Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). CUBA
MsC. Antonia C. Remigio Montero,1 Lic. Janet Piloto Ferrer,2 MsC. Arilia García López,2 Lic. Martha Guerra Ordoñez,1 MsC. Esther Sánchez Gobin,1 Tec. Yamilé Vega Hurtado3
Se estudió el efecto genotóxico de un extracto de Indigofera suffruticosa Mill. mediante el ensayo Salmonella/microsomas con las líneas TA 1535, TA 1537, TA 98 y TA 100 que resultó positivo para el protocolo de incorporación en placas con las cepas TA 1535, TA 1537 con un rango de concentraciones de 50 a 5000 μg/placa (± S9). Mediante el ensayo de inducción de micronúcleos en médula ósea de ratón el extracto exhibió un aumento estadísticamente significativo en la frecuencia de PCE micronucleados en las hembras tratadas y una relación dosis respuesta positiva, cuando se evaluaron dosis de 500, 1000 y 2000 mg/kg por vía oral con el ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón.
Palabras claves: Genotoxicidad, médula ósea, micronúcleos, Indigofera suffruticosa Mill., Salmonella/microsomas.
El desarrollo que va teniendo Cuba en la industria fitofarmacéutica impone una política de seguridad farmacológica y toxicológica a la hora de elaborar y formular un medicamento de origen natural. Por esta razón, los estudios genotóxicos de los fitofármacos son esenciales para que puedan ser registrados y reconocidos como productos farmacéuticos para consumo humano. Sustancias presentes en las plantas pueden presentar propiedades relacionadas con procesos de diferenciación celular, carcinogénicas y mutagénicas.1-3 En las regulaciones farmacéuticas internacionales se establecen los estudios genotóxicos de todos los medicamentos que pueden ser consumidos por el ser humano ya sean de origen sintético o natural.
La especie Indigofera suffruticosa Mill. (Fabaceae), conocida en Cuba como añil cimarrón, es un arbusto muy común en toda la isla, muy distribuido en las otras Antillas Mayores, en varias de las Menores, el sudeste de Estados Unidos y América tropical. Se conoce que la maceración de sus raíces se utiliza como un insecticida muy poderoso y la decocción de sus hojas para baños y para lavar ropa, como analgésico, depurativo, diurético, antiinflamatorio, abortivo.4 En la medicina tradicional, esta planta ha sido utilizada en el tratamiento de la epilepsia,5 esta acción se ha evidenciado mediante los estudios realizados con extractos de la planta, en modelos de epilepsia aguda.6
Sin embargo, tiene demostrado efecto hepatotóxico en animales tratados con extractos acuosos del fruto y se ha descrito que induce las aberraciones cromosómicas in vivo,7 por lo que teniendo en cuenta que la información etnobotánica indica su uso popular como insecticida y con el objetivo de aumentar el conocimiento toxicogénetico de esta planta realizamos la evaluación genotóxica de un extracto hidroalcohólico de Indigofera suffruticosa Mill.
La planta se cultivó en la Estación Experimental de Plantas Medicinales “Dr. Juan Tomás Roig” en Güira de Melena, La Habana. Un ejemplar de la misma se conserva en el herbario de la institución con número ROIG 4594. El follaje de la planta se secó obteniendo 1 kg de droga seca llevada a percolación hidroalcohólica.8 El extracto final contenía 154,0 g de sólidos/L y 30 % de etanol (v/v).
Se empleó el método de incorporación en placa de acuerdo con el protocolo clásico descrito por Maron y Ames.9 Las líneas de Salmonella typhimurium recomendadas internacionalmente para esta prueba TA 1535, TA 1537, TA 98 y TA 100 fueron enviadas por el Dr. Bruce N. Ames (Universidad de California en Berkeley, USA). Se evaluaron 5 concentraciones del extracto de Indigofera suffruticosa en un rango de 50 a 5000 mg de sólidos/placa, se sembraron 3 placas por cada concentración en un experimento único.10 La fracción microsomal S9 fue preparada a partir de hígado de ratas Wistar tratadas con fenobarbital y 5,6-benzoflavona.11 La mezcla S9 utilizada para la activación metabólica externa contenía un 4 % de fracción S9 en una solución de cofactores.9 Las colonias revertantes se contaron manualmente después de 48 horas de incubación a 37 ºC. Los resultados se analizaron utilizando el programa de software SALANAL versión 1.0 (ILS, Research Triangle Park, NC, USA). Como criterios de genotoxicidad se asumieron aumentos significativos y dosis dependientes en la frecuencia de revertantes.
Se establecieron 5 grupos experimentales: control negativo (etanol al 30 %), control positivo (mitomicina C, 2 mg/kg) y 3 dosis del extracto 500, 1000 y 2000 mg/kg administrados en un volumen de 10 mL/kg por vía intragástrica.
Todos los solventes y el extracto en solución fueron aplicados siguiendo un mismo esquema de tratamiento, consistente en 2 administraciones, separadas entre sí por 24 horas. Los animales fueron sacrificados a las 24 horas de la última administración; este tiempo de muestreo está basado en la cinética de maduración de los eritrocitos en ratones.13
El procedimiento empleado para la obtención de las preparaciones de la médula ósea, fue realizado de acuerdo a la metodología propuesta por Schmid.14 Con este procedimiento se obtiene una tinción diferencial entre los eritrocitos policromáticos (PCE) y los eritrocitos normocromáticos (NCE). Se cuantifica el número de PCE portadores de micronúcleos (PCE-MN) y se expresa como porcentaje con respecto al total de PCE observados (2000 por animal).
Las diferencias entre el grupo control negativo y los grupos tratados, fueron analizadas con los valores reales para ambos índices o después de adecuadas trasformaciones de escala15 al realizar las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Bartlett. Posteriormente se realizó un análisis de varianza (ANOVA) bifactorial.
Los criterios de genotoxicidad tomados fueron los recomendados por Hayashi16 significación estadística del incremento del porcentaje PCE-MN en una o más dosis con respecto al control negativo. Como criterio de toxicidad se tomó la significación estadística de la disminución de la proporción PCE/NCE en una o más dosis con respecto al control negativo.17
La tabla 1 resume los resultados del ensayo de Ames. Como puede observarse, las cepas TA 1535 sin activación metabólica y la TA 1537 con y sin activación metabólica presentan un incremento significativo de la frecuencia de colonias revertantes por placas en concentraciones de 500, 1500, 5000 y 150, 500, 1500 µg/placa respectivamente, que es el parámetro de mutagenicidad para estos ensayos con las distintas cepas de Salmonella, para concentraciones de hasta 5 mg/placa, valor que se acepta como máximo de exposición en ausencia de problemas de solubilidad y toxicidad.18
Tabla 1. Resultados del ensayo de Salmonella/microsomas con el extracto de Indigofera suffruticosa Mill.
| Concentración (μg sólidos/placa) | Media de los revertantes/placa ± SD (n=3) | ||
| ]]> TA 100 |
| ||
| 0a | 205,33±64,07 | 167,33±24,83 | |
| 50 | 181,00±15,52 | 176,67±27,30 | |
| 150 | 138,33±17,21 | ]]> 209,00±89,42 | |
| 500 | 157,67±35,13 | 144,33±35,73 | |
| 1500 | 163,00±44,31 | 156,00±38,04 | |
| 5000 | 134,00±39,89 | 127,33±37,07 | |
| ]]> Azida de sodiob | 2021±24,5** |
| |
| Benzo-α-pirenob |
| 2029±27,6** | |
| TA 98 |
| ||
| 0a | 9,00±3,61 | ]]> 13,00±3,46 | |
| 50 | 12,33±5,86 | 13,33±3,21 | |
| 150 | 6,67±1,53 | 13,67±1,53 | |
| 500 | 10,67±3,06 | 12,00±10,00 | |
| ]]> 1500 | 8,33±3,51 | 18,67±6,51 | |
| 5000 | 12,00±7,81 | 19,33±5,86 | |
| Ácido picrolónicob | 1062,6±811,7** |
| |
| 2-amino fluorenob | ]]> | 2020±22,8** | |
| TA 1535 |
| ||
| 0a | 14,67±3,79 | 14,00±3,61 | |
| 50 | 55,00±41,73 | 11,00±5,20 | |
| ]]> 150 | 52,67±35,50 | 12,00±3,46 | |
| 500 | 101,33±28,92* | 11,67±5,69 | |
| 1500 | 139,67±23,29** | 11,00±3,61 | |
| 5000 | ]]> 257,33±36,30** | 22,00±0,00 | |
| Azida de sodiob | 881,3±105,1** |
| |
| Ciclofosfamidab |
| 708±187,06** | |
| TA 1537 |
| ||
| ]]> 0a | 7,00±4,58 | 6,67±5,51 | |
| 50 | 40,67±15,82 | 10,33±0,58 | |
| 150 | 54,33±16,26* | 10,00±1,73 | |
| 500 | ]]> 55,00±11,79** | 10,00±2,65 | |
| 1500 | 89,67±31,66* | 13,67±7,64 | |
| 5000 | 60,00±0,00 | 262,00±0,00* | |
| 9-amino acridinab | 1488±38,5** | ]]> | |
| 2-Aminoantracenob |
| 917,3±30,3** | |
a Control negativo, dimetil sulfóxido (DMSO)
b Controles positivos
** p<0,01
En la tabla 2 el IT en ratones machos para el grupo control fue de 1,60 ± 0,06; no se encontraron diferencias significativas al comparar estos resultados con el grupo tratado con el extracto (p<0,05), que correspondieron a 1,88 ± 0,31 para la dosis de 500 mg/kg de peso corporal, 2,06 ± 0,34 para la dosis de 1 000 mg/kg y 2,04 ± 0,14 para la dosis de 2 000 mg/kg de peso corporal respectivamente. En el caso del grupo tratado con mitomicina C, en el que la diferencia resultó significativa al compararla con el resto de los grupos estudiados, mostró un índice de citotoxicidad de 1,59 ± 0,53. Los resultados obtenidos en los grupos tratados con las diferentes concentraciones del extracto no difirieron entre ellos como tampoco con el grupo control negativo que correspondió al vehículo alcohólico.
Por otro lado, para las hembras, en los resultados obtenidos en el IT se pueden apreciar valores similares a los obtenidos en el grupo de los machos, se observa que el control negativo mostró un índice de citotoxicidad de 1,67 ± 0,05. Estos valores no se diferenciaron de los encontrados en los grupos a los que se les administraron los extractos que fueron de 1,82 ± 0,28; 2,15 ± 0,08; 2,25 ± 0,54 para las dosis de 500, 1 000 y 2 000 mg/kg de peso corporal respectivamente para una p<0,05. El valor obtenido con la mitomicina C fue superior a todos los grupos tratados que exhibió un índice de citotoxicidad de 1,70 ± 0,29; resultado que fue diferente significativamente del resto de los tratamientos para una p>0,05.
Tabla 2. Porcentaje de micronúcleos e Índice de toxicidad de los grupos controles y tratados.
| Dosis (mg/kg) | ]]> Sexo | Índice de Toxicidad (PCE/NCE) (X ± DE) | Índice de Genotoxicidad |
| 500 | M | 1,88 ± 0,31 | 1,13 ± 0,05 |
| H | 1,82 ± 0,28 | 1,12 ± 0,05** | |
| ]]> 1000 | M | 2,06 ± 0,34 | 1,01 ± 0,03 |
| H | 2,15 ± 0,08 | 1,06 ± 0,09 | |
| 2000 | M | 2,04 ± 0,14 | ]]> 1,06 ± 0,09 |
| H | 2,25 ± 0,54 | 1,30 ± 0,02** | |
| Mitomicina C | M | 1,59 ± 0,53 | 1,57 ± 0,18** |
| H | 1,70 ± 0,29 | ]]> 1,50 ±0,20** | |
| Espontáneo | M | 1,89 ± 0,49 | 1,14 ± 0,05 |
| H | 1,99 ± 0,18 | 1,14 ± 0,04 | |
| Etanol 30 % | M | ]]> 1,60 ± 0,06 | 1,04 ± 0,03 |
| H | 1,67 ± 0,05 | 1,02 ± 0,01 |
MN: micronúcleos
PCE: eritrocitos policromáticos
NCE: eritrocitos normocromáticos
X: media
DE: desviación estándar
M: machos
H: hembras
** Diferencia significativa respecto al control negativo (p<0.01).
De acuerdo a los resultados por sexo en cada uno de los grupos y dosis se constató que no se observaron diferencias significativas para una p<0,05.
Es conocido que los extractos de plantas superiores constituyen mezclas complejas que contienen un gran número de sustancias con propiedades mutagénicas y también antimutagénicas.19 A los flavonoides se les atribuyen diferentes propiedades tanto farmacológicas: antiinflamatorias, antimutagénicas y anticarcinogénicas,20-24 como tóxicas. Se describió actividad mutagénica al emplearse altas dosis, además de ser pro-oxidantes e inhibidores de enzimas relacionadas con el metabolismo hormonal.25
La familia de las Papilonáceas se caracteriza por presentar una amplia variedad de especies con presencia de flavonoides que reflejan tanto propiedades anticarcinogénicas como carcinogénicas, por su diferente participación en el metabolismo de los xenobióticos,24 otro de los componentes presentes es el kaempferol26 el cual tiene reportes positivos de mutagenicidad al aumentar significativamente la inducción de revertantes en Salmonella typhimurium en la línea TA 98 e incrementar las aberraciones cromosómicas en células V7927.
]]> Resultados similares obtuvimos con las cepas TA 1535 y TA 1537 donde observamos un incremento significativo de la frecuencia de revertantes por colonia, sin y con activación metabólica exógena y efecto dosis – respuesta positivo.Por otro lado el ANOVA de una vía mostró diferencias significativas entre las dosis para las hembras para el porcentaje de PCE micronucleados. La prueba de hipótesis para las medias mostró que las diferencias significativas correspondían a la concentración de 500 mg/kg p.c. (hembras) y de 2000 mg/kg p.c (hembras). El ANOVA de dos vías para dosis y sexo demostró que la relación PCE/NCE indicadora de toxicidad medular no mostró diferencias significativas (sexo p=0,59 y dosis p=0,13). En el caso de los PCE micronucleados (MN/PCE) sí se mostraron diferencias significativas con respecto al control negativo para las hembras. En la prueba de Cochran-Armitage para las tendencias lineales en las proporciones para las hembras fue (1- P(z): 1.110) considerándose positivo.
Estos resultados sugieren que la Indigofera suffruticosa contiene sustancias con actividad mutagénica y potencialmente carcinogénica. Nuestra conclusión se basa en estudios utilizando extractos alcohólicos. Los efectos de la exposición a extractos solubles no alcohólicos se desconocen por lo que sugerimos extender nuestra investigación y realizar estudios con poblaciones expuestas.
It was accomplished the study of the genotoxic effect of extract of Indigofera suffruticosa Mill. using the Salmonella/microsoma assay in strains TA 1535, TA 1537, TA 98 and TA 100 was positive in a plate incorporation protocol with concentrations ranging from 50 to 5000 mg/plate (± S9) for the strains TA 1535, TA 1537. The extract of Indigofera suffruticosa Mill. exhibited the significantly increment in the frequency of micronucleated polychromatic erythrocytes in female mice and dose-dependent genotoxicity to mouse bone marrow micronucleus test at the doses of 500, 1000 and 2000 mg/kg assayed.
Key words: Genotoxicity, bone marrow, micronucleus, Indigofera suffruticosa Mill., Salmonella/microsomas.
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Recibido: 29 de junio de 2007. Aprobado: 27 de agosto de 2007.
Lic. Antonia C. Remigio Montero. Ave. 26 No 1605 e/ Puentes Grandes y Boyeros, Plaza. Ciudad de la Habana. CP 106000 Telf. 811930; 8811424, e-mail: antonia@cidem.quimefa.cu Fax: 53-7 335556
1Investigador Auxiliar
2Investigador Agregado
3Técnico Medio