DESCRIPCIÓN DE LA RCPc

La RCPc es un ensayo de reacciones enzimáticas cíclicas de amplificación y detección simultánea de secuencias de ácidos nucleicos para determinar su cantidad inicial. En esa cuantificación se usa la polimerasa y los marcadores directos o indirectos de fluorescencia. El aumento de la fluorescencia es proporcional a la cantidad de ácido nucleico producido durante cada ciclo de RCP, lo que permite la cuantificación exacta de las moléculas diana (Figura 2). El ciclo de RCP en el cual la fluorescencia se eleva por encima de un valor definido se denomina ciclo de cuantificación (Cc). Mientras más ADN o ARNm haya en el material de partida menor es el Cc. Existen varios pasos para un estudio de expresión génica mediante la RCPc: el diseño experimental, la recogida y el almacenamiento de muestras, la purificación del ácido nucleico y su almacenamiento, la optimización de la reacción de la reverso transcriptasa y de la ADN polimerasa, el método de detección del producto génico, el control de la calidad y el análisis e interpretación de los resultados (Figura 3). En ocasiones se tiene muy poco volumen de muestras biológicas de enfermos de gran interés clínico y científico, por lo que se requieren procesos estandarizados en la recogida de las muestras, su transportación, almacenamiento y extracción del ácido nucleico.

En el diseño experimental se intenta disminuir la variabilidad biológica y técnica cuando se comparan dos grupos de muestras, de manera de que sean lo más similares posible, excepto en el fenotipo de investigación (enfermos o sanos, tratados o no tratados, antes o después del tratamiento). En cada paso se controla esa variabilidad mediante la identificación de genes dianas y genes de referencia, en la calibración de las muestras biológicas en estudio y en la selección de los controles positivos y negativos adecuados para el estudio de ARN y en el diseño de los oligonucleótidos cebadores para ARNm [35]. Los genes dianas se pueden identificar por dos métodos. Uno es mediante hipótesis o método cerrado, en el que se estudia un grupo de genes y sus variantes transcripcionales de corte y empalme, relacionados con un proceso fisiológico o patológico determinado [36]. En este se debe conocer el proceso a estudiar desde el punto de vista empírico-teórico y bioinformático, para la selección de los genes que ayudarán a responder la pregunta formulada por el investigador. El otro método es de descubrimiento o abierto, en el que se estudian genes de todo el genoma, sin un conocimiento previo completo de los genes que se van a estudiar.

Para aplicar la técnica, se seleccionan aquellos genes de una gran parte o de todo el genoma que modifican significativamente su expresión en técnicas genómicas de alto flujo (los bioarreglos de expresión de genes y la secuenciación nucleotídica de alto flujo). Generalmente, se detectan entre 20 y 50 genes [37, 38], y con la RCPc se pueden estudiar cuantitativamente mejor esos genes y su influencia en un proceso biológico o fisiopatológico terapéutico (validación analítica).

La calibración del ensayo de expresión del ARNm se realiza a partir de genes de referencia internos y la comparación de cada muestra con calibradores experimentales. Los genes de referencia no se deben alterar por las condiciones experimentales establecidas y vincularse a diferentes procesos celulares [10, 39]. Estos genes corrigen las diferencias entre las muestras por la cantidad y calidad de ácido nucleico inicial, las variaciones en la síntesis de ADN complementario (ADNc), la presencia de inhibidores de la RCPc, y las variaciones o errores en la manipulación. Los calibradores experimentales pueden ser una línea celular no tratada, una muestra biológica antes de que el sujeto haya recibido un tratamiento (tiempo cero) o una célula o tejido normal. El calibrador corrige las diferencias entre los genes que se van a estudiar y los genes de referencia, entre cada corrida experimental y entre lotes de muestras, durante estudios de larga duración. Un diseño de estudio de muestras poblacionales pareadas o el aumento del tamaño de esas muestras que se van a estudiar, y la valoración del tipo de muestras biológicas a escoger o el mejor modo de extracción de estas, contribuyen a disminuir la variabilidad biológica y técnica como la calibración del ensayo [40].

RECOLECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LA MUESTRA

En la recolección y transporte de las muestras biológicas para los estudios de expresión de genes en la RCPc, actualmente se utilizan como soluciones estabilizantes para sangre: Paxgene™ (Preanalytix Gmbh, Feldbachstrasse, Suiza) o RNAlater® (Ambion, Inc., Texas, Estados Unidos de América), y para líneas celulares y tejidos de organismos: RNAlater®, que garantiza la estabilidad del ARN a 25 °C durante varios días, y Trireagent® (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) mediante congelación. En el proceso de recolección y conservación de las muestras sanguíneas para estudios de expresión de genes se deben evitar los cambios de temperatura, la demora en la manipulación de las muestras, y ejecutar el aislamiento celular lo más rápido posible para evitar los genes inducidos ex vivo como respuesta al estrés [41].

En la extracción de ARN mediante los estuches comerciales actuales se elimina la contaminación de ADN genómico. Durante ese procedimiento, se debe evitar la degradación del ARN por la acción de ribonucleasas, y se debe conservar a - 70 o - 80 °C en altas concentraciones, en alícuotas para usar una vez, y en viales de plásticos certificados como libres de nucleasas. En la calidad del ARN extraído de la muestra se evalúa la concentración, la pureza (con ausencia de inhibidores de la polimerasa o de la fluorescencia) [6, 42] y su integridad [43]. La concentración y la pureza se determinan mediante espectrofotometría por la densidad óptica a 260 nm y las relaciones de densidad óptica a 260/280 nm y 260/230 nm, respectivamente. La absorbancia a 280 nm indica la contaminación de proteínas y la absorbancia a 230 nm, de fenoles o urea. La integridad de esas moléculas puede determinarse por electroforesis en gel de agarosa o de capilar mediante el uso del bioanalizador, donde se da un resultado global del estado del ARN total [44].

REACCIONES ENZIMÁTICAS

En la optimización de las reacciones enzimáticas de la transcriptasa inversa y de la ADN polimerasa se debe tener en cuenta si la reacción es en uno o dos pasos, y los reactivos de cada una de ellas, así como las tres etapas en que se divide la RCPc: la desnaturalización, la hibridación y la extensión, que son muy similares a la RCP de punto final. El perfil de expresión de genes a partir del análisis de ARN codificante en esta técnica se realiza en dos pasos: 1) la reacción de conversión del ARN hacia ADNc dependiente de la transcriptasa inversa, 2) y la reacción de amplificación del ADNc por la acción de la ADN polimerasa, que permite la cuantificación de los productos. Si estos dos pasos ocurren sin interrupción en un vial, la RCPc se clasifica como de un paso. Los componentes de las reacciones de obtención del ADNc y de amplificación del gen diana son asequibles comercialmente como mezclas, y muchas veces la optimización es mínima.

En la detección del producto génico se aplican dos métodos: directo e indirecto. En el método directo, el marcador fluorescente se une a cualquier sitio de la doble cadena de ADN. Puede hacerlo de dos formas: en condiciones no saturantes del ADN (por ejemplo: el marcador Sybrgreen™) en las que se detecta la señal de fluorescencia al final de cada fase de extensión, y en condiciones saturantes del ADN (por ejemplo: los marcadores LCGreen^®, EvaGreen y el Resolight^®) en las que se detecta la fluorescencia una vez terminado el último ciclo de la RCP. En el método directo, el marcador fluorescente es covalentemente conjugado a una sonda nucleotídica que se une a una secuencia génica determinada. En este método se emplean las sondas de hibridación (Hybprobe™) y las de hidrólisis (Taqman^®), que se añaden en la misma mezcla de los oligonucleótidos cebadores. En las sondas de hibridación se emplea dos sondas nucleotídicas: una conjugada al fluoróforo aceptor-emisor y la otra, al fluoróforo donador. Cuando se unen al ADN desnaturalizado, la sonda aceptora emite la energía transferida por la sonda donadora. En las sondas de hidrólisis se emplea una sonda nucleotídica marcada con dos fluoróforos (uno es apagador y otro emisor) y la detección de la máxima fluorescencia se logra cuando dicha sonda es hidrolizada por la actividad exonucleásica de la ADN polimerasa y el fluoróforo emisor desprende la luz al ser separado del fluoróforo apagador.

La RCPc puede detectar un gen (variante simple) o dos o más genes (variante múltiple) en un solo vial [35]. En la variante múltiple de RCPc, los genes de referencias y los genes en estudio son coamplificados en la misma reacción, por lo que disminuye la variabilidad de pozo a pozo y garantiza una precisa cuantificación relativa de genes, la automatización y la generación de gran cantidad de datos, la disminución de los costos y la preservación de muestras de interés médico-científico. En esta metodología, además de una adecuada combinación de fluoróforos donadores y apagadores, el equipo de RCPc debe ser capaz de hacer la lectura a las longitudes de onda de emisión de esos fluoróforos.

ANÁLISIS DE DATOS Y CONTROL DE LA CALIDAD DE LA RCPc

En el análisis de datos y control de la calidad del ensayo de la RCPc se evalúan cuatro parámetros: la especificidad, la sensibilidad, la reproducibilidad y la eficiencia.

La especificidad depende del diseño de los oligonucleótidos cebadores y de las condiciones de reacción. Se debe evitar la formación de dímeros de cebadores oligonucleotídicos. Este elemento se verifica mediante el análisis de la curva de fusión o disociación, la electroforesis de gel de agarosa y los controles negativos y positivos. La temperatura de fusión es la temperatura en la cual la mitad de los productos de dos cadenas enrolladas de ADN se desnaturaliza a una simple cadena.

En el método de fusión se va aumentando la temperatura para disminuir la fluorescencia, las dos hebras de ADN se van separando y el fluoróforo se va liberando, y una vez que se despegan las dos hebras, la fluorescencia cae bruscamente. Ese estudio se realiza con un marcador fluorescente de unión a las moléculas de ADN, para diferenciar la señal de los productos específicos expresados de aquella de los dímeros de oligonucleótidos cebadores, pues estos tienen una temperatura de fusión menor que los productos del gen de interés.

Sensibilidad

La sensibilidad o el límite de detección es la mínima cantidad de ácido nucleico inicial que produce una señal de fluorescencia por encima del Cc. Este valor umbral se puede determinar por el método de fijar el punto, el método máximo de la segunda derivada, o a partir de 10 veces la desviación estándar de la línea base [29].

Reproducibilidad

Eficiencia

La eficiencia da una buena estimación de la amplificación del producto de RCP en cada ciclo. Hay dos métodos para analizar la eficiencia de la cuantificación relativa de genes, uno es mediante la curva de calibración y la otra mediante estudios dinámicos de datos [47]. La eficiencia por el método de la curva de calibración se obtiene de la interpolación del logaritmo (en base 2 o 10) de las concentraciones iniciales de los patrones de ácido nucleico en el eje x, frente a los Cc en el eje y. Se considera una eficiencia aceptable cuando la pendiente de la curva de calibración oscila entre -3.8 a -3.3. El método de la doble variación del ciclo umbral es un caso particular de este método, cuando la eficiencia es aproximadamente de 100 %. Cuando no es así, aparecen tres escenarios: uno en el que la eficiencia es la misma para todos los genes en todas las muestras; otro, donde la eficiencia es igual para cada gen en todas las muestras, y el tercero, en el que la eficiencia es diferente para los genes y las muestras. En el primer y segundo escenario se realiza la corrección de la fórmula de la variación del Cc con la eficiencia calculada. En el tercer escenario se necesita una optimización de las condiciones bioquímicas de la RCPc.

Este método requiere la realización de curvas de calibración para todas las muestras y los genes (al menos tres concentraciones y dos réplicas técnicas por cada muestra), lo cual puede encarecer el estudio y hacer difícil la aplicación de la RCPc en el modo de alto flujo o de análisis de gran número de muestras y genes por ensayo, y el consiguiente aumento en la generación de datos y resultados.

En el método de estudios dinámicos de los datos, la eficiencia se estima mediante el empleo de un modelo sigmoidal matemático a partir de los parámetros cinéticos, obtenido de la mejor curva de regresión de Cc, frente al número de ciclos o mediante parámetros estimados a partir de la mejor curva de regresión de Cc frente al rendimiento de productos [47]. En este método, la RCPc puede ser aplicada más fácilmente en su modalidad de alto flujo. Después se realiza el análisis estadístico por métodos paramétricos o no, para rechazar la hipótesis nula de si existe igualdad de expresión de genes entre los dos grupos de muestras estudiadas, de acuerdo con un tamaño de muestra poblacional estimado con una buena potencia y nivel de significación estadística.

Existe una guía para disminuir la fuente de variabilidad técnica y biológica de este ensayo en constante revisión, que aporta la información mínima para la publicación de experimentos de RCPc (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments, MIQE) [48]. Orienta a los autores acerca de los detalles de las muestras, la plataforma instrumental y los protocolos que se deben recoger y cómo los datos primarios de expresión de genes deben estar disponibles. Esta guía ayuda a una mayor transparencia experimental, consistencia de los datos cuantitativos [34], y a un aumento de la integridad y la coherencia de la literatura científica para la confección de estudios de metaanálisis.

DIAGNOSTICADORES GENÓMICOS BASADOS EN LA RCPc

Un diagnosticador es un parámetro objetivamente cuantificable y evaluable que sea indicador de un proceso biológico, patogénico o de una respuesta farmacológica a una intervención terapéutica.

El desarrollo de diagnosticadores transita por varias fases: descubrimiento, verificación y desarrollo. En la fase de descubrimiento se identifican aquellos posibles diagnosticadores (denominados diagnosticadores propuestos o de tipo III) a partir de las muestras analizadas, el conocimiento científico y de los resultados, y se validan mediante una técnica independiente a como fueron descubiertos. En la fase de verificación de diagnosticadores se realiza la validación preclínica o clínica de las pruebas seleccionadas, mediante los estudios retrospectivos y prospectivos (denominados diagnosticadores válidos probables o de tipo II).

Los diagnosticadores genómicos se evalúan mediante las moléculas de ADN y ARN. Los diagnosticadores proteómicos se miden a través de las proteínas celulares. Ambos conceptos han aparecidos debido al desarrollo de las tecnologías de la automatización y la informática, generadoras de gran cantidad de datos por experimentos. Los diagnosticadores genómicos generalmente pueden detectar una enfermedad o condición específica heredable, y los diagnosticadores proteómicos, en algunos casos. Cuando eso sucede, se refiere a diagnosticadores genéticos. Los diagnosticadores genómicos no pueden determinar los cambios definitivos que están ocurriendo a nivel celular, como sí lo hacen los proteómicos [13]. Esa determinación indirecta del funcionamiento celular (subrogada) puede ser compensada por las ventajas siguientes: los diagnosticadores genómicos determinados por la RCPc pueden ser más específicos que aquellos determinados a nivel proteico en el cáncer de origen epitelial. Sus mediciones pueden ser de muy alta sensibilidad, pueden determinarse de una manera de alto flujo más barata que los diagnosticadores proteómicos, y requieren menos cantidad de tejidos o muestra inicial. Los métodos de análisis de ARN emplean reactivos de investigación disponibles y listos para uso y más fácil de generar a partir de la secuencia nucleotídica reportada de los genes que se han de cuantificar. Para ser examinados en un bioarreglo, los diagnosticadores proteómicos necesitan la generación de un panel grande de anticuerpos, y en la espectrometría de masas, requieren un panel de patrones de péptidos.

Ambos métodos, los genómicos y los proteómicos, tienen su fuente de error; existe una alta correlación en los resultados entre ellos cuando se estudian proteínas estructurales; y es baja cuando se analizan proteínas no estructurales [53]. A mayor identificación de los diagnosticadores terapéuticos o toxicológicos a nivel genético, proteico y metabólico, mayor será la capacidad de predicción de los modelos.

La complementación en la información cuantitativa obtenida por la RCPc en la expresión relativa de genes con las alteraciones del ADN (mutaciones, polimorfismos, aumento en el número de copias de genes) y cambios epigenéticos (hipermetilación del ADN o acetilación de histonas) (Figura 1), la información adicional de las cantidades y actividades de proteínas u otras macromoléculas (lípidos, glúcidos), de metabolitos (radicales libres) y otros datos clínicos de interés facilitarán el desarrollo de la biología de sistema (Figura 4) [10, 54]. Este enfoque sistémico favorecerá la elaboración de modelos que permitan una mejor predicción de la respuesta al tratamiento y la generación de medicamentos más efectivos, ajustados a las características de cada enfermo, y un mayor conocimiento de esta enfermedad [16, 55].

En la medicina molecular, las decisiones clínicas se basarán cada vez más en una alta confiabilidad de los perfiles moleculares de tumores y de diversas muestras clínicas (sangre, lágrima, saliva, líquido cefalorraquídeo, orina, heces fecales, semen, biopsias de tumores heterogéneos embebidos en parafina y fijada en formalina, etcétera), y predominará la obtención no invasiva sobre la invasiva, en varios períodos de la enfermedad, sobre todo en el diagnóstico temprano. Lo anterior repercute en el empleo de nuevas terapéuticas medicamentosas, quirúrgicas o radiológicas. Este aspecto debe ser tenido en cuenta también en el PDM, ya que puede permitir una mejor selección de los diagnosticadores genómicos (independientes o en combinación con los diagnosticadores proteómicos o metabolómicos) bien definidos, para mejorar los diseños de los estudios, y que se puedan comprobar mejor las hipótesis. La determinación de qué grupos de genes en la RCPc se debe incorporar al desarrollo de medicamentos, dependerá del grado de certeza del pronóstico obtenido, con una favorable relación costo-beneficio en el PDM en comparación con otros tipos de diagnosticadores (proteómicos o metabolómicos) y las tecnologías utilizadas. La tecnología de la RCPc ha llegado a ser introducida en los países en desarrollo para la detección de enfermedades infecciosas [56]. La extensión de la RCPc para el diagnóstico de cáncer en estos países dependerá de sus índices de morbilidad y mortalidad por esta enfermedad crónica no transmisible, y de cómo y cuánto esta tecnología se haya introducido en la medicina clínica y en el PDM globalmente.

APLICACIONES DE LA RCPc EN LAS FASES PRECLÍNICAS Y CLÍNICAS DEL PDM ANTICANCEROSOS

El desarrollo de las pruebas genómicas mediante la RCPc como técnica complementaria o independiente, se ha enfocado en las aplicaciones siguientes: 1) pruebas para el diagnóstico precoz o predisposición al cáncer, 2) pruebas para la eficacia de candidatos a fármacos, 3) pruebas de toxicidad de candidatos terapéuticos, 4) pruebas para la selección de pacientes y diseño de ensayos clínicos (Figura 4).

Pruebas de diagnóstico o predisposición al cáncer

Pruebas de eficacia

En la predicción de eficacia a medicamentos, la tecnología de la RCPc identificó 54 genes expresados diferencialmente entre líneas celulares de mama (MDA-MB-231) y sublíneas derivadas de esas células con actividad metastásica pulmonar. Ese perfil de genes no solo estaba presente en ratones sino también en seres humanos [57]. Ello sugiere la relevancia de esos genes con la metástasis. Esas sublíneas celulares podrían servir como modelo a nivel celular y a nivel de organismo de esa complicación del cáncer mamario, en caso de xenotransplante, y precisar in vitro e in vivo si la indicación de un compuesto con actividad biológica es antitumoral primario o antimetastásico.

La RCPc puede aportar señales a la valoración de la eficacia de un candidato terapéutico mediante el estudio de los genes asociados con la homeostasis del sistema inmune. La determinación del perfil de expresión de genes de citoquinas y quemoquinas en la RCPc se ha usado como un método directo para valorar el estado funcional de la respuesta inmune sistémica (linfocitos circulantes) y periférica (microambiente tumoral) de pacientes con cáncer vacunados con péptidos, proteínas completas o células tumorales [7].

La respuesta inmune sistémica de pacientes con melanoma vacunados con péptidos se evaluó funcionalmente mediante la RCPc de la expresión del ARNm del interferón gamma en células mononucleares de sangre periférica, expuestas in vitro a esos péptidos durante 2 h. Este ensayo sin manipulaciones prolongadas in vitro y con un ahorro de tiempo, presentó una elevada correlación con el método tradicional de sensibilización in vitro durante 10 días de esos linfocitos T citotóxicos específicos contra péptidos de melanoma [58].

La única desventaja de la RCPc es no tener la sensibilidad del método tradicional de sensibilización in vitro por 10 días para detectar respondedores con muy bajas cantidades de células T citotóxicas específicas precursoras, con solo 2 h de sensibilización ex vivo. Sin embargo, el método tradicional no brinda información directa de los procesos fisiológicos que ocurren in vivo. Se quisiera encontrar un parámetro biológico, ya sea el número de células T citotóxicas específicas o las concentraciones mínimas necesarias de ARNm u otras moléculas de células inmunes específicas, que pronostique cuándo una respuesta inmunológica es significativamente efectiva en los pacientes enfermos vacunados [59-61].

En el microambiente tumoral se han monitoreado las interacciones de las células tumorales con la respuesta inmune periférica mediante la cuantificación de la expresión de genes de interferón gamma, interleucina 10, factor de crecimiento transformante beta 1 y beta 2 en la RCPc, a partir de muestras de tejido en aguja fina. Los pacientes buenos respondedores presentaron una sobreexpresión de interleucina 10 (citoquina inmunosupresora) antes de la vacunación, lo cual se pudiera explicar por la acción mediadora de esta citoquina entre la respuesta inmune innata y la adaptativa [7]. En estos estudios, la RCPc no necesitó grandes cantidades de material biológico (bastó con el material extraído mediante aspiración con una aguja fina y la posibilidad de que el ácido nucleico de 10 a 100 células fuese amplificado linealmente), a diferencia de otras técnicas como la inmunohistoquímica o la citofluorescencia. Además, la RCPc permitió el seguimiento de los cambios dinámicos en la expresión de antígenos asociados a tumor, la expresión de citoquinas y marcadores específicos de células inmunes durante la inmunización o el tratamiento con una generación más fácil de nuevos reactivos. Por ejemplo, la generación de los anticuerpos policlonales o monoclonales para la inmunohistoquímica o citofluorescencia es más compleja y consume más tiempo que la síntesis de los oligonucleótidos cebadores de la RCPc.

Pruebas de toxicidad de candidatos terapéuticos

En las pruebas de toxicidad de candidatos terapéuticos se ha demostrado que las sustancias con mecanismos similares de toxicidad inducen la expresión de genes similares. Los grupos de genes específicos de toxicidad descubiertos en el bioarreglo se pudieran confirmar y evaluar sistemáticamente en la RCPc. Los nuevos diagnosticadores genómicos de toxicidad que se identifiquen deben ser más sensibles, específicos, reproducibles y con mayor valor de predicción que los actualmente aceptados. Deben dar una respuesta entre 1 a 3 días, antes de los 14 días en que se obtienen los resultados histopatológicos actuales [14]. Si esas pruebas fueran evaluadas entre múltiples especies biológicas (ratas, ratones, monos) en los ensayos de seguridad preclínica de candidatos terapéuticos, brindaran un mayor beneficio. Por ejemplo, los niveles de expresión urinarios de los genes clusterin y KIM-1 determinado en la RCPc se correlacionan con la necrosis tubular renal en el tejido de riñón de ratas y monos.

La expresión del gen KIM-1 correlaciona con los niveles de la proteína KIM-1 en orina de esos animales [24]. La medición del gen KIM-1 es también una prueba de toxicidad renal tubular proximal en seres humanos. El diseño de los cebadores oligonucleotídicos de la RCPc a partir de regiones génicas conservadas entre especies biológicas ayudaría con ese objetivo y en la validación de esos ensayos.

Pruebas para la selección de pacientes y diseño de ensayos clínicos

En la estrategia de desarrollo clínico de medicamentos anticancerosos, se debe tener un plan a priori para el estudio de los diagnosticadores, con un método simple bien probado, que permita la adecuada selección de los pacientes. De lo contrario, aumentaría el número de falsos positivos (enfermos que recibirán un tratamiento no efectivo) y negativos (enfermos que no accederán a una terapia efectiva) de ese ensayo diagnóstico; un aumento en el riesgo de fallo en el desarrollo clínico de los fármacos anticancerosos y, por último, se alteraría la relación costo-beneficio y efectividad de esos candidatos terapéuticos [18, 48].

Los factores genéticos determinados durante el PDM pueden usarse en los ensayos clínicos específicos como elementos de diseño. Se describen tres tipos de diseños de estudio para diagnosticadores genómicos durante los ensayos clínicos [12]: dos de tipo prospectivo: el tamizado y el selectivo; y uno de tipo retrospectivo: el estratificado. En el diseño tamizado, el factor genético es un criterio de exclusión de la población que no responderá a un medicamento seguro o eficaz para ella, y disminuye el riesgo de fallo en estudios más grandes y costosos. En el diseño selectivo, el factor genético es un criterio de inclusión que permite estudiar su efecto entre diferentes grupos y optimizar las dosis de los medicamentos. En el diseño estratificado, el factor genético es analizado después del ensayo clínico, para ganar elementos de cómo será la indicación de la prueba farmacogenómica en un estudio prospectivo, y en la prescripción del medicamento personalizado. Esta área de diseño de ensayos clínicos está evolucionando rápidamente: se emplean diagnosticadores genómicos y no genómicos para lograr ahorro de tiempo y recursos en el desarrollo de medicamentos anticancerosos con menos índices de fallos [62].

En la selección de pacientes para recibir determinado candidato terapéutico, no se trata de identificar un perfil de expresión de genes para cada constitución genética, sino de identificar haplotipos o combinaciones de genes específicos que hagan una predicción del aumento en la eficacia y una disminución en la toxicidad de los medicamentos en una amplia población o grupo de pacientes [4, 17, 23]. La determinación de la expresión de genes con la RCPc y la amplificación génica mediante la hibridación con fluorescencia in situ, usadas de manera independiente, mostraron una alta correlación en un estudio del gen del receptor HER2/neu en muestras de cáncer de tejido mamario [6]. El primer ensayo ha brindado una valoración funcional de ese gen y de eventos importantes desencadenados en esa vía de señalización. Revela aspectos de la biología que permiten la subclasificación de este cáncer y seleccionar los pacientes probablemente más respondedores a la terapia antiHER-2/neu (trastuzumab) [6]. Se plantea que el conocimiento del perfil genético de la vía de señalización de ese medicamento en algún otro tipo de cáncer (no mamario) pudiera ser indicativo con una alta certeza de una buena respuesta terapéutica y debe ser tenido en cuenta en los futuros ensayos clínicos [17].

CONCLUSIONES

La RCPc es una técnica que puede ser utilizada independiente o de manera complementaria con tecnologías genómicas de mayor flujo para la determinación del perfil de expresión de ARNm. Las ventajas aportadas por el uso de la RCPc en el PDM del cáncer son: la elevada sensibilidad y especificidad analítica; el rango dinámico amplio entre 4 a 10 órdenes de magnitud; la cuantificación exacta de genes expresados en forma relativa o absoluta durante las fases de hibridación o de amplificación; el potencial para ser usada en alto flujo; la necesidad de muy poca cantidad de muestra, que puede ser obtenida de manera no invasiva; la posibilidad de seguimiento de los cambios dinámicos en la expresión de genes de antígenos tumorales y de células inmunes, durante la inmunización o el tratamiento; y su realización con reactivos más fáciles de generar.

La variación biológica y técnica de este ensayo son las desventajas señaladas debido a no seguir ciertas normas y cuidados en su ejecución y en la publicación de los resultados. En una enfermedad compleja y multifactorial como el cáncer, la RCPc se ha comparado con los procedimientos establecidos en el PDM y en la práctica clínica, con una adecuada relación costo-beneficio que pueda influir en su aplicación en las etapas más tempranas de sus fases preclínica y clínica. Con esto se busca favorecer la decisión estratégica y científica de la aprobación o el rechazo de los candidatos terapéuticos o la entrada de otro nuevo para mejorar la eficiencia de ese proceso y, sobre todo, está ayudando a incrementar el conocimiento de esta enfermedad. Al final, la información brindada por la RCPc de expresión de genes, de conjunto con la obtenida de la expresión de microARN, la detección de otras alteraciones genéticas, epigenéticas, proteómicas, glicómicas y metabolómicas de esta enfermedad, buscan una incorporación más rápida y efectiva de los candidatos en estudio al arsenal terapéutico, que salven y aumenten la calidad de vida de los pacientes.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo forma parte de los proyectos de investigación financiados por el CIGB. El autor agradece por la revisión del manuscrito y las sugerencias al Dr. Carlos Duarte Cano, del CIGB.

REFERENCIAS