Evaluación del potencial genotóxico de un extracto fluido de incienso (artemisia Absinthium L.)

RESUMEN

Descriptores DeCS: ARTEMISIA; TESTS DE MUTANENICIDAD; SALMONELLA TYPHIMURIUM; MEDULA OSEA; RATONES.

SUMMARY

Subject headings: ARTEMISIA; MUTAGENICITY TESTS; SALMONELLA TYPHIMURIUM; BONE MARROW; MICE.

Artemisia absinthium L de familia Asteraceae, conocida en Cuba como incienso, es una planta originaria del sur de Europa, que actualmente se cultiva en países tropicales y subtropicales de todo el mundo. Desde el punto de vista filogenético la taxonomía del género Artemisia ha sido estudiada por muchos autores y concuerdan en que A. absinthium es una de las especies más primitivas.¹ Se plantea que la sustancia activa es el aceite esencial (oleum absinthii) que encierra tujona, absintina, ácidos orgánicos y taninos. También presenta un alto por ciento de cis-epoxy-ocimene y transchrysanthenye acetate pudiendo encontrarse químicamente mezclados.¹ Las hojas y los tallos se utilizan popularmente como antiparasitarios (antigiardiásicos, tenuífugos, etc.).²

Como parte de las investigaciones farmacológicas y toxicológicas auspiciadas por el Programa Nacional de Plantas Medicinales, encaminado a fundamentar científicamente los usos tradicionales atribuidos a la flora cubana, se realizó un estudio para evaluar el potencial mutagénico de un extracto fluido de esta planta, preparado con un menstruo de alcohol al 70 %.

Para ello se usaron 2 ensayos: la prueba de Ames, que detecta mutaciones génicas y el test de micronúcleos, un ensayo ampliamente validado internacionalmente que evalúa daño genético causado por agentes clastogénicos y aneugénicos in vivo.

MÉTODOS

La planta se cultivó en la Estación Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Tomás Roig". Se colectó en junio de 1998. Un ejemplar de la misma se conserva en el herbario de la institución con número ROIG (4640). El extracto fluido se preparó con el follaje de la planta, empleando alcohol al 70 % como menstruo.³ La fecha de elaboración fue 15 de julio de 1997. Las especificaciones del extracto recibido fueron las siguientes: Lote 1; 104 mg/mL de sólidos totales 62,72 % de etanol.

Ensayo de Ames

Se empleó una batería de 4 cepas de Samonella typhimurium, recomendadas internacionalmente para esta prueba: TA 1535, TA 1537, TA 98 y TA 100, enviadas por el Dr. Bruce N. Ames (Universidad de California en Berkeley, US). Se empleó el método de sólidos totales/placa. El ensayo se realizó según protocolos bien estandarizados.⁴ Se probaron 5 concentraciones, sembrándose 3 placas por cada concentración en un experimento único. La prueba se realizó en presencia y ausencia de activación metabólica externa, provista por fracción S9 (4 %, concentración final) obtenida a partir de hígado de ratas tratadas con fenobarbital y 5,6 benzoflavona. Las placas se incubaron a 37_°C y se contaron las colonias revertantes a las 48 h. Los resultados se analizaron utilizando el programa SALANAL versión 1.0 de la EPA (Environmental Protection Agency, USA). ]]> Test de micronúcleos

El extracto fluido se evaporó a presión reducida para eliminar el etanol y el sólido resultante se resuspendió en etanol al 60 % a una concentración de 200 mg/mL. Se establecieron 8 grupos experimentales: control negativo (etanol al 60 %), control positivo (ciclofosfamida, 20 mg/kg en dosis única, 24 h antes del sacrificio) y 5 dosis de 250, 500, 1 000, 1 500 y 2 000 mg/kg.

Cada grupo contó con 10 animales, 5 de cada sexo. Se emplearon ratones suizos de la colonia del Laboratorio de Control Biológico del CIDEM, con 5 semanas de nacidos y un peso de 25 a 30 g. Estos se aclimataron durante 7 d en el bioterio de la Facultad de Medicina "Dr. Salvador Allende" y durante toda la experiencia recibieron pienso peletizado (Ratonina, CENPALAB) y agua ad libitum. El extracto se aplicó por vía oral a razón de 10 mL/kg, en 2 dosis separadas 24 h y se procedió al sacrificio 24 h después de la última aplicación. Para el sacrificio de los animales tratados con extracto se escogieron 3 grupos de acuerdo a la mortalidad observada en los mismos al cabo de 48 h de iniciada la experiencia (2 tratamientos). Como no hubo muertes en ninguna dosis, se seleccionó 2000 mg/kg como dosis tope y las de 1000 y 500 mg/kg como las restantes, que representan el 50 y el 25 % respectivamente de la dosis tope.⁵

Los animales se sacrificaron por dislocación cervical. Las muestras de médula ósea se obtuvieron según lo establecido.⁶ Estas se fijaron con etanol al 95 % (v/v) durante 5 min y secaron al aire durante 24 h. Finalmente se tiñeron con Giemsa al 5 % (v/v) en buffer fosfato pH 6.8 durante 20 min aproximadamente.

Se contaron al menos 2000 eritrocitos policromáticos (PCE) por animal y además, los eritrocitos normocromáticos (NCE) presentes por 250 PCE para estimar la relación PCE/ /NCE, indicador de citotoxicidad medular.

Para el procesamiento estadístico de los datos, se normalizaron los valores de PCE/NCE y el % MNPCE (PCE micronucleados) para cada animal y se empleó la transformación Ö (x +1). Después se procedió a realizar un análisis de varianza de 2 vías considerando sexo y tratamientos. Las comparaciones individuales se realizaron utilizando el test de Duncan.

Como criterios de genotoxicidad se asumieron: la existencia de incrementos significativos en la frecuencia de PCE micronucleados así como el que estos aumentos sean directamente relacionados con las dosis administradas (relación dosis-respuesta).

RESULTADOS

TABLA 2. Ensayo de Ames en la cepa TA 1537 de Salmonella typhimurium para el extracto fluido de Artemisia absinthium L.

TABLA 3. Ensayo de Ames en la cepa TA 98 de Salmonella typhimurium para el extracto fluido de Artemisia absinthium L.

En el ensayo in vivo (test de micronúcleos), las tablas 5 y 6 muestran que no se observaron diferencias entre control y dosis para la relación PCE/NCE ni el valor de MNPCE/1000 PCE.

DISCUSIÓN

Entre los componentes químicos del follaje de esta planta, se encuentran algunos pertenecientes a familias químicas que han sido reportadas como genotóxicas. Tal es el caso de la artemisina, lactona sesquiterpénica presente en el aceite esencial.⁸ Sin embargo, la respuesta negativa observada en los ensayos indica que, o bien estos compuestos se encuentran en proporciones a las cuales estos efectos no son detectables (el aceite esencial está presente en apenas un 0,7 %) o efectos de antagonismo por parte de otros componentes, pueden atenuar significativamente esta respuesta en el extracto fluido. Estudiar el potencial genotóxico tanto del aceite esencial como la fracción cruda de lactonas sesquiterpénicas en esta especie contribuiría a esclarecer la ausencia de mutagenicidad encontrada para el extracto fluido analizado en este trabajo.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Mucciarelli M, Caramillelo R, Maffei M, Chialva F. Essential oils from some Artemisia species growing spontaneously in North-West Italy. Flavour Fragance J 1995:10:25-32.
2. Roig JT. Plantas medicinales, aromáticas o venenosas de Cuba. La Habana. Editorial: Científico-Técnica, 1988:128-9.
3. Soler B, Méndez G, García M, Miranda M. Normas Ramales. Medicamentos de Origen Vegetal. Tinturas y Extractos Fluidos. Ciudad de La Habana: Ministerio de Salud Pública, 1992.
4. Maron DM, Ames BN. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutat Res 1983;113:173-215.
5. Heddle JA, Cimino MC, Hayashi M, Romagna F, Shelby MD, Tucker JD, et al. Micronuclei as an Index of cytogenetic damage: past, present and future. Environ Mol Mutagen 1991;18:277-91.
6. Schmid W. The micronucleus test for cytogenetic analysis. En: Hollaender A. Chemical mutagens. Principles and methods for their detection. New York: Plenum, 1976:31-53.
7. Gatehouse D, Haworth S, Cebula T, Gocke E, Kier L, Matsushima T, et al. Recommendations for the performance of bacterial mutation assays. Mutat Res 1994;312:217-33.
8. Spegazzini ED. Ethnopharmacobotany of wornwood of popular medicine in Argentina. Acta Farm Bonaerense 1984;3:2-5.