Evaluación fitoquímica y farmacológica de frutos de Erythroxylum minutifolium Griseb. (Erythroxylaceae)
Phytochemical and pharmacological evaluation of the fruits of Erythroxylum minutifolium Griseb. (Erythroxylaceae)
Sandra María Toledo-CastroI; José A. González-LavautII; Olga EchemendíaIII; Nelson García-GonzálezIV
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I Licenciada en Química. Investigadora Aspirante. Centro de Química Farmacéutica. La Habana, Cuba.
Fundamentos: el género Erythroxylum se encuentra ampliamente representado en Cuba con 21 especies de las cuales 16 son endémicas y algunas se utilizan con fines etnomédicos. Erythroxylum minutifolium Griseb. (Erythoxylaceae) es una especie endémica muy abundante en Cuba, sin embargo, sus frutos no han sido estudiados desde el punto de vista químico ni farmacológico.
Objetivos: realizar una evaluación por grupos químicos del extracto total, efectuar el fraccionamiento fitoquímico con disolventes de diferentes polaridades para evaluar la detección de flavonoides, coumarinas y alcaloides y la acción antibacteriana a estos extractos.
Métodos: se emplearon los métodos conocidos de detección fitoquímica y para el estudio de actividad antibacteriana se utilizó el ensayo de difusión por discos. ]]>
Resultados: las evaluaciones fitoquímicas por grupos químicos para el extracto total y del fraccionamiento con 5 disolventes de diferentes polaridades revelan la presencia de flavonoides y la ausencia de alcaloides y coumarinas. El extracto total no muestra actividad antibacteriana frente a Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus; mientras que presenta toxicidad hasta valores de 1 mg/mL.
Conclusiones: en los frutos de la especie, el extracto total y los disolventes de diferentes polaridades muestran solo la presencia de flavonoides; el extracto total tiene baja toxicidad y no presenta actividad antibacteriana.
Palabras clave: Erythroxylum minutifolium, fitoquímica, farmacología, flavonoides, Cuba.
Foundations: the genus Erythroxylum is widely represented in Cuba with 21 species of which 18 are endemic and some are used with etnomedical ends. Erythroxylum minutifolium Griseb. (Erythoxylaceae) is a very abundant endemic species in Cuba, however, its fruits have not been studied from the chemical or pharmacological point of view.
Objective: to carry out an evaluation of the total extract by chemical groups and to perform the phytochemical fractioning with solvents of different polarities to evaluate the detection of flavonoids, coumarins and alkaloids and the antibacterial action to these extracts.
Methods: the known methods of phytochemical detection were used, whereas the by disc difussion test was utilized for the study of antibacterial activity.
Results: the phytochemical evaluations by chemical groups for the total extract and of fractioning with 5 solvents of different polarities proved the presence of flavanoids and the absence of alkaloids and coumarins. The total extract did not show antibacterial activity against Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus. It presented toxicity up to values of 1 mg/ml.
Conclusions: in the fruits of the species, the total extract and the solvents of diverse polarities showed only the presence of flavonoids. The total extract had low toxicity and it did not show antibacterial activity. ]]>
INTRODUCCIÓN
Durante mucho tiempo las plantas medicinales han sido el principal e incluso el único recurso terapéutico disponible. Esto hizo que se profundizara en el conocimiento de las especies vegetales que poseen propiedades medicinales.1
El género Erythroxylum constituye el más grande e importante género de la familia Erythroxylaceae. En Cuba existen 21 especies, de las cuales 16 son endémicas; entre estas se destaca Erythroxylum minutifolium Griseb. var. minutifolium (Erythoxylaceae), especie endémica abundantemente distribuida en Pinar del Río y otras provincias de Cuba.2
En la literatura especializada con respecto a las diferentes especies del género Erythroxylum se hace referencia a las propiedades estimulantes, contra la fatiga, cefaleas y dolor de garganta. También las especies de este género se han utilizado contra la fiebre, los desórdenes hepáticos y renales, antiinflamatorio, entre otras.3 Los órganos vegetales más utilizados en la medicina tradicional son las partes aéreas. En Cuba se han empleado extractos de estas plantas como antiinflamatorio y en el tratamiento de enfermedades relacionadas con estados virales, como la bronquitis y otras afecciones respiratorias.4,5 ]]>
Muchas de las propiedades farmacológicas descritas para las diferentes especies del género se deben a la presencia de alcaloides del tipo tropano;6 terpenoides y triterpeno, los flavonoides, como taninos condensados,7-9 pterocarpanos10 y acetofenonas.11La composición fitoquímica de los frutos de E. minutifolium nunca ha sido descrita, es por ello que el objetivo de este trabajo es mostrar los primeros resultados del tamizaje fitoquímico y la evaluación citotóxica y antibacteriana para la especie.
MÉTODOS
Recolección y preparación del material vegetal
Los frutos maduros de E. minutifolium fueron colectados de forma manual en agosto de 2006 en la localidad de San Juan y Martínez, Pinar del Río, Cuba; codificada en el Herbario del Instituto Pedagógico de Pinar del Río con el número de herbario HPPR-9200 y autenticada por el doctor Armando Urquiola, director del Jardín Botánico de Pinar del Río.
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Preparación del extracto total
80,0 g de los frutos maduros de E. minutifolium se trituraron en una batidora con 400 mL de etanol natural (96 º) durante 5 min. Se dejó en reposo durante 7 d, se filtró mediante embudo de placa filtrante sobre tela. El filtrado fue conservado y el residuo fue nuevamente extraído con 400 mL de etanol, siguiendo el mismo procedimiento. Ambos filtrados fueron reunidos y llevados a sequedad utilizando un rotaevaporador al vacío y temperatura no mayor de 45 ºC; se obtuvo un residuo en forma de aceite que pesó 6,5 g (1,6 %).
Fraccionamiento fitoquímico
Se tomaron 3,0 g del extracto total y se mezclaron con 120 mL de agua destilada, se agitó magnéticamente y se procedió a la realización de la filtración a vacío, utilizando un embudo de placa filtrante y doble tela como reservorio. Luego se realizaron extracciones líquido-líquido con 20 mL de diferentes disolventes de polaridad creciente: n-hexano, cloroformo, éter etílico, acetato de etilo y n-butanol; el procedimiento de extracción se realizó por triplicado.
Determinación de la composición fitoquímica de los extractos orgánicos
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a. Mediante cromatografía de capa delgada (CCD) se realizó la identificación cualitativa de metabolitos secundarios (alcaloides, coumarinas y flavonoides) en los extractos, utilizando como fase estacionaria placas preelaboradas sobre vidrio de gel de sílice 60 F254 (Merck) y como fase móvil los sistemas de disolventes que se muestran en la tabla 1.Las manchas fueron visualizadas mediante la luz ultravioleta (254 y 365 nm) y luego fueron reveladas con el reactivo Dragendorff, amoniaco y ácido sulfúrico en etanol 5 % (v/v) para alcaloides, coumarinas y flavonoides, respectivamente.
b. Ensayo de coumarinas: a 0,5 g del extracto total seco se le añadió 5 mL de agua destilada, se cubrió el tubo de ensayos con un papel de filtro húmedo en hidróxido de sodio 10 %. Se colocó el tubo de ensayo con la muestra en baño de María por 5 min y el papel de filtro se expuso a la luz ultravioleta.
Ensayo de citotoxicidad in vitro
La citotoxicidad de las diferentes fracciones de E. minutifolium se evaluaron mediante un ensayo basado en el cambio del color que ocurre cuando se produce la reducción del 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil bromuro de tetrazolium (MTT-Sigma, St. Louis, MO) por las enzimas mitocondriales. Los ensayos se realizaron con el empleo de placas de cultivo de tejidos de 96 pozos de fondo plano. Las muestras, de concentraciones crecientes (31,25-1 000 µg/mL) de los extractos de las plantas, se agregaron por triplicado en las placas y se incubaron a 37 ºC en una atmósfera de CO2. Después se añadió el MTT y los cultivos se incubaron varias horas. Posteriormente se les midió la absorbancia a 570 nm con un lector ELISA que emplea placas de 96 pozos. La concentración citotóxica a 50 % (CC50) se determinó con el uso del programa EXCEL (Microsoft® EXCEL 97, 1985-1997).
Para confirmar los resultados obtenidos con el ensayo de MTT, las monocapas se observaron también microscópicamente para estimar el efecto citopático (CPE), es decir los cambios morfológicos producidos con respecto a las células del control.
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Ensayos in vitro de actividad antibacteriana
Bacteria grampositiva: Staphylococcus aureus, ATCC 25923
Bacterias gramnegativas: Escherichia coli, ATCC 25922; Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Metodología experimental
Para evaluar la actividad antibacteriana de los extractos preparados (extracto total de decocción, extracto metabólico y butanólico), se utilizó el ensayo de difusión por discos según los estándares aprobados internacionalmente. Algunas particularidades específicas para cada tipo de microorganismo se detallan a continuación.
Ensayos con bacterias ]]>
Se utilizó el método directo de inoculación en el caldo de Mueller-Hinton (OXOID) a partir de colonias aisladas de una placa de cultivo, con 24 h de incubación. La suspensión se ajustó a la escala 0,5 de McFaraland (concentración estándar de 1 x 108 células/mL). Placas con agar de Mueller-Hinton (OXOID) se inocularon y se realizó el hisopado en varias direcciones para cubrir toda el área de la placa y garantizar una distribución homogénea del inóculo. Se prepararon discos de papel filtro (Whatman 3), a los que se les asignaron las cargas de 100, 500 y 1 000 µg del extracto a evaluar. De la misma forma se aplicó un disco impregnado con 10 µg/L del vehículo utilizado en la dilución de las muestras (metanol) y otro con los fármacos de referencia empleados, que fueron: 10 µg de ampicilina contra la bacteria grampositiva y 30 µg de amikacina para las bacterias gramnegativas. Estos discos se colocaron sobre la superficie de las placas inoculadas y se les presionó levemente para garantizar que el contacto fuese total. Luego de 24 h de incubación, las placas se examinaron y se verificó el crecimiento de las colonias. Las zonas de inhibición se midieron con regla milimetrada.
Para todos los ensayos de actividad antibacteriana se realizaron 3 réplicas y los resultados considerados son el promedio de los valores obtenidos en cada caso.
RESULTADOS
La cantidad de producto total extraído de forma seca se expresa como la masa del residuo seco de cada extracto por empleo de los diferentes disolventes de distintas polaridades y se muestran en la tabla 2. ]]>
La composición fitoquímica de los extractos de diferentes disolventes se muestra en la tabla 3.
Para el caso de los flavonoides el mejor sistema de disolvente para determinar la presencia del metabolito en los diferentes extractos fue el BAW (7:1,5:1,5; v/v/v). En relación con el extracto acetato de etilo se detectaron 3 manchas fundamentales con Rf de 0,88; 0,77 y 0,64; estas manchas se separaron bien con la utilización de esta fase móvil y al ser asperjadas con el revelador químico tomaron coloración naranja, típica de este tipo de compuestos. Mientras que para el caso del extracto n-butanólico se detectaron 2 manchas con valores de Rf de 0,76 y 0,60 que también tomaron coloración naranja al ser reveladas.
En la evaluación citotóxica y antibacteriana de los diversos extractos de diferente polaridad, se obtuvo que los extractos de acetato de etilo y n-butanólico no muestran actividad antibacteriana frente a las bacterias Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus.
DISCUSIÓN ]]>
El disolvente que más extrajo del extracto total fue el n-butanol (52,6 %), lo que permite mostrar que en la composición del extracto total predominan los metabolitos de naturaleza polar. Esto da la idea de que el extracto total contiene en mayor proporción a las sustancias de alta polaridad que se disuelven en este tipo de alcohol, lo cual presupone la presencia de grupos hidroxilos en su composición.
Estudios fitoquímicos anteriores realizados a las hojas y ramas de esta especie12,13 demostraron que los metabolitos más abundantes eran alcaloides, coumarinas y flavonoides; sin embargo, al realizar la evaluación fitoquímica a los frutos mediante CCD al utilizar los sistemas de disolventes, se observó la presencia de flavonoides para los extractos de acetato de etilo y n-butanol, mientras que es negativa la presencia de alcaloides y coumarinas para todos los extractos. En lo particular, fueron detectados los flavonoides como grupos químicos fundamentales en los extractos de disolventes polares, esto corrobora que es una familia de metabolitos fundamentales que se encuentran presentes en el género Erythroxylum. Resulta llamativa la ausencia de alcaloides, por cuanto esta familia de compuestos se presenta de forma abundante en el género para otras partes de la planta, como son las hojas y la corteza. Por otro lado, este resultado es importante, teniendo en cuenta que la información extraída de la literatura y de resultados anteriores del grupo de investigación,14-16 indica que los flavonoides son los metabolitos responsables de la actividad biológica asociada al género; en este caso como antiherpética y antioxidante.
Los extractos secos de acetato de etilo y n-butanólico no expresaron efecto citotóxico a la concentración máxima ensayada (1 000 µg/mL); lo cual se puede correlacionar con la ausencia de alcaloides que de manera general sí son compuestos que muestran acción tóxica. Por otro lado, este resultado es de gran importancia, teniendo en cuenta que con este valor se pueden acotar las concentraciones necesarias para realizar otros ensayos farmacológicos con una posible utilidad terapéutica.
En cuanto a la actividad antibacteriana frente a las bacterias utilizadas: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus los resultados fueron inactivos, esto es lógico teniendo en cuenta que esos extractos son ricos en flavonoides y a estos metabolitos, en general, no se les atribuye la responsabilidad de la actividad antibacteriana como es el caso de los alcaloides.
Como conclusión, se realiza por primera vez un estudio con los frutos de E. minutifolium, los cuales muestran en el extracto total y en disolventes polares la presencia de flavonoides; mientras que no se detectan alcaloides y coumarinas. El extracto total no muestra actividad antibacteriana, así como una baja toxicidad a concentraciones menores que 1 000 µg/mL.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Recibido: 10 de noviembre de 2007.
Dr. José A González-Lavaut. Calle 200 y Ave. 21, Atabey, municipio Playa, AP 16042, Ciudad de La Habana, CP 11600. Cuba. Teléf.: (537) 2085103. Correo electrónico: josea.lavaut@infomed.sld.cu
Centro de Química Farmacéutica
Instituto Finlay ]]>
