Estudio genotóxico in vitro e in vivo del extracto fluido de cassia grandis L. Y el gel de aloe vera L.

Lic. Ángel Vizoso Parra,¹ Lic. Alberto Ramos Ruiz,² Lic. Arilia García López,³ Lic. Janet Piloto Ferrer,⁴ y Lic. Vania Pavón González⁵

RESUMEN

Con el objetivo de conocer la posible actividad mutagénica del extracto fluido de Cassia grandis L. y el gel de Aloe vera L., que puedan representar algún efecto adverso para su uso en la fitoterapia, se llevó a cabo un estudio toxicogenético empleando 2 sistemas de ensayo a corto plazo uno in vitro y otro in vivo; el modelo Aspergillus nidulans D-30 que detecta daño primario al ADN y el ensayo de inducción de micronúcleos en médula ósea de ratón el cual determina daño clastogénico y aneugénico. En el ensayo in vitro con el hongo Aspergillus nidulans D-30 (segregación mitótica) se evaluaron concentraciones del extracto fluido de Cassia grandis L., desde 0,067 a 1,675 mg de sólidos totales/mL y para el gel de Aloe vera L., concentraciones de 0,09 a 1,00 mg de sólidos totales/mL. En la prueba in vivo de inducción de micronúcleos se ensayaron para la Cassia grandis L. y para el gel de Aloe vera L., dosis de 500, 1 000 y 2 000 mg/kg de peso corporal (pc). En ambas baterías de ensayos genotóxicos ninguno de los 2 fitofármacos mostraron ni daño celular ni actividad genotóxica.

Descriptores DeCs: PLANTAS MEDICINALES; EXTRACTOS VEGETALES/genética; EXTRACTOS VEGETALES/toxicidad; IN VITRO; ASPERGILLUS NIDULANS; RATONES; MEDICINA HERBARIA; ALOE/genética; ALOE/toxicidad; TEST DE MUTAGENICIDAD; TESTS DE MICRONUCLEUS.

SUMMARY

In order to know the possible mutagenic activity of the fluid extract of Cassia grandis L. and of Aloe vera L. gel that may cause some adverse effect on beign used in phytotherapy, a toxicogenetic study was conducted by using 2 systems of short-term tests, one in vivo and the another in vitro: the Aspergillus nidulans D-30 model that detects primary DNA damage and the micronucleus induction test in mouse bone marrow, which determines clastogenic and aneugenic damage. Concentrations of fluid extract of Cassia grandis L from 0.067 to 1,675 mg of total solids/mL and concentrations of Aloe vera L. gel from 0,09 to 1,00 mg of total solids/mL were evaluated in the in vitro test with Aspergillus nidulans D-30 fungus (mitotic segregation). Doses of 500, l000 and 2 000 mg/kg of body weight were assayed for Cassia grandis L. and for Aloe vera L. gel in the in vivo micronucleus induction assay. None of the 2 phytodrugs produced either cellular damage or genotoxic activity in the genotoxic assays.

Subject headings: PLANTS, MEDICINAL; PLANT EXTRACTS/genetic; PLANT EXRACTS/toxicity; IN VITRO; ASPERGILLUS NIDULANS; MICE; MEDICINE; HERBAL; ALOE/genetic; ALOE/toxicity; MUTAGENICITY TESTS; MICRONUCLEUS TESTS.

Cuba posee una flora rica en plantas medicinales, estos fitofármacos experimentan cada día un incremento en la preferencia del consumo nacional, como también en los países en vía de desarrollo y desarrollados. En muchos países esta tendencia ha adquirido un auge significativo en los últimos años como valiosa alternativa para ser combinada o no con la terapia convencional. Por esta razón los estudios genotóxicos de los fitofármacos son esenciales para que puedan ser registrados y reconocidos como productos farmacéuticos y puedan ser consumidos por el humano. Muchos de los compuestos presentes en las plantas pueden presentar propiedades mutagénicas relacionadas con procesos de diferenciación celular, teratogénicos y alteraciones genéticas en la descendencia. En las regulaciones farmacéuticas se establecen los estudios genotóxicos de todos los medicamentos de origen vegetal. De tal forma se procedió a evaluar posible potencial genotóxico del extracto fluido de Cassia grandis L. y el gel de Aloe vera L.

La especie Cassia grandis L. es una planta medicinal perteneciente a la familia de las CesalpinAceas. En Cuba existen 6 especies arbóreas pertenecientes a dicha familia y se conoce con el nombre de cañandonga, caña fístula cimarrona.^1,2 A esta planta se le atribuyen propiedades en medicina popular y tradicional como antianémica, antiasmática, mineralizante y sedante. Por vía tópica se prepara un ungüento a partir de las hojas y se utiliza para ataques de histeria, mientras que la pulpa se emplea para la anemia.^3,4 Farmacológicamente se le ha demostrado actividad antibacteriana y antimicótica, es inactiva contra la Candida albicans.⁵ Esta planta contiene aloe-emodina (antraquinona), polisacaridos, alcaloides, esteroides, triterpenos, aceites esenciales, saponinas, aminas, magnesio, cobalto, hierro y níquel.

El Aloe vera L., es una planta ampliamente estudiada en relación a su uso terapéutico en humanos, pertenece a la familia Liliaceae, de la cual existen 180 especies, muchas procedentes del este y sur de África e introducida en Asia, Europa y América.^6,7 Los productos elaborados a partir de esta planta, han sido bien estudiados desde el punto de vista farmacológico y se le ha comprobado propiedades como, antiviral, hipogliceminante,⁸ inmunomoduladora,^9-11 antiinflamatoria,¹² cicatrizante,¹³ etcétera. Comercialmente las hojas frescas del Aloe vera L. se emplean en la obtención del gel en la industria farmacéutica, de cosméticos y de alimentos. Los componentes principales del gel de Aloe son: lecitina, polisacáridos del tipo glucomanano y pequeñas concentraciones de aminoácidos, minerales y ácidos orgánicos.^14,15

Los ensayos genotóxicos se comenzaron con el hongo diploide Aspergillus nidulans D-30, ensayo in vitro que detecta daño primario al ADN.¹⁶ Posteriormente se evaluó el extracto fluido de Cassia grandis L. y el gel de Aloe vera L. mediante el ensayo de inducción de micronúcleos en médula ósea de ratón, el cual detecta la presencia de abe-rraciones cromosómicas en eritoblatos en contacto con compuestos que inducen aneuploidía y clastogénesis.¹⁷

El objetivo del presente trabajo es determinar el posible efecto citotóxico y mutagénicos del extracto fluido de Cassia grandis L. y el gel de Aloe vera L. con propiedades medi-cinales reconocidas, evaluándose las mismas en 2 sistemas de ensayos a corto plazo: inducción de segregación mitótica en el hongo Aspergillus nidulans D-30 y el ensayo de inducción de micronúcleos.

MÉTODOS

Material vegetal

La Cassia grandis L. se recolectó en la zona de Bayamo entre los meses de enero y marzo de 1993 y su fruto fue secado y molido. A partir de ese material se preparó un extracto fluido por los métodos de percolación en solución hidroalcohólica. El Aloe vera L. se recolectó en la Estación Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Tomás Roig", Güira de Melena. Con sus hojas se preparó un gel líquido empleando un proceso tecnológico desarrollado en el Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Las características físico-químicas del extracto fluido de la Cassia grandis L. son las siguientes: contenido etanólico, 62,7 %; sólidos totales; 6,7 %; presencia de azúcares reductores, saponinas, fenoles, taninos, aminoácidos, flavonoides y carbohidratos, para el gel de Aloe vera L.: contenido de sólidos totales, 0,52 - 0,60 %; polisacáridos totales, 0,2 -0,4 %; antracén derivados totales, 0,52 - 0,75 %; pH, 4,13 - 4,27; densidad, 1,00; índice de refracción, 1,33.^18-21

Ensayo de segregación mitótica

Como modelo biológico se empleó el diploide heterocigótico Aspergillus nidulans D-30,²² cepa sinte-tizada a través del ciclo parasexual. Se emplearon los haploides FGSC A593(a) y FGSC A594(b), provenientes del Fungal Genetics Stocks Center, Atlanta, USA. Esta cepa heterocigótica, presenta 4 marcadores recesivos para el color de los conidios. Las mutaciones presentes en la cepa son las siguientes: y A2(Ia) = amarillo; WA2(IIb) = blanco; WA2 (Villa) = amarillo carmelita; chaA1(VIIIb) = chartré. ]]> Esto permite observar a simple vista la ocurrencia de segregación mitótica por la frecuencia de sectores, bandas o puntos coloreados en estado de homocigosis sobre un fondo de color verde-amarillo de conidiniación salvaje. Estas mutaciones pueden ocurrir debido a eventos tales como recombinación mitótica, no disyunción cromosómica y haploidización inducidos por agentes que atacan el aparato mitótico. El medio de cultivo empleado fue el medio completo (MC).²²

Los ensayos de citotoxicidad y genotoxicidad se ejecutaron por el método de incorporación en placa.²³ El extracto fluido de Cassia grandis L. y el gel de Aloe vera L. se añadieron el (MC) licuado a 45^oC. Se prepararon placas para cada concentración y 4 placas se inocularon en punto al centro con conidios del hongo para determinar la toxicidad cuantitativa transcurrida 72 h de incubación a 37 ^oC. Posteriormente se midieron los diámetros de las colonias para calcular el Índice de Toxicidad (IT), expresado como el porcentaje de reducción del diámetro de las colonias en relación al control negativo (solvente).

La genotoxicidad se evaluó incubando a 30 ^oC durante un período de 6-10 d las placas restantes sembradas con conidios de la cepa D-30 y entonces se llevó a cabo la observación y conteo de los sectores segregantes coloreados aparecidos en las colonias. Los eventos genotóxicos que conducen a la segregación somática están determinados por la frecuencia de sectores por colonias (FSC) y el índice de segregación mitótica inducida (ISMI).²⁴

Ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón

Se emplearon ratones albinos de la línea no isogénica Suizo procedentes del Laboratorio de Control Biológico del CIDEM, con un peso promedio de 25,00 ± 3,69 y de 22,03 ± 1,35 para la Cassia grandis L. y el gel de Aloe vera L., respectivamente.

Antes del experimento, los animales se sometieron y un período de adaptación de una semana en condiciones de humedad y temperatura convencionales. La alimentación consistió en ratonina peletizada y agua sin restricción.

Para ambos fitofármacos, se preparó un protocolo de trabajo de 5 grupos de 10 animales, de ambos sexos, un control negativo carboximetil celulosa, CMC, al 0,5 %, en donde se suspendió el polvo del fruto molido, de la Cassia grandis L. y agua destilada para el gel de Aloe vera L. un control positivo (ciclofosfamida, 20 mg/kg pc) y 3 dosis (500, 1 000, 2 000 mg/kg pc). La administración del extracto fluido y del gel fueron por vía oral equivalente a 10 mL/kg pc, según los criterios de Hayahi y otros.²⁵ El esquema de tratamiento consistió en 2 administraciones separadas por un intervalo de 24 h y sacrificio por dislocación cervical después de la última administración.^26,27 Las láminas se fijaron con etanol durante 5 min y se tiñeron con Giemsa al 5 % en agua corriente. Se contaron 2 000 eritrocitos policromáticos (PCE) por animal y además los eritrocitos normocromáticos (NCE) observados por cada 250 PCE para determinar la citotoxicidad dada por la relación PCE/NCE (IT). La incidencia de micronúcleos (MN) se observaron en 2 000 PCE.

Para el análisis estadístico los valores de la relación PCE/NCE y el por ciento de PCE micronucleados (% mPCE) se normalizaron mediante la transformación Ö (x + 1). Los valores se procesaron aplicando un análisis de varianza de 2 vías. Se tuvo en cuenta el sexo y las dosis empleadas mediante un paquete estadístico Microstat. La existencia de una posible relación dosis-respuesta se verificó empleando la prueba de Cochran-Armitage.²⁸

RESULTADOS

Segregación mitótica en Aspergillus nidulans D-30

En la tabla 1 se muestran los resultados de 3 experimentos del extracto fluido de Cassia grandis L. y del gel de Aloe vera L. Para la Cassia grandis L. se aprecia una ligera citotoxicidad hasta concentraciones de 1,005 mg/mL de sólidos totales, perdiéndose ésta a concentraciones de 1,340 a 1,675 mg/mL de sólidos totales, como lo demuestra el signo negativo del índice de citotoxicidad (% IT), respecto al control negativo (solvente). Para el gel de Aloe vera L., no se aprecia ningún signo de citotoxicidad en ninguna de las concentraciones ensayadas, observándose un incremento en el crecimiento de las colonias del hongo Aspergillus nidulans hasta concentraciones de 1,00 mg/mL de sólidos totales dado por un aumento negativo del % IT.

]]> TABLA 1. Resultados de la segregación mitótica en el hongo Aspergillus nidulans D-30 frente al extracto fluido de Cassia grandis L. (ferroscasia) y el gel de Aloe vera L.

Concentración mg/mL	Toxicidada			Genotoxicidad
Concentración mg/mL	Colonias	(IT %)	Colonias	Segregantes	FSC	ISMI^b
Cassia grandis L.
Etanol 1,6 %^c	24	-	44	66	1,50	-
0,067	24	- 3,80	42	68	1,62	0,08
0,335	24	3,30	44	56	1,27	0,85
0,536	24	4,00	45	67	1,35	0,90
0,670	24	3,30	45	61	1,35	0,90
1,005	24	1,00	45	62	1,42	0,95
1,340	24	- 1,50	43	61	1,42	0,95
1,675	24	- 2,00	43	69	1,60	1,07
Metilmetano sulfonato
2,40 mM^d	24	56,60^**	44	187	4,25	2,83^**
Aloe vera L. Agua destilada
estéril^c	12	]]> -	34	59	1,73	-
0,9	12	- 2,27	33	47	1,42	]]> 0,82
0,18	12	- 2,27	33	48	1,45	0,84
0,36	12	- 6,82	33	]]> 50	1,51	0,87
0,54	12	- 2,27	34	68	2,00	1,56
0,72	12	]]> - 6,82	34	46	1,35	0,78
1,00	12	- 6,82	35	61	1,74	]]> 1,00
Metilmetano sulfonato2,40 mM^d	12	34,09^**	35	285	8,14	4,70^**
Espontáneo	24	- 3,75	44	]]> 49	1,11	0,74

^a Reducción del diámetro de las colonias las 72 h de incubación respecto al control negativo. ^b Índice de segregación mitótica. ^c Control negativo. ^d Control positivo. ^** p < 0,01.

Con relación al daño genético, en ninguno de ambos fitofármacos no se observa en la tabla 1 un efecto concentración-dependiente significativo en la FSC (p = 0,99; p = 0,55), tanto para la Cassia grandis L. como para el Aloe vera L. El experimento se repitió 3 veces. ]]> Ensayo de inducción de micronúcleos

En las tablas 2 y 3 se muestran los resultados obtenidos para esta prueba in vivo. En el caso del gel de Aloe vera L., la relación PCE/NCE, indicadora de citotoxicidad medular no mostró diferencias significativas para ratones machos (p = 0,70), ni para ratones hembras (p = 0,89). El valor del % mPCE, indicador de daño genético, no presentó diferencias significativas respecto al control negativo, para ratones machos (p = 0,99), ni para ratones hembras (p = 0,73). La regresión Cochran-Armitage, tampoco resultó significativas P_(machos) = 0,58; P_(hembras) = 0,79. Para la Cassia grandis L., tampoco se detectó daño citotóxico, al no observarse significación estadística entre sexo (p = 0,49), para las dosis ensayadas (p = 0,43). No se evidenciaron diferencias significativas en cuanto a sexo (p = 0,47), y dosis ensayadas (p = 0,65) en relación al indicador de genotoxicidad (% MNPCE). La regresión de Cochran-Armitage no resultó ser significativa para ambos sexos (p = 0,32).

TABLA 2. Ensayo de micronúcleos en ratones tratados con Gel de Aloe vera L.

Dosis (mg/kg/d)	Sexo^a	PCE/NCE(media ± DS)	MNPCE/1000 PCE(media ± DS)
Agua destilada^c	M	2,33 ±0,43	0,80 ± 0,08
	F	2,24 ±0,22	1,00 ± 0,15
500	M	2,06 ± 0,51	0,70 ± 0,09
	F	2,06 ±0,43	0,70 ± 0,09
1 000	M	2,09 ±0,39	0,70 ± 0,05
	F	2,19 ±0,47	0,90b ± 0,13
2 000	M	2,27 ± 0,29	0,70 ± 0,13
	F	2,13 ±0,19	0,60 ± 0,08
CP 20^d	M	0,67 ±0,06^**	20,50 ±0,70^**
	F	0,65 ± 0,04^**	23,80 ± 1,10^**

^a M, machos; F, hembras, positivo ^b PCE micronucleados. ^c Control negativo ^d Ciclofosfamida, control. ^** p < 0,01 (t-Student). ]]> Cochran-Armitage, p = 0,58 (M) Cochran-Armitage, p = 0,80 (F) TABLA 3. Resultados del ensayo de micronúcleos en ratones tratados con una suspensión del polvo de Cassia grandis L.

PCE
Tratamientos	Animales	IT ± DS^a	Analizados	mPCE	]]> % mPCE ± DS^b
Control
CMC 0,5 %^c	10	1,67 ± 0,15	20 000	15	0,075 ± 0,06
No tratados	10	1,57 ± 0,09	20 000	16	]]> 0,080 ± 0,05
Ciclofosfamida^d20 mg/kg/d	10	1,12 ± 0,06^*	20 000	49	2,40 ± 0,26^**
Dosis mg/kg/d
Cassia grandis L.
500	10	1,64 ± 0,09	20 000	19	]]> 0,095 ± 0,068
1 000	10	1,69 ± 0,05	20 000	14	0,070 ± 0,048
2 000	10	1,69 ± 0,07	20 000	19	]]> 0,095 ± 0,049

^a PCE/NCE = Índice de citotóxicidad. ^b % de eritrocitos policromáticos micronucleados. ^c Control negativo. ^d Control positivo. ^** p < 0,05. Valor de Cochran/Armitage, p = 0,318.

DISCUSIÓN

La ausencia de citotoxicidad del gel de Aloe y el incremento del diámetro de las colonias en el hongo Aspergillus nidulans, en el ensayo in vitro de segregación mitótica, puede deberse a algunas sustancias, tales como vitaminas, aminoácidos, azúcares, esteroles, saponias, etc. que se reportan en el gel de Aloe, las cuales pueden favorecer la germinación y el desarrollo de las colonias, favoreciendo el crecimiento micelial, tener una acción citoprotectora o ser antagonista de algún inhibidor de la germinación en el hongo Aspergillus nidulans.²⁹ En el caso del extracto fluido de la Cassia grandis L., la baja citotoxicidad observada dentro del rango de concentraciones desde 0,335 a 1,00 mg/mL de sólidos totales en el MC tiende a desaparecer cuando estas se incrementan a valores desde 1,340 y 1,675 mg/mL, posiblemente porque los polisacáridos, azúcares reductores aminoácidos, taninos, etc., favorezcan el desarrollo micelial del hongo y que al igual que en el gel de Aloe vera L., los posibles componentes citoprotectores presentes en el extracto fluido estén en una concentración más alta que los compuestos que pudieran ejercer el débil efecto citoprotector, ya que el etanol no es el responsable de esa acción tóxica, pues se encuentra dentro de los niveles permisibles (hasta 2 % v/v).²⁹

La ausencia de daño genético in vitro de ambos fitofármacos, demuestran que no contienen genotoxinas que alteren el genoma celular de la cepa diploide Aspergillus nidulans D-30. Tampoco en el ensayo in vivo de inducción de micronúcleos se obtuvo una respuesta positiva tanto para el gel de Aloe vera L. como para la Cassia grandis L., como era de esperarse.

CONCLUSIONES

El extracto fluido y la suspensión de la Cassia grandis L. y el gel de Aloe vera L. no presentaron acción genotóxica ya que:

No indujo un incremento significativo concentración-dependiente en la frecuencia de sectores por colonias en el ensayo in vitro de segregación mitótica en la cepa Aspergillus nidulans D-30.
En el ensayo in vivo de incubación de micronúcleos en médula ósea de ratón no se observó un efecto dosis-dependiente significativo ni ninguna tendencia lineal de incremento en la frecuencia de micronúcleos en los eritrocitos policromáticos. Tampoco se observó daño medular al no existir diferencias significativas en la relación PCE/NCE para las dosis ensayadas.

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Ángel Vizoso Parra

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