ARTÍCULO ORIGINAL

Estudio químico de la resina de la especie endémica Calophyllum pinetorum Bisse

Chemical study of the resin of the endemic species Calophyllum pinetorum Bisse

]]> Adonis Bello Alarcón^I; Osmany Cuesta Rubio^II; Ricardo Méndez Lorenzo^III; Anna Lisa^IV; Luca Rastrelli^V; Carolina Arevalo^VI

^I Máster en Ciencias. Profesor Auxiliar. Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana, Cuba.
^II Doctor en Ciencias. Profesor Titular. Instituto de Farmacia y Alimentos. La Habana, Cuba.
^III Máster en Ciencias. Instituto de Farmacia y Alimentos. La Habana, Cuba.
^IV Doctora en Ciencias. Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Salerno, Italia.
^V Doctor en Ciencias. Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Salerno, Italia.
^VI Licenciada. Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Salerno, Italia. ]]>  

Objetivos: aislar e identificar los componentes principales presentes en el extracto metanólico de la resina de la especie Calophyllum pinetorum Bisse.
Métodos: la cromatografía líquida de alta resolución se utilizó para la separación de los compuestos. Para la caracterización estructural se emplearon las técnicas de resonancia magnética nuclear y la espectrometría de masas.
Resultados: el proceso de separación permitió el aislamiento de 3 compuestos que fueron reconocidos como derivados de cromonas. Los compuestos 1-3 fueron identificados como: ácido calolóngico, ácido apetálico y ácido isoapetálico.
Conclusiones: la presencia de cromonas se corresponde con los estudios realizados con otras especies de este género, pero es la primera vez que estos compuestos se aíslan e identifican desde una misma especie. Por otra parte, es la primera vez que se informa la presencia de cromonas en la resina de este género.

Palabras clave: Calophyllum, cromonas, ácido calolóngico, ácido apetálico y ácido isoapetálico.

Objectives: to isolate and identify the main components in the methanolic extract of the resin of the species Calophyllum pinetorum Bisse.
Methods: high resolution liquid chromatography was used for the separation of the compounds. Magnetic resonance imaging and mass spectrometry were used for the structural characterization.
Results: the separation process allowed the isolation of 3 compounds that were recognized as derivatives of chromans. The compounds 1-3 were identified as calolongic acid, apetalic acid and isoapetalic acid.
Conclusions: the presence of chromans corresponds with the studies conducted with other species of this genus, but it is the first time that these compounds are isolated and identified from the same species. On the other hand, it is reported for the first time, too, the presence of chromans in the resin of this genus.

Key words: Calophyllum, chromans, calolongic acid, apetalic acid, isoapetalic acid.

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INTRODUCCIÓN

La especie Calophyllum pinetorum Bisse pertenece a la familia Clusiaceae. El género Calophyllum se caracteriza por producir una gran variedad de metabolitos secundarios. Las coumarinas y las xantonas son los compuestos más reportados, aunque también existen numerosas referencias de flavonoides, biflavonoides y cromonas y en menor medida triterpenos, esteroides y fenil cetonas.^1-4 Un elemento químico distintivo de este género es la presencia de restos isoprenoides como sustituyentes de los metabolitos antes mencionados. La mayoría de estos metabolitos han sido aislados desde partes aéreas del vegetal y según nuestro conocimiento, se han realizado pocos estudios químicos con las resinas de este género.

Desde el punto de vista biológico, los principales resultados se asocian con la actividad antiviral, que ha sido evaluada principalmente en coumarinas, xantonas y cromonas. También existen importantes referencias a la actividad quimioprotectora del cáncer, al efecto antimicrobiano de amplio espectro y en menor grado a la actividad analgésica.^5-8

En este trabajo se realiza un estudio químico a la resina de la especie endémica C. pinetorum por primera vez. La metodología de trabajo desarrollada permitió aislar e identificar 3 compuestos mayoritarios: ácido calolóngico, ácido apetálico y ácido isoapetálico.

MÉTODOS

]]> La resina de la especie C. pinetorum empleada en este trabajo fue colectada en el Jardín Botánico Nacional, en octubre de 2005. La identificación botánica de la especie fue realizada por el doctor Víctor Fuente Fiallo. Una muestra del ejemplar se conserva con el número de herbario HAJB 84364.

La resina empleada se recolectó desde la corteza del vegetal, donde previamente existía una magulladura o herida, con el empleo de una espátula. Se realizaron pruebas de disolución empleando 50 mg de resina y 3 disolventes (1 mL): hexano, acetato de etilo y metanol. Los extractos se concentraron a presión reducida (40 °C) en un rotoevaporador Buchi empleando un vial de vidrio de 8 mL.

Para el análisis cualitativo de la resina se utilizó la cromatografía en capa delgada (CCD) de sílica gel GF 254 (Merck) sobre soporte de aluminio y como fase móvil una mezcla de cloroformo y metanol (9:1). Las cámaras cromatográficas fueron ambientadas con el sistema de disolventes, durante un período de tiempo de 15 min, antes de ser empleadas para realizar los correspondientes cromatogramas. Las placas fueron secadas en la corriente de aire de la campana hasta lograr la total remoción de la fase móvil, sometiéndolas luego a un proceso de revelado con luz ultravioleta (254 y 365 nm) y una disolución de sulfato de cerio IV y calor.

La cromatografía líquida de alta resolución (CLAR, método preparativo) se desarrolló empleando una columna m-Bondapak C-18 (300 x 7,8 mm, 10 mm) Waters. Como fase móvil se utilizó una mezcla metanol-agua 82 %, impulsada por bombas Waters 590 a una velocidad de flujo de 2,5 a 3 mL/min. Las inyecciones se realizaron manualmente y se empleó un loop de 100 mL. Como detector se empleó un detector de índice de refracción Waters R401. El estudio se realizó a temperatura ambiente.

Para este trabajo se tomaron 20 mg de la resina y se disolvieron en 5 mL de la fase móvil con el empleo de un baño ultrasónico. La disolución se centrifugó a 4 000 rpm x 5 min antes de inyectar.

Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) se realizaron en un equipo Bruker DRX-600. Se empleó tetrametilsilano (TMS) como referencia interna y como disolvente metanol deuterado (CD₃OD). Los datos de corrimiento químico se expresaron en la escala delta (d). A todos los productos se le realizaron los espectros RMN¹H, RMN¹³C, H-H COSY, HSQC y HMBC. Los espectros se desarrollaron según los métodos descritos en la literatura.⁹

Las masas exactas fueron medidas con un espectrómetro de masa de triple cuadrupolo ortogonal, de tiempo de vuelo, Q-Star Pulsar (Applied Biosystems) con ionización por electrospray. Las muestras fueron disueltas en metanol, mezcladas con el calibrante interno e introducidas directamente en la fuente iónica por infusión directa. La calibración fue realizada con los picos de CsI y un péptido sintético a m/z 132,9054 y 829,5398, respectivamente.

RESULTADOS ]]> La resina colectada presentó un color amarillo intenso y una alta viscosidad. Se colectaron 900 mg de resina desde el tronco de un ejemplar de C. pinetorum

El proceso de disolución de la resina mostró buenos resultados con los 3 disolventes ensayados. En todos los casos se aprecia una disolución traslúcida de color amarillo y un residuo de color blanco. Un resultado similar se observa al emplear mezclas de estos disolventes. La disolución con metanol permitió obtener un residuo de 300 mg a partir de 700 mg de resina.

El análisis realizado por cromatografía en capa delgada para comparar los diferentes extractos de la resina, permitió demostrar su similitud cualitativa. En todos los casos se apreció una sola mancha de coloración amarilla visible (Rf= 0,5), que se oscurece al revelar con la disolución de sulfato de cerio IV.

El extracto metanólico de la resina se sometió a un proceso de separación por CLAR preparativa empleando MeOH:H₂0 (82 %) como fase móvil. En el cromatograma (fig. 1), se pueden observar los resultados del experimento. Se definieron 7 señales cromatográficas principales que se colectaron en 22 subfraciones. Estas se reunieron en 12 fracciones teniendo en cuenta la similitud de sus espectros de RMN ¹H.

En la tabla 1 se resumen estos resultados. Como puede observarse resultó posible aislar 4 compuestos principales que fueron denominados 1-4.

Los datos de RMN y de espectrometría de masas obtenidos sugieren que los compuestos 1, 2 y 3 presentan un núcleo de cromona. El espectro de masas de alta resolución muestra que los 3 compuestos son isómeros, pues sus iones moleculares ([M-H]^- 387,1792 [1]; 387,1787 [2]; 387,1793 [3]) indican una fórmula general C₂₂H₂₈O₆. Los datos aportados por la técnica de espectrometría de masas, el análisis de los espectros de RMN (tabla 2) y los antecedentes informados en la literatura, permitieron identificar a los compuestos 1, 2 y 3 como ácido apetálico,¹⁰ ácido isoapetálico¹¹ y ácido calolóngico,¹² respectivamente (fig. 2). El ácido apetálico constituye el componente mayoritario de la resina.

* d en ppm. CDCl₃ como disolvente. 600 MHz para ¹H y 125 MHz para ¹³C. TMS como referencia interna.

La estructura del compuesto 4 no se determinó por no poseer suficiente muestra para la realización del análisis espectroscópico.

DISCUSIÓN

La similitud observada en el análisis cromatográfico realizado por la técnica de CCD permitió sugerir la amplia solubilidad de los compuestos de color amarillo que caracterizan el cromatograma. Este comportamiento ha sido observado con frecuencia en metabolitos de naturaleza fenólica que poseen grupos prenilados y sugiere que su extracción puede ser realizada con cualquiera de los disolventes ensayados. Considerando que el proceso de separación se realizaría por CLAR de fase reversa, se seleccionó la variante de extracción con metanol para continuar el estudio. De esta manera se minimiza la extracción de los componentes más apolares presentes en la resina y se emplea un disolvente relacionado con las fases móviles comunes a la técnica de separación empleada.

El cromatograma CLAR obtenido no mostró una alta complejidad, si se tiene en cuenta que se corresponde con el análisis de un producto natural. Los picos cromatográficos fundamentales fueron divididos en el proceso de colección de los eluatos, para disminuir la posibilidad de superposición de componentes con tiempo de retención similar. Los espectros de RMN ¹H realizados a cada subfracción permitieron reunir de forma inequívoca los compuestos con igual comportamiento espectroscópico. De esta forma se obtuvieron 3 compuestos (1-3) con características espectroscópicas muy similares.

Los espectros de RMN realizados permitieron identificar las características estructurales comunes a las cromonas aisladas con anterioridad del género Calophyllum. Los 2 grupos metilos (C-11 y C-12) en los rangos 16-20 ppm y 9-10 ppm, respectivamente; los metinos C-2 (76-79 ppm) y C-3 (44-46 ppm), el carbonilo (C-4) en el intervalo 198-201 ppm (en dependencia de la estereoquímica cis/ trans), el hidroxilo quelatado (OH-5, ~12,5 ppm) y la ausencia de protones aromáticos, permitieron identificar la presencia del núcleo de cromona con un anillo aromático totalmente sustituido. ]]> El sistema de espín AX formado por los protones olefinicos (H-9 y H-10) en 5,46 y 6,50-6,60 ppm, respectivamente; y los metilos equivalentes (C-19 y C-20) que sustituyen al carbono cuaternario (C-8) en 78,0-78,1 ppm, permitieron identificar la presencia de un residuo de pirano como sustituyente del anillo aromático. El sustituyente adicional se identifica como un residuo de ácido hexanoico (C-13 a C-18) que sustituye la posición C-6.

Las principales interacciones del espectro HMBC que permitieron definir inequívocamente las estructuras isoméricas 1-3 se resumen en la tabla 2. La estereoquímica relativa de las posiciones C-2 y C-3 se sugieren sobre la base de la comparación de los corrimientos químicos obtenidos y aquellos informados en la literatura.^10-12

El estudio químico de la resina de C. pinetorum permitió aislar e identificar como componentes mayoritarios las cromonas ácido apetálico, ácido isoapetálico y ácido calolóngico. La presencia de este tipo de metabolito se corresponde con los estudios realizados en otras especies de este género, pero es la primera vez que estas cromonas se aíslan e identifican desde una misma especie. Por otra parte, es la primera vez que se identifica la presencia de cromonas en la resina de este género.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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2. Ito Ch, Itoigawa M, Mishina Y, Filho VC, Mukainaka T, Tokuda H, et al. «Chemical Constituents of Calophyllum brasiliensis: Structure Elucidation of Seven New Xanthones and Their Cancer Chemopreventive activity». J Nat Prod. 2002;65:267-72.

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Recibido: 24 de marzo de 2008.

Aprobado: 22 de abril de 2008.

M. C. Adonis Bello Alarcón. Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana. Cuba. Ave 23 No. 21425 entre 214 y 222. La Coronela. Lisa. Ciudad de La Habana. Teléf.: 271-6898. Correos electrónicos: qfarmaceutica@infomed.sld.cu; osmanycr@infomed.sld.cu ]]> Instituto de Farmacia y Alimentos, Universidad de La Habana
Departamento de Ciencia Farmacéutica, Universidad de Salerno, Via Ponte Don Melillo, 84084, Fisciano, Salerno, Italia ]]> 1 2003 66 368-71 2 2002 65 267-72 3 1998 49 4 4 995-8 4 1998 61 1252-6 5 1993 36 26 26 4131 6 1992 35 2735-43 7 2007 130 4 4 346-53 8 2005 53 2 2 244-7 9 1996 59 8 8 754-8 10 2004 65 2789-95 11 1968 24 6411-5 12 1971 10 2139-45