidad de NGcGM₃ alcanzada con el proceso aceptado. Estos resultados indican que el incremento en los volúmenes de procesamiento permite aumentar la cantidad de producto obtenido sin afectar los rendimientos del proceso.

La utilización del HPLC Preparativo en la purificación por adsorción en las condiciones establecidas, reduce el tiempo de procesamiento de 12 a 8 h, considerando que se procesara la cantidad de extracto liofilizado obtenida con el incremento del volumen de producción en el sistema establecido (columna de vidrio borosilicato, de longitud 460 mm y diámetro interno 26 mm, flujo de 10 - 15 mL/min. utilizando bomba de MPLC) para el procedimiento instituido. El nuevo sistema permite la adquisición de los datos en tiempo real, brindando evidencia confiable del comportamiento del proceso; contribuye además al ahorro de disolventes y energía, así como la disminución del tiempo de operación y manipulación logrando un proceso más eficaz, con un aumento del 30% en la productividad. Se realizaron de forma preliminar gráficos de control para los datos obtenidos de rendimiento de la etapa de extracción, rendimiento de la etapa de purificación y rendimiento global del proceso para ambos procedimientos.

Los gráficos de control para el parámetro de rendimiento de la purificación (Figura 2) muestran de igual forma que de los 17 y 8 puntos no excluidos mostrados para cada procedimiento, ninguno está fuera de los límites de control. Realizando el mismo análisis, no puede rechazarse la hipótesis de que los procesos evaluados están en estado de control estadístico para un nivel de confianza del 95%. Referente al rendimiento global del proceso los gráficos de control, tanto para el procedimiento establecido como para la propuesta de cambio evaluada (Figura 3), muestran igualmente que de los 17 y 8 puntos no excluidos respectivamente, no existe ninguno fuera de los límites de control. Considerando iguales observaciones en cuanto a la probabilidad que en los gráficos anteriores, puede considerarse que ambos procesos están en estado de control estadístico con un nivel de confianza del 95%. La data del proceso utilizada para realizar los gráficos de control no es suficiente para efectuar un análisis estadístico completo, pero permite tener una idea del comportamiento del proceso productivo establecido y de la propuesta de cambio evaluada. El análisis de los gráficos y parámetros estadísticos permite además establecer que para ambos procedimientos el proceso está en estado de control para un nivel de confianza del 95 %.

Es necesario señalar que estos resultados, a pesar de brindar una noción preliminar, no son conclusivos; es imprescindible analizar la información recopilada de mayor número de lotes. El NGcGM₃ obtenido con el incremento en la capacidad de procesamiento evaluado, muestra un espectro de RMN 1H correspondiente con el espectro de referencia. Aparecen dos multipletos en δ = 5,5 y 5,38 ppm correspondientes a los protones olefínicos de la ceramida, dos dobletos en δ = 4,23 y 4,17 ppm de los protones anoméricos de la β-D-galactosa y la β-D-glucosa, un singuleto en δ = 3,87 ppm propio de los protones metilénicos del grupo N-glicolil del ácido siálico, señales múltiples de δ = 1,6 a 1,1 ppm de los protones metilénicos de la ceramida, un tripleto en δ = 0,86 ppm de los protones metílicos de la ceramida, además de las señales correspondientes a la dimetilformamida y el dimetilsulfóxido empleados en la preparación analítica Estos resultados permiten corroborar que el NGcGM₃ obtenido mediante la propuesta evaluada cumplió los requerimientos de calidad establecidos para este producto. En la figura 4 se muestra el espectro de RMN 1H, donde se identifican las señales antes descritas. Los resultados expuestos indican que el incremento del volumen de procesamiento respecto al procedimiento establecido mantuvo el rendimiento en la etapa de extracción y en el proceso de forma global y alcanzó rendimientos ligeramente superiores en la purificación. El producto obtenido a partir de la propuesta de cambio evaluada cumplió con las especificaciones de calidad establecidas para NGcGM₃ por lo que es factible implementar el cambio.

CONCLUSIONES

El incremento de la capacidad de extracción mantuvo el índice de rendimiento de la etapa extractiva del procedimiento establecido. Mientras, el incremento de la capacidad de procesamiento en la purificación aumentó ligeramente el rendimiento en esta etapa y se mantuvo el rendimiento global del proceso en 0,006 g de N-Glicolil GM₃ /g de Eritrocitos. Paralelamente la utilización del nuevo sistema HPLC Preparativo KNAUER permite reducir el tiempo de procesamiento, brindando evidencia confiable del comportamiento del mismo; lográndose un proceso más eficaz con menor consumo de disolventes, energía y tiempo de operación y manipulación del personal.

De igual forma el análisis del comportamiento de la producción durante las etapas de extracción y purificación, así como del proceso en su conjunto permitió establecer que tanto para el procedimiento aprobado como para la propuesta de cambio evaluada el proceso está en estado de control estadístico para un nivel de confianza del 95%. El producto obtenido mediante el procedimiento a escala superior cumplió con las especificaciones de calidad establecidas para el mismo; permitiendo un aumento en la productividad de un 30%, menor consumo de energía y menor desgaste de los recursos humanos, por lo que se propone implementar el cambio de escala productiva.

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