Lic. Angel Vizoso Parra,1 Lic. Alberto Ramos Ruiz,2 Lic. Aida Villaescusa González,3 Dr. José Betancourt Badell,4 Lic. Arilia García López,5 Lic. Janet Piloto Ferrer6 y Dra. Mercedes Décalo Michelena4
Con el objetivo de conocer el posible efecto toxicogenético de los extractos fluidos de Passiflora incarnata L. (pasiflora) y Senna alata (L.) Roxo (guacamaya francesa), se llevó a cabo un estudio mutagénico empleando 2 sistemas de ensayo a corto plazo, uno in vitro y otro in vivo: el modelo Aspergillus nidulans D-30 que detecta daño primario al ADN y el ensayo de inducción de micronúcleos en médula ósea de ratón el cual determina daño clastogénico y aneugénico. En el ensayo in vitro con el hongo Aspergillus nidulans D-30 (segregación mitótica) se evaluaron concentraciones del extracto fluido de Passiflora incarnata L.; desde 0,162 a 1,296 mg de sólidos totales/mL y para la Senna alata (L.) Roxo, concentraciones de 0,504 a 2,912 mg de sólidos totales/mL. En la prueba in vivo de inducción de micronúcleos se ensayaron para la Passiflora incarnata L. y para la Senna alata (L.) Roxo dosis de 0,607; 1,215; 2, 430 y 1 313,00; 2 625,00; 5 250,00 mg/kg de peso corporal (pc), respectivamente. En ambas baterías de ensayos genotóxicos ninguno de los 2 fitofármacos mostró daño celular ni actividad mutagénica.
DeCS: PASSIFLORA INCARNATA/toxicidad; SENNA/toxicidad; PLANTAS MEDICINALES/toxicidad; EXTRACTOS VEGETALES/toxicidad; TESTS DE MUTAGENICIDAD; ASPERGILLUS NIDULANS; TESTS DE MICRONUCLEOS.
In order to know the possible toxicogenetic effect of the fluid extracts from Passiflora incarnata L. (passiflora) and Senna alata (L.) Roxo (French bladder senna), a mutagenic study was conducted by using 2 short-term test systems, one in vitro and another one in vivo: the Aspergillus nidulans D-30 model that detects primary damage to DNA and the micronucleus induction test in mouse bone marrow that determines clastogenic and aneugenic damage. In the in vitro assay with the Aspergillus nidulans D-30 fungus (mitotic segregation), the concentrations of the fluid extract from Passiflora incarnata L. from 0.162 to 1.296 mg of total solids/mL were evaluated, whereas concentrations between 0.504 and 2.912 mg of total solids/mL were assessed for Senna alata (L.). In the in vivo micronucleus induction test, doses of 0.607; 1.215; 2.430; and 1 313.00; 2 625.00; and 5 250.00 mg/kg of body weight were assayed for Passiflora incarnata L. and for Senna alata (L.) Roxo, respectively. In both batteries of genotoxic tests none of the 2 phytodrugs showed either cellular damage or mutagenic activity.
Subject headings: PASSIFLORA INCARNATA/toxicity; SENNA/toxicity; PLANTS, MEDICINAL/toxicity; PLANT EXTRACTS/toxicity; MUTAGENECITY TESTS; ASPERGILLUS NIDULANS; MICRONUCLEUS TESTS.
El desarrollo que tiende a tener Cuba en la industria fitofarmacéutica impone una política de seguridad farmacológica y toxicológica a la hora de elaborar y formular un medicamento de origen herbario. Por esta razón los estudios genotóxicos de los fitofármacos son esenciales para que puedan ser registrados y reconocidos como productos farmacéuticos para consumo humano. Sustancias presentes en las plantas pueden presentar propiedades relacionadas con procesos de diferenciación celular, carcinogénicas y mutagénicas. En las regulaciones farmacéuticas internacionales se establecen los estudios genotóxicos de todos los medicamentos que deben ser consumidos por el humano ya sean de origen sintético o natural. De tal forma se procedió a evaluar el posible potencial mutagénico de los extractos fluidos de Passiflora incarnata L. y Senna alata (L.) Roxo.
La especie Passiflora incarnata L. conocida como pasiflora o pasionaria es una planta medicinal perteneciente a la familia Passifloracea. En Cuba es localizable en colecciones especiales y su parte útil es el follaje del cual se elabora el extracto fluido. A esta planta se le ha comprobado experimentalmente acción sedante sobre el sistema nervioso. Otras propiedades populares atribuidas son su efecto contra cólicos, epilepsia, neuralgia, neurosis, etc.1 Entre los componentes de la planta se encuentra un glicósido cianógeno denominado cianocarcina, además se le han encontrado alcaloides y flavonoides (responsables del efecto sedante). Se ha reportado también la presencia de ácidos hidrociánico, cítrico, málico, pantoténico y tánico.1-4
La Senna alata (L.) Roxo, conocida como guacamaya francesa, pertenece a la familia Cacealpinacea y es cultivada en Cuba, empleándose por la población como antiherpético, diurético, anticatarral y contra afecciones cutáneas. Investigaciones preclínicas reportan actividad antimicrobiana. Entre sus componentes están presentes mucílagos, alantoína, una antraquinona, ribarina, ácido crisofánico y un aceite esencial.5-8 Los ensayos genotóxicos se comenzaron con el hongo diploide Aspergillus nidulans D-30, ensayo in vitro que detecta daño primario al ADN. Posteriormente se evaluaron los extractos fluidos de Passiflora incarnata L. y Senna alata (L.) Roxo mediante el ensayo de inducción de micronúcleos en médula ósea de ratón, el cual detecta la presencia de aberraciones cromosómicas en eritroblastos en contacto con compuestos que inducen aneuploidía y clastogénesis.
El objetivo del presente trabajo es determinar el posible efecto citotóxico y mutagénico de los extractos fluidos de Passiflora incarnata L. y Senna alata (L.) Roxo, con propiedades medicinales reconocidas, evaluándose en 2 sistemas de ensayos a corto plazo: inducción de segregación mitótica en el hongo Aspergillus nidulans D-30 y el ensayo de inducción de micronúcleos.
En el caso de la pasiflora, la muestra provenía del lote No. 4, cuyas características físico-químicas fueron: sólidos totales, 16,2 %; menstruo etanólico, 60 %; índice de refracción, 1,380; densidad relativa, 1,001; pH, 5,1; etanol, 40 % (v/v).4 Respecto a la guacamaya francesa, se empleó en los ensayos extractos del lote No. 1, con la caracterización siguiente: pH, 5,95; densidad relativa, 1,04; índice de refracción, 1,373; sólidos totales, 14,56 %; contenido etanólico, 20 % (v/v).9
Como modelo biológico se empleó el diploide heterocigótico Aspergillus nidulans D-30, cepa sintetizada a través del ciclo parasexual.10 Se emplearon los haploides FGSC A593(a) y FGSC A594(b), provenientes del Fungal Genetics Stocks Center, Atlanta, USA. Esta cepa heterocigótica presenta 4 marcadores recesivos para el color de los conidios. Las mutaciones presentes en la cepa son las siguientes: yA2(Ia)=amarillo; WA2(IIb)=blanco; WA2(VIIIa)= amarillo carmelita; chaA1(VIIIb)=chartré.
Esto permite observar a simple vista la ocurrencia de segregación mitótica por la frecuencia de sectores, bandas o puntos coloreados en estado de homocigosis sobre un fondo de color verde-amarillo de conidiación salvaje. Estas mutaciones pueden ocurrir debido a eventos tales como recombinación mitótica, no disyunción cromosómica y haploidización, inducidos por agentes que atacan el aparato mitótico. El medio de cultivo empleado fue el medio completo (MC).11
Los ensayos de citotoxicidad y genotoxicidad se ejecutaron por el método de incorporación en placa. Los extractos fluidos de Passiflora incarnata L. y Senna alata (L.). Roxo, se añadieron al (MC) licuado a 45 °C. Se prepararon placas para cada concentración y 4 placas se inocularon en punto al centro con conidios del hongo para determinar la toxicidad cuantitativa al trancurrir 72 h de incubación a 37 °C. Posteriormente se midieron los diámetros de las colonias para calcular el índice de toxicidad (IT), expresado como el porcentaje de reducción del diámetro de las colonias en relación con el control negativo (solvente).12
La genotoxicidad se evaluó incubando a 30 °C durante 6-10 d las placas restantes sembradas con conidios de la cepa D-30 y entonces se llevó a cabo la observación y conteo de los sectores segregantes coloreados aparecidos en las colonias. Los eventos genotóxicos que conducen a la segregación somática están determinados por la frecuencia de sectores por colonias (FSC) y el índice de segregación mitótica inducida (ISMI).13
Se emplearon ratones albinos de la línea no isogénica Suizo procedentes del Laboratorio de Control Biológico del CIDEM, con un peso promedio de 34,00 y de 28,5 g para la Passiflora incarnata L. y Senna alata (L.) Roxo, respectivamente.
Antes del experimento, los animales se sometieron a un período de adaptación de una semana en condiciones de humedad y temperatura convencionales. La alimentación consistió en ratonina peletizada y agua sin restricción.
Para ambos fitofármacos se preparó un protocolo de trabajo de 6 grupos de 10 animales de los dos sexos, un control negativo (etanol al 40 % y 20 % v/v para la pasiflora y guacamaya francesa, respectivamente), un control positivo (ciclofosfamida, 20 mg/kg/pc), 3 dosis (pasiflora: 0,607, 1,215 y 2,430 mg/kg pc, y para la guacamaya francesa: 1 313,00, 2 665,00 y 5 250,00 mg/kg pc) de acuerdo con la dosis letal media reportada para ambos extractos ( pasiflora: 4,331 g/kg pc y para la guacamaya francesa 8,749 g/kg pc) y un control espontáneo (animales no tratados). La administración de los extractos fue por vía oral equivalente a 1,5 % y 3,0 % de su peso corporal, respectivamente. El esquema de tratamiento consistió en 2 administraciones separadas por un intervalo de 24 h. Se sacrificaron por dislocación cervical después de la última administración. Las láminas se fijaron con etanol durante 5 min y se tiñeron con Giemsa al 5 % en agua corriente. Se contaron 2 000 eritrocitos policromáticos (PCE) por animal y además los eritrocitos normocromáticos (NCE) observados por cada 250 PCE para determinar la citotoxicidad dada por la relación PCE/NCE (IT). La incidencia de micronúcleos (MN) se observó en 2 000 PCE.14-16
Para el análisis estadístico los valores de la relación PCE/NCE y el por ciento de PCE micronucleados (% mPCE) se normalizaron mediante la transformación Ö (x+1). Los valores se procesaron aplicando un análisis de varianza de 2 vías. Se tuvo en cuenta el sexo y las dosis empleadas mediante un paquete estadístico Microstat. La existencia de una posible relación dosis-respuesta se verificó empleando la prueba de Cochran-Armitage.17
Tabla 1. Resultados de la segregación mitótica en el hongo Aspergillus nidulans D-30 frente al extracto fluido de Passiflora incarnata L. y Senna alata (L.) Roxo
| Concentración mg/mL | Colonias | Toxicidada (IT %) | Genotoxicidad | |||
| Colonias ISMIb | Sectores segregantes | FSC | ||||
| Passiflora incarnata L. | ||||||
| Etanol 0,32 %c | 8 | - | 100 | 67 | 0,67 | 1,00 |
| 0,162 | 8 | - 590 | 100 | 64 | 0,64 | 0,96 |
| 0,486 | 8 | - 5,97 | 100 | 54 | 0,54 | 0,81 |
| 0,648 | 8 | - 5,37 | 100 | 44 | 0,44 | 0,66 |
| 1,053 | 8 | - 5,20 | 100 | 60 | 0,60 | 0,90 |
| 1,296 | 8 | - 7,68 | 100 | 60 | 0,60 | 0,90 |
| Hidrato de cloral 6mMd | 8 | 73,28** | 100 | 193 | 1,93** | 2,98 |
| Senna alata (L.) Roxo | ||||||
| Etanol 0,4 % | 8 | - | 43 | 62 | 1,44 | 1,00 |
| 0,564 | 8 | -4,35 | 45 | 56 | 1,24 | 0,86 |
| 0,728 | 8 | - 9,09 | 44 | 70 | 1,59 | 1,10 |
| 1,456 | 8 | - 6,82 | 44 | 68 | 1,54 | 1,07 |
| 2,184 | 8 | - 9,09 | 41 | 65 | 1,58 | 1 , 09 |
| 2,912 | 8 | - 6,82 | 44 | 88 | 1,87 | 1,30 |
| Metilmetano sulfonato 2,40 mMd | 8 | 30,0 | 30 | 210 | 7,00** | 4,86** |
a Reducción del diámetro de las colonias a las 72 h de incubación respecto al control negativo; b Índice de segregación mitótica; c Control negativo; d Control positivo;
** p< 0,01. (Anova simple).
En todas las concentraciones ensayadas, se puede observar que los extractos estimulan el crecimiento de las colonias, por la presencia del signo negativo del índice de toxicidad (IT), el cual expresa en por ciento la reducción del diámetro de las colonias con relación al control negativo.
]]> Con relación al daño genético, en ninguno de los extractos evaluados se observa un efecto concentración-dependiente significativo en la FSC (p = 0,59; p = 0,45), ni un incremento mayor de 2 en el índice de segregación mitótica (ITM).En las tablas 2 y 3 se muestran los resultados resumidos en la prueba in vivo considerando las dosis ensayadas. Tanto para el extracto de Passiflora incarnata L. como para la Senna alata (L.) Roxo, la relación PCE/NCE, indicadora de citotoxicidad medular no mostró diferencias significativas en cuanto a sexo ni dosis, respectivamente (p = 0,24, p = 0,11 y p = 0,31; p = 0,15). El valor del % mPCE (eritrocitos policromáticos micronucleados), indicador de daño genético, tampoco presentó diferencias significativas respecto al control negativo, en cuanto al sexo y dosis para ambos fitofármacos (p= 0,41; p= 0,68 y p= 0,88; p= 0,99). No se observaron diferencias significativas entre los controles negativos y espontáneos. La regresión Cochran-Armitage, tampoco resultó significativa para la pasiflora (p(machos)= 0,48; p(hembras)= 0,72) y la guacamaya (p(machos)= 0,77; p(hembras)= 0,63).
Tabla 2. Resultados del ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón tratados con extracto fluido de Passiflora incarnata L.
| Dosis (mg/kg) | Machos | Hembras | ||
| PCE/NCE ± DSa | % MNPCE ± DSb | PCE/NCE ± DS | % MNPCE ± DS | |
| 0c | 1,48 ± 0,08 | 0,19 ± 0,12 | 1,50 ± 0,22 | 0,21 ± 0,08 |
| No tratados | 1,30 ± 0,10 | 0,23 ± 0,04 | 1,33 ± 0,19 | 0,20 ± 0,12 |
| CPd | 0,38 ± 0,11** | 1,84 ± 0,33** | 0,48 ± 0,05** | 1,97 ± 0,28** |
| 1 313,0 | 1,39 ± 0,16 | 0,19 ± 0,06 | 1,52 ± 0,44 | 0,15 ± 0,06 |
| 2 665,0 | 1,59 ± 0,17 | 0,24 ± 0,16 | 1,47 ± 0,10 | 0,20 ± 0,07 |
| 5 250,0 | 1,34 ± 0,16 | 0,20 ± 0,00 PcA= 0,447e | 1,30 ± 0,10 | 0,16 ± 0,05 ]]>
PcA= 0,720e |
a PCE/NCE = índice de citotoxicidad; b % MNPCE = por ciento de eritrocitos policromáticos; c Control negativo (etanol 40 % v/v); d Control positivo (ciclofosfamida 20 mg/kg); e Valor de p para la regresión Cochran-Armitage; **p<0,01 (Anova simple).
Tabla 3. Resultados del ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón frente al extracto fluido de Senna alata (L.) Roxo
| Dosis (mg/kg) | Machos | Hembras | ||
| PCE/NCE ± DSa | % MNPCE ± DSb | PCE/NCE ± DS | % MNPCE ± DS | |
| 0c | ]]> 2,18 ± 0,23 | 0,12 ± 0,02 | 1,89 ± 0,40 | 0,13 ± 0,08 |
| No tratados | 2,22 ± 0,14 | 0,11 ± 0,04 | 1,92 ± 0,29 | 0,11 ± 0,07 |
| CPd | 1,39 ± 0,12** | 2,81 ± 0,38** | ]]> 1,46 ± 0,02** | 2,00 ± 0,10** |
| 1 313,0 | 1,91 ± 0,72 | 0,08 ± 0,05 | 1,61 ± 0,32 | 0,08 ± 0,08 |
| 2 665,0 | 2,05 ± 0,24 | 0,09 ± 0,04 | 2,03 ± 0,43 | 0,08 ± 0,05 |
| 5 250,0 | ]]> 1,87 ± 0,26 | 0,08 ± 0,04 PcA= 0,765e | 1,85 ± 0,34 | 0,09 ± 0,04 PcA= 0,685e |
a PCE/NCE = índice de citotoxicidad; b % MNPCE= por ciento de eritrocitos policromáticos;
c Control negativo (etanol 30 % v/v); d Control positivo (ciclofosfamida 20 mg/kg);
e Valor de p para la regresión Cochran-Armitage; **p<0,01 (Anova simple).
Tal como puede observarse a partir de los resultados los extractos de pasiflora y guacamaya francesa no demuestran efectos citotóxicos frente al hongo Aspergillus nidulans D-30. En todas las concentraciones ensayadas, ambos extractos estimulan tanto la germinación como el desarrollo de las colonias del hongo. Este incremento en la viabilidad de los conidios indica la posible presencia de algunas sustancias (azúcares, peptinas, mucílagos, etc.) que favorecen el proceso germinativo actuando como factor de crecimiento o como antagonista del inhibidor de la germinación encontrado en el hongo Aspergillus nidulans.15
]]> En cuanto a la acción genotóxica in vitro, tanto el extracto fluido de pasiflora como el de guacamaya francesa no parecen inducir efecto mutagénico en este sistema. Entre los componentes químicos del follaje de ambas plantas no hay presente ninguno que haya sido reportado con efecto sobre el material genético (esteroles, flavonoides, ácido cítrico, ácido tánico, azúcares, alantoína, antraquinonas) aunque para estas últimas existen reportes en donde las consideran como genotóxicas en sistemas bacterianos y otros como antimutagénicas en sistema in vitro y ex- in vivo relacionado con la inactivación de la familia de las enzimas CYP1, responsables de la capacidad mutagénica y carcinogénica de determinados promutágenos.19,20 Se pudiera inferir que la posible existencia de algún tipo de sustancia con estructura química que tenga afinidad electrofílica con el ADN esté inhibida por un mecanismo aditivo o antagónico por aquellos compuestos presentes en los extractos con efectos contra la expresión mutagénica, característica muy común en la mayoría de las especies vegetales, de ahí el fundamento desde este punto de vista de su inocuidad para su empleo como medicina verde. De la posible presencia de alguna genotoxina en los extractos, su efecto clastogénico o aneugénico, tampoco se expresó en el sistema in vivo, como era de esperarse debido a la presencia de sistemas detoxificadores enzimáticos (fase III) presentes en el hígado, pulmones o tracto gastrointestinal, responsables de la inactivación de sustancias en algunos casos, o la baja concentración de la misma y especificidad para atacar la molécula diana.21Los extractos fluidos de Passiflora incarnata L. y Senna alata (L.) Roxo no demuestran contener sustancias genotóxicas ya que:
Recibido: 11 de enero de 2002. Aprobado: 17 de febrero de 2002.
Lic. Ángel Vizoso Parra. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM) Ave. 26 No. 1605 entre Cerro y Boyeros, Plaza, Ciudad de La Habana. Cuba, CP 10600.
1 Licenciado en Ciencias Biológicas. Investigador Auxiliar. ]]>
2 Licenciado en Bioquímica. Investigador Auxiliar.
3 Licenciada en Ciencias Biológicas. Investigadora Agregada.
4 Doctor en Ciencias Médicas.
5 Licenciada en Microbiología.
6 Licenciada en Biología.