PRODUÇÃO DE 4-NEROLIDILCATECOL EM SUSPENSÕES CELULARES
DE POTHOMORPHE UMBELLATA (L.) MIQ ( PIPERACEAE )

Dra. Vera Regina Campos Viana,1 Dr. Helio M. Alves,1 MSc. Cláudia Simões2 y Dra. Solange Faria Lua Figueiredo1

Resumo

Neste trabalho são apresentados dados referentes ao estabelecimento de suspensões celulares de Pothomorphe umbellata. As culturas foram iniciadas com calos friáveis cultivados em meio MS + 1,0 mg.L-1 2,4-D + 0,1mg.L-1 BA desenvolvidos da lâmina foliar de plantas adultas cultivadas in vivo. Os meios de cultura foram analisados quanto ao seu efeito sobre a produção de biomassa e síntese de 4-nerolidilcatecol. O meio com 20g.L-1 glicose + 1,0 mg.L-1 2,4-D + 0,1mg.L-1 BA foi o mais eficiente para a produção de biomassa enquanto a substituição da fonte de carbono por 30g.L-1 sacarose propiciou maior produção de 4-nerolidilcatecol. Visando estimular a capacidade biossintética das culturas empregou-se a técnica de elicitação, com glucana. Constatou-se que o tempo de incubação e a concentração do elícitor influenciaram positivamente o processo. Os teores máximos detectados (862,38 mg/g PS) foram alcançados após a incubação das culturas com 75 mg glucana/g PF por 24 h. Estes valores superaram aqueles produzidos pelas plantas intactas e pelas suspensões celulares não elicitadas.
Abreviaturas: 2,4-D- ácido 2,4-diclorofenoxiacético; BA- 6-benziladenina; MS- meio Murashige & Skoog; PF- peso fresco; PIC - picloram; PS- peso seco.

Palavras clave: suspensão celular, photomorphe umbellata pariparoba, planta medicinal.

Introdução

Para sobreviver em sua condição sedentária, as plantas produzem metabólitos secundários que além de atrair polinizadores as protegem da ação de fatores bióticos e abióticos. Em conseqüência da variabilidade destes metabólitos (alcalóides, fenóis, flavonóides e terpenóides, dentre outros), muitos autores reconhecem que tais substâncias expressam a individualidade química das espécies. Nas plantas superiores elas têm despertado a atenção por suas atividades biológicas ou terapêuticas úteis ao homem.

Os metabólitos secundários são essencialmente produzidos e extraídos a partir de plantas cultivadas no campo sofrendo, portanto, a influência de variações sazonais, pragas, doenças e condições metereológicas. Desse modo, a utilização de técnicas biotecnológicas apresenta-se como um importante recurso alternativo para o cultivo das espécies, atuando como fonte biológica contínua para a produção de fármacos.
]]> Técnicas variadas vêm sendo utilizadas com o intuito de otimizar as condições das culturas de células vegetais, visando superar a produção dos metabólitos secundários produzidos pelas plantas matrizes. O uso de elicitores (bióticos ou abióticos) tem sido efetivo não só para induzir ou aumentar a síntese de metabólitos específicos, como também para elucidar importantes etapas enzimáticas envolvidas na rotas biossintéticas.1 A resposta das culturas de células à elicitação é afetada pela concentração do elicitor, período de incubação após a elicitação e estado fisiológico das células.2

Pothomorphe umbellata, conhecida como "pariparoba", é tradicionalmente empregada de norte a sul do Brasil, em função de suas propriedades colagogas, coleréticas e estomáquicas. Ocorre espontaneamente, em locais úmidos e sombreados, da Amazônia até o sul do Brasil. Apesar da utilização popular da espécie como agente terapêutico, são poucas as informações relacionadas com a sua composição química e sua atividade biológica. Foram isolados das raízes e folhas da espécie o sitosterol e o 4-nerolidilcatecol.3 A análise fitoquímica dos extratos hexânico e diclorometânico de seus diferentes órgãos, resultou no isolamento da mistura dos esteróides sitosterol e estigmasterol além do peltatol A e do 4-nerolidilcatecol, estando este presente em todos os órgãos.4 Também foi constatada a presença de componentes sesquiterpênicos de peso molecular 204, inclusive nerolidol, no óleo essencial das folhas.4

A atividade antioxidante foi verificada em extrato etanólico de raiz, caule e folhas de pariparoba tendo sido comprovado que o 4-nerolidilcatecol foi o princípio ativo responsável por tal atividade5. Esta substância também apresentou resultado positivo para as atividades antiinflamatória e analgésica.4

O objetivo desse trabalho foi estabelecer metodologia para a obtenção de suspensões celulares de P.umbellata e avaliar a capacidade de produção de 4-nerolidilcatecol nestas culturas. Verificou-se também a influência de elicitor sobre a otimização da síntese do metabólito.

Material E Métodos

Iniciação e seleção das condições básicas de cultivo das suspensões celulares - As culturas de células em suspensão foram iniciadas com calos friáveis (2g) produzidos em meio MS6 + 1,0mg.L-1 2,4-D + 0,1mg.L-1 BA e 30g.L-1 sacarose a partir de explantes da lâmina foliar com 16 dias de idade, oriundos de plantas cultivadas in vivo.6,7 Os calos foram transferidos para frascos erlenmeyer (125 mL) contendo 25 mL de meio líquido com a mesma composição salínica e hormonal usada no meio sólido. Os frascos foram vedados com rolhas de silicosen T-32 (Skin-Etsu Polymer CO, Ltd) e incubados no escuro, em agitador orbital (120 rpm), a 28 ± 2 °C e 50 % de umidade relativa. Para a manutenção das culturas estoque, as subculturas foram realizadas na fase exponencial do ciclo de crescimento em frascos de 125 mL, com inóculo na razão de 1:3. Foram utilizados quatro frascos de cultura, com o acompanhamento do crescimento durante três subculturas.

Para caracterizar o crescimento da cultura foi usado o método da curva de dissimilação, para cada frasco individualmente.8 Para a quantificação do PS final e do açúcar residual do meio, as culturas foram encerradas nove dias após terem atingido a fase estacionária. As células foram separadas do meio de cultura por filtração a vácuo, seguida de lavagem com água deionizada. Após aferição do PF, a massa celular foi seca em estufa a 50 °C por 18 h, para a determinação do PS. Utilizou-se balança analítica ER-120A (precisão 0,1mg). O meio líquido foi filtrado em papel de filtro Whatman no 1 e a quantificação do açúcar residual determinada pelo método do DNS (Chaplin MF, Kennedy JF. Carbohydrate analysis: a pratical approach. IRL Press, 1986). ]]>
Efeito de diferentes reguladores de crescimento e fontes de carbono sobre a produção de biomassa e de 4-nerolidilcatecol - As suspensões celulares utilizadas nestes tratamentos foram iniciadas a partir da transferência das células cultivadas em meio MS + 1mg.L-1 2,4-D + 0,1mg.L-1 BA para frascos erlenmeyer (125 ml-25 mL de meio) com variações nas concen-trações dos reguladores de crescimento e nas fontes de carbono (Tabela 1).

TABELA 1. Combinação de reguladores de crescimento e fontes de carbono acrescidos ao meio MS para o estabelecimento de suspensões celulares de P.umbellata.

As culturas mantidas em meios com 2,4-D e picloram (PIC) foram encerradas no 30o e 32o dia de cultivo, respectivamente, sem subculturas. As condições de cultivo e a avaliação do crescimento seguiram a metodologia anteriormente mencionada. A viabilidade celular foi avaliada através do método do diacetato de fluoresceína (FDA). A massa celular usada para a determinação do PS de cada cultura, e o meio líquido foram acondicionados a -20 °C para posterior análise cromatográfica.

Em face dos resultados obtidos com as suspensões celulares mantidas no meio A11, foi estabelecido um experimento para acompanhar a cinética de crescimento da cultura considerando-se o PF, PS, PF/PS e o consumo da fonte de carbono. Foram utilizados 18 frascos (125mL - 25mL de meio) com 3g de células obtidas das culturas estoque, por filtração à vácuo. Durante um período de 36 dias foram coletados, a cada quatro dias, dois frascos de cultura para aferição das variáveis determinadas.
Visando a otimização da produção de biomassa, as células cultivadas em meio A2 foram transferidas para o meio A11, sendo as subculturas realizadas no 15o dia de cultivo.

Para otimizar a produção de 4-nerolidilcatecol, 3g de células mantidas no meio A11 foram coletadas por filtração a vácuo, no 28o dia de cultivo, e transferidas para o meio A2. As condições de cultivo foram as citadas anteriormente. As culturas foram encerradas ao final de 30 dias para avaliação do teor do metabólito.

Elicitação das suspensões celulares - O elicitor utilizado foi a glucana isolada do extrato da levedura Saccharomyces cerevisae. Para o preparo da solução estoque (1:1), a glucana foi dissolvida em meio de cultura fresco, o pH ajustado para 5,4 e a esterilização efetuada por filtração (0,22 mm).

No 18o dia de cultivo, as culturas mantidas no meio A11 foram reunidas em um só frasco, subdivididas em porções de 10 mL em erlenmeyer de 50 mL. O elicitor foi adicionado nas concentrações de 25; 50; 75 e 100 mg/g PF de células e as culturas foram incubadas no escuro a 28 ± 2 °C, em agitador orbital. A intervalos regulares de incubação (8; 24; 48; 96; 144 e 216 h) dois frascos de cada concentração do elicitor foram retirados e as células separadas do meio líquido por filtração a vácuo. Avaliou-se a viabilidade celular e aferiram-se os PF e PS.

Identificação de 4-nerolidilcatecol

Resultados

Efeito de diferentes reguladores de crescimento e fontes de carbono sobre a produção de biomassa, síntese e acúmulo de 4-nerolidilcatecol - As curvas de dissimilação das suspensões celulares de P.umbellata, cultivadas nos meios com 2,4-D e PIC, exibem um típico crescimento sigmoidal (figura 1). O início da fase estacionária das culturas, determinado pela curva de dissimilação, foi constatado pelo valor máximo de PS alcançado. As culturas nos meios com 2,4-D atingiram a fase estacionária entre o 20o e 21o dia de cultivo (A2, A3, A4) e entre o 22o e 24o dia (A1, A5). Aquelas mantidas em meios com PIC (A6, A7, A8, A9) atingiram esta fase entre o 23o e 24o dia de cultivo (figura 1B).
]]> As suspensões celulares mantidas em 2,4-D mostraram um crescimento lento, sobretudo as cultivadas nos meios A1 e A5, com fase lag mais longa. Estas culturas foram escurecendo gradativamente e ao final de 30 dias apresentavam uma coloração bege-escura, reduzida produção de biomassa e 52 % de viabilidade celular. As culturas mantidas nos meios A2 e A3, apesar da pequena densidade celular, exibiram um aspecto saudável, coloração bege-clara e elevada viabilidade celular (84 e 78 %, respectivamente). As culturas mantidas em PIC apresentaram crescimento mais lento do que aquelas cultivadas com 2,4-D. Os meios A7 e A8 produziram culturas com coloração bege e 6 3 % de viabilidade celular. Nos meios A6 e A9 as culturas apresentaram coloração bege-escura e baixa viabilidade celular (36 % e 32 %, respectivamente).

A variação na concentração de sacarose (A10) não exerceu influência sobre a perda de peso por dissimilação (Figura 1C) nem sobre a produção de biomassa celular em relação às culturas mantidas em meio com 30g.L-1 sacarose (A2). A coloração, densidade e viabilidade celular também foram semelhantes àquelas descritas para as culturas em meio A2.

Fig.1. Curvas de dissimilação obtidas a partir de suspensões celulares de P.umbellata cultivadas em meios com diferentes reguladores de crescimento e tipos de fontes de carbono. A- 2,4-D + BA + sacarose; B- PIC + BA + sacarose; C- 2,4-D + BA + sacarose ou glicose.

A substituição da sacarose por glicose (A11 e A12) foi positiva para o crescimento das culturas sendo que o meio A11, dentre todos os meios testados, proporcionou a maior produção de biomassa. Através das curvas de dissimilação constatou-se, para ambas as culturas, uma fase lag reduzida (figura 1C). O início da fase estacionária foi atingido no 20o dia de cultivo para as duas culturas. Observou-se que no meio A11 a glicose foi totalmente absorvida até o 20o dia de cultura (figura 2A), confirmando o momento em que foi alcançado o máximo valor de PS (figura 2B). O acompanhamento do aumento do PF e do PS, em intervalos regulares do ciclo de crescimento das culturas, apontou uma redução gradativa do PS a partir do início da fase estacionária (figura 2B).

Fig.2. Suspensões celulares de P.umbellata cultivadas em meio com 1,0mg.L-1 2,4-D+0,1mg.L-1 BA+20g.L-1 glicose. A- Concentração de glicose no meio de cultura e curva de dissimilação; B- Acompanhamento dos pesos fresco (PF) e seco (PS) e da relação PF/PS.

Fig.3. Efeito do 2,4-D e do PIC sobre a produção de 4-nerolidilcatecol em suspensões celulares de P.umbellata cultivadas em: A - 2,4-D + BA; B - PIC + BA.
mg/g PS - massa celular; mg/mL - meio líquido.
Letras iguais sobre as colunas de mesma cor não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5 % de probabilidade.

Dentre os meios testados com variação na concentração da fonte de carbono, aqueles suplementados com glicose apresentaram os menores teores de 4-nerolidilcatecol, sem diferença significativa entre as duas concentrações utilizadas (figura 4).

Fig.4. Efeito dos meios suplementados com sacarose ou glicose (20 ou 30 g.L-1) sobre a produção de 4-nerolidilcatecol em suspensões celulares de P.umbellata.
Letras iguais sobre as colunas não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5 % de probabilidade.

Pode-se constatar que os maiores teores de 4-nerolidilcatecol foram detectados na fase estacionária do ciclo de crescimento, caracterizando uma relação inversa entre o crescimento da cultura e o acúmulo da substância (figuras 5A e 5B).

Fig. 5. Produção de 4-nerolidilcatecol em suspensões celulares de P.umbellata durante as diferentes etapas do ciclo de crescimento. A - meio A2; B - meio A11.
Letras iguais sobre as colunas não diferem significativamente pelo teste de Tukey ao nível de 5 % de probabilidade.

Efeito do elicitor glucana sobre a produção de 4-nerolidilcatecol - Constatou-se que a produção de 4-nerolidilcatecol nas suspensões celulares submetidas ao tratamento de elici-tação foi dependente da concentração da glucana e do tempo de incubação (Tabela 2).

Discussão

A curva de dissimilação expressa uma perda de peso cumulativa para cada frasco de cultura decorrente da dissimilação dos açúcares e é calculada a partir do balanço de carbono.8 Durante a apreensão de carboidratos, uma porcentagem fixada é usada para dissimilação de açúcares (energia de consumo das células) e a outra porcentagem para a formação de bio-massa8.

Como o método selecionado não é invasivo, não se torna necessária a utilização de um grande número de frascos de culturas.
Apesar da associação do 2,4-D com uma citocinina ser amplamente usada para o crescimento das suspensões celulares10, não se constatou um bom rendimento de biomassa nas suspensões de P.umbellata, independente das concentrações testadas.
Os baixos valores de perda de peso por dissimilação, referidos para as culturas mantidas em meios com 2,4-D e PIC foram, provavelmente, decorrentes da reduzida taxa de divisão celular. Nestas condições, onde a necessidade energética é menor, haverá pequena taxa de dissimilação do açúcar e conseqüentemente menor liberação de CO2. Este tipo de resposta também foi mencionada para culturas de Morinda citrifolia.10 Cabe ressaltar que o baixo consumo de açúcar registrado por essas culturas e evidenciado através da análise do açúcar residual, está relacionado não só à pequena taxa de dissimilação como também à reduzida taxa de conversão e armazenamento deste açúcar em biomassa.8,11 Por outro lado, o aumento de biomassa celular em suspensão de P.umbellata no meio A11 foi claramente evidente, e encontra apoio nas proposições dos autores.8,11

A redução do PS a partir da fase estacionária indica, que devido ao esgotamento da glicose no meio de cultura, a dissimilação passou a ocorrer às custas dos açúcares de reserva, tendo como conseqüência um aumento na relação PF/PS, o que foi observado neste trabalho nas suspensões em meio A11, e nas culturas de Rollinia mucosa.12

Embora a sacarose seja o açúcar mais utilizado, sobretudo a 2 e 3 %, favorecendo os mais altos índices de crescimento,9,16,12 a glicose também pode ser considerada como uma efetiva fonte de carbono.13 No presente trabalho, a utilização da glicose a 2 % (meio A11) foi determinante para a produção de biomassa, provavelmente, por ser rapidamente metabolisada, o que evidencia a importância do tipo e da concentração do carboidrato fornecido. ]]>
Os resultados apresentados em relação à presença de 4-nerolidicatecol no meio líquido mostram que a substância não foi excretada naturalmente para todos os meios líquidos, resultando em acúmulo nas células. Os níveis detectados apenas nos meios A1, A5, A6 e A9 possivelmente foram decorrentes do processo de lise celular, uma vez que as respectivas suspensões apresentaram pequena taxa de viabilidade quando comparada às demais.

O 2,4-D é citado na literatura por seus efeitos inibitórios sobre a produção de metabó-litos secundários, podendo estar associado aos níveis endógenos deste regulador de cresci-mento nas células cultivadas de diferentes espécies. No entanto, para suspensões celulares de P.umbellata, quando em associação com sacarose, estimulou a atividade de enzimas relacio-nadas à biossíntese de 4-nerolidilcatecol. O maior teor obtido (547,96 mg/g PS) superou aquele registrado nas folhas com 16 dias de idade de plantas adultas cultivadas in vivo (440,34 mg/g PS).14 A ação estimuladora do 2,4-D sobre a biossíntese dos metabólitos secundários foi também constatada em culturas de células de Thalictrum minus15 e de Aralia cordata.9 Ao contrário do efeito produzido pelo 2,4-D, o PIC não foi eficiente para estimular a capacidade biossintética das culturas de P.umbellata. Nas culturas de Taxus baccata16 e de calos de órgãos oriundos de plântulas de Rollinia mucosa17 o PIC também não favoreceu a produção de metabólitos específicos, embora tenha aumentado a produção de biomassa.

A superioridade da glicose sobre a sacarose, observada no crescimento das culturas não foi mantida para a produção e o acúmulo do metabólito, uma vez que na presença deste monossacarídeo a produção de 4-nerolidilcatecol foi reduzida em cerca de quatro vezes se comparada ao cultivo com 30 g.L-1 sacarose. A redução da concentração de sacarose para 20 g.L-1 causou diminuição da produção em cerca de 1,7 vezes em relação à 30 g.L-1. Estudos comparativos entre as diferentes fontes de carbono suplementadas às culturas, revelam que os índices mais elevados de produção de metabólitos específicos também foram assinalados nas suspensões celulares de Tabernaemontana divaricata18 e Taxus baccata16 suplementadas com sacarose.

O padrão de síntese 4-nerolidilcatecol durante a fase estacionária das culturas de P. umbellata também foi mencionada para berberina em culturas de Thalictrum minus19 e de lignanas furofurânicas em culturas de Rollinia mucosa.20

Em conseqüência da cinética do crescimento e da produção observada nas suspensões celulares de P.umbellata não foi possível estabelecer um único meio de cultura que proporcionasse um bom rendimento de biomassa e altos teores de 4-nerolidilcatecol. Provavelmente tanto no meio A2 como no meio A11 ocorreu o acúmulo dos precursores da rota biossintética, porém, o estímulo da conversão bioquímica foi maior no meio A2. Desse modo definiu-se o meio A11 como o meio de crescimento e manutenção das culturas e o meio A2 como o de produção do metabólito. Este mesmo tipo de estratégia foi utilizado em culturas de outras plantas medicinais como Thalictrum minus,19 Morinda citrifolia10 e de Rollinia mucosa.20 ]]>
Comparando os teores de 4-nerolidilcatecol detectados nas culturas elicitadas ou não, sugere-se que a adição do elicitor favoreceu a indução e o aumento da atividade de enzimas envolvidas na rota metabólica da substância aumentando sua produção. De maneira geral os elicitores promovem também a liberação dos metabólitos para o meio extracelular.2,20 Na maioria das culturas de P.umbellata os teores de 4-nerolidilcatecol foram detectados somente na massa celular. As únicas culturas que liberaram a substância para o meio líquido, foram aquelas tratadas com 150 mg glucana/g PF. Considerando as baixas produtividade e viabilidade celular destas culturas, admite-se que a presença de 4-nerolidilcatecol no meio extracelular seja conseqüência da lise celular. Por outro lado, nas culturas de Eschoscholtzia californica,21 Ageratina adenophora22 e Picea abies23 a glucana estimulou a liberação dos metabólitos das células vivas para o meio de cultura.

Diante da constatação da produção de 4-nerolidilcatecol nas culturas em suspensão, tornam-se promissores novos estudos na área de Biotecnologia Vegetal e sua interação com a Enzimologia, a Fitoquímica e a Farmacologia. Devem ser estimuladas as pesquisas sobre as etapas da rota biossintética da substância, com adequação de metodologia para a otimização da produção em níveis comerciais.

Resumen

Producción de 4-nerolidilcatecol en suspensiones celulares de Pothomorphe umbellata (L.) Miq (Piperaceae)
En este estudio se presentan los datos referentes a la obtención de suspensiones celulares de Pothomorphe umbellata. Se empleo el medio Murashige & Skoog con 1,0 mg/L-1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacético y 0,1 mg/L-1 de 6-benziladenina. Los cultivos se iniciaron con callos "friables" extraidos de la lámina foliar de plantas adultas cultivadas in vivo. Se analizó la producción de biomasa y la síntesis de 4-nerolidilcatecol en los medios de cultivo. El medio descrito arriba suplementado con 20g/L-1 de glucosa fue el más eficiente para la producción de biomasa en tanto que la sustitución de la fuente de carbono por 30g/L-1de sacarosa propició mayor producción de 4-nerolidilcatecol. La adición del polisacárido glucano a los cultivos, estimuló la capacidad biosintética de los mismos. Se constató que el tiempo de incubación y la concentración de glucano influyeron positivamente en el proceso. La concentración máxima de 4-nerolidilcatecol (862,38 mg/g de peso seco) se obtuvo después de la incubación de los cultivos con 75 mg glucano/g de peso fresco/ 24 horas. Estos valores superaron a aquellos obtenidos a partir de plantas intactas y de suspensiones celulares a las cuales no se les adicionó el glucano.

Palabras clave: Suspensión celular, Pothomorphe umbellata, pariparoba, planta medicinal, medios de cultivo.

Summary

In this study we presented data related to the establishment of Pothomorphe umbellata cell suspension culture initiated from friable callus. Callus obtained from foliar blade explants of plants developed in vivo, were cultivated in MS medium supplemented with 1,0 mg.L-1 2,4-D + 0,1mg.L-1 BA. Cell suspension media were analyzed in relation to their effect on the production of 4-nerolidylcathechol and cell mass yield. MS supplemented with 20g.L-1 glucose + 1,0 mg.L-1 2,4-D + 0,1 mg.L-1 BA was the most efficient for cell biomass production while MS supplemented with 30g.L-1 sucrose + 1,0 mg.L-1 2,4-D + 0,1 mg.L-1 BA was the most efficient for 4-nerolidylcathechol production. Elicitation with glucana stimulated the synthesis of the substance and was positively influenced by incubation time and elicitor concentration. Maximum concentration of 4-nerolidylcatechol (862,38 mg/g DW) was obtained after incubation with 75 mg glucana/g cell FW for 24 h. This value is higher than those produced by plants developed in vivo and by non-elicitated cell suspensions. ]]>

Keywords: Cell suspension, pothomorphe umbellata, pariparoba, medicinal plant.

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Recibido: 24 de noviembre de 2003. Aprobado: 5 de diciembre de 2003. ]]> Dra.Vera Regina Campos Viana. Rua Marechal Jofre, 61/ apto 701- Grajaú Rio de Janeiro - Brasil - CEP- 20560-18(55)02125767472. E-mail: jfviana@uol.com.br

1PhD, Professor Adjunto.
2 MSc, Bióloga.