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^I Magíster en Ciencias Farmacéuticas. Departamento de Farmacia. Facultad de Farmacia. Universidad de Concepción. Concepción, Chile.
^II Químico Farmacéutico. Departamento de Farmacia. Facultad de Farmacia. Universidad de Concepción. Concepción, Chile.

RESUMEN

INTRODUCCIÓN: los compuestos fenólicos son reconocidos antioxidantes y su habitual ingesta contribuye a mejorar el estatus antioxidante plasmático. Hallazgos fitoquímicos describen composición fenólica en las hojas de Aristotelia chilensis (Molina) Stuntz, por lo tanto, su administración en infusiones pudiera constituir un apoyo para la prevención de enfermedades cuya etiología radique en el estrés oxidativo.
OBJETIVO: evaluar la capacidad antioxidante de la infusión y extractos de hojas secas de Aristotelia chilensis (Molina) Stuntz.
MÉTODOS: las hojas se sometieron a extracción con solventes sucesivos y se evaluó la capacidad estabilizadora del radical 2,2´- azino-di-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonatodiamonio) e hidroxilo tanto de los extractos como de la infusión 1 %. Se evaluó también la capacidad antioxidante plasmática antes y después de la ingesta de infusión de acuerdo con el uso etnomédico. ]]> RESULTADOS: los extractos obtenidos con solventes polares mostraron capacidad estabilizadora de radicales libres y la capacidad antioxidante del plasma, luego de la ingesta de infusión de A. chilensis, aumentó en promedio 30,27 %.
CONCLUSIONES: la infusión y extractos polares de A. chilensis presentan capacidad antioxidante en las condiciones descritas.

Palabras clave: Aristotelia chilensis, radicales libres, capacidad antioxidante.

ABSTRACT

INTRODUCTION: phenolic compounds are well-known antioxidants and their regular ingestion contribute to improve antioxidant status of plasma. Phytochemical findings describe phenolic compounds in Aristotelia chilensis (Molina) Stuntz leaves, therefore, their administration in herbal teas may support the prevention of diseases whose etiology lies in the oxidative stress.
OBJETIVE: to evaluate the antioxidant capacity of the herbal tea and the extracts from dry Aristotelia chilensis (Molina) Stuntz leaves. ]]> METHODS: the leaves underwent a phenolic extraction process with successive solvents, and the stabilizing capacity of radical 2,2´- azino-di-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonatodiamonio) and hydroxyl both from extracts and 1 % tea was evaluated. Also the antioxidant capacity of plasma before and after taking the tea was evaluated according to the etnomedical use.
RESULTS: the extracts obtained with polar solvents showed the stabilizing capacity of free radicals and the antioxidant capacity of plasma which, after taking A. chilensis tea, increased to 30.27% as an average.
CONCLUSION: herbal tea and extracts from A. chilensis exhibited antioxidant capacity under the described conditions.

Key words: Aristotelia chilensis, free radicals, antioxidant capacity.

INTRODUCCIÓN

Aristotelia chilensis (Molina) Stuntz (syn Cornus chilensis Molina) de la familia Elaeocarpaceae, es una especie nativa chilena, conocida popularmente como maqui. Es un árbol pequeño (hasta 4 m), siempre verde, que se distribuye desde la IV hasta la XI región de Chile. ]]> Esta especie es muy conocida por el uso que se le da a su fruto en alimentación, razón por la que ha sido muy poco estudiada para su uso en terapia. Sin embargo, los pueblos aborígenes utilizan sus hojas en forma de infusión, tanto en el tratamiento de diarreas, como en amigdalitis, faringitis y úlceras bucales.¹ Esto se apoya en hallazgos fitoquímicos que describen la presencia de polifenoles, como los flavonoides, en las hojas de A. chilensis.¹

Los compuestos fenólicos constituyen una gran familia de metabolitos secundarios con distintas características químicas y propiedades biológicas, sin embargo, comparten algunas de ellas; una de las más importantes es la de neutralizar la acción de radicales libres, que evita o retarda los procesos de lipoperoxidación y, consecuentemente, el daño celular.² Por esto, desde hace un tiempo se ha venido estudiando el impacto en la salud de la población, del consumo de alimentos y suplementos que los contienen; se ha observado una disminución en la mortalidad y morbilidad por causa de enfermedades degenerativas, sobre todo al nivel cardiovascular.^3,4

Estas observaciones se basan en antecedentes que indican que una disminución de antioxidantes plasmáticos favorece la peroxidación lipídica, lo cual contribuye a la disfunción endotelial presente en hipertensión e hipercolesterolemia; esta resulta el primer paso de la enfermedad aterosclerótica,⁵ además de estudios que muestran la correlación entre la incidencia de enfermedades degenerativas y las bajas concentraciones de antioxidantes plasmáticos.⁶

Se ha estimado que aproximadamente 2 % del oxígeno consumido por un organismo normal va a la formación de especies reactivas del oxígeno (EROs), de las cuales varias son radicales libres.⁷ Cuando la generación de EROs sobrepasa las defensas antioxidantes del organismo, sea cual sea el mecanismo (radiaciones UV, contaminación ambiental, ejercicio físico extenuante u otro), se produce daño por lesión química de las estructuras biológicas, proceso denominado estrés oxidativo,⁸ el cual está involucrado en el desarrollo de muchas enfermedades, como son la aterosclerosis y el cáncer.⁹

En cantidad, las principales especies reactivas del oxígeno que se generan durante la respiración celular son el anión superóxido (O₂^?-) y el peróxido de hidrógeno (H₂O₂), el que a su vez da origen al radical hidroxilo (OH^•). El anión superóxido y el radical hidroxilo son especies altamente reactivas pues poseen uno o más electrones desapareados, son capaces de provocar reacciones en cadena cuyo daño en las membranas celulares puede ser irreversible y llegar incluso hasta la muerte celular.¹⁰

El radical hidroxilo es quizás el más nocivo, dada su alta reactividad y corta vida media, por lo que es capaz de reaccionar con todo tipo de biomoléculas; las más vulnerables son los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), que sufren la pérdida de átomos de hidrógeno de sus grupos metilenos, se transforman asimismo en radicales lipoperóxidos que, si no son neutralizados, continuarán con el proceso. La producción de radicales hidroxilos, a través de la reacción de Fenton, está facilitada por metales de transición como Cu²⁺ y Fe²⁺, que catalizan esta reacción.¹¹

El objetivo del presente trabajo fue evaluar la capacidad antioxidante de extractos e infusión de hojas de A. chilensis, frente a radicales libres específicos, y la capacidad antioxidante en plasma humano después de la administración de infusión según el uso etnomédico.

MÉTODOS

]]> Se obtuvieron extractos de hojas secas de A. chilensis colectadas en el campus de la Universidad de Concepción en marzo de 2007. La especie se identificó en el Departamento de Botánica, Facultad de Ciencias Naturales y Oceanográficas de la Universidad de Concepción, por el doctor Roberto Rodríguez (CONC Nº 153285).

Las hojas se deshidrataron en seco y a la sombra (temperatura ambiente), se procesaron deshidratadas y se sometieron a molienda hasta obtener un tamaño de partícula de 0,5 cm.

Para la obtención de extractos se procesaron 50 g del material seco y molido en aparato Soxhlet,¹² con el uso de solventes de polaridad creciente: n-hexano, cloroformo, acetato de etilo y metanol (Merck, Darmstadt, Germany). Cada extracción, en relación solvente:muestra (6:1), se llevó a cabo hasta agotar el material vegetal, lo cual se determinó mediante la medición del contenido de sólidos en el extracto. Cada extracto se concentró en rotoevaporador y se llevó a sequedad en liofilizadora. Para cada extracto se determinó el rendimiento total en base seca y el contenido de fenoles totales expresados como equivalentes de ácido gálico (EAG) en los extractos obtenidos con acetato de etilo (EAE) y metanol (EME).¹³ Los resultados para estos parámetros se expresan a continuación: n-hexano (1,77 %), cloroformo (15,33 %), acetato de etilo (43,43 %; 0,292 mM EAG) y metanol (46,23 %; 0,043 mM EAG).

Los extractos se almacenaron en lugar seco, a temperatura ambiente y protegido de la luz hasta el momento de su utilización.

La infusión se preparó con 2 g de hojas secas y pulverizadas, se agregó sobre ellas 200 mL de agua a 100 °C por 5 min. El contenido de fenoles totales en la infusión fue de 0,074 mM EAG.

El 2,2´-azino-di-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonatodiamonio) (ABTS ^• Merck, Darmstadt, Germany) se disolvió en agua a una concentración de 7 mM y luego se oxidó con una solución de persulfato de potasio 2,45 mM; se mantuvo la mezcla en oscuridad durante 16 h. Luego, la mezcla oxidada se diluyó en etanol hasta alcanzar una absorbancia de 0,692 (absorbancia inicial). A 2 mL de esta solución se adicionaron 10 mL de los extractos (0,0327-0,0699 mM EAG) y de la infusión 1 %.

El decaimiento de la absorbancia se determinó en espectrofotómetro (Jasco, Japan) a 734 nm al cabo de 10 min de iniciada la reacción (absorbancia final). La curva de calibración se construyó utilizando ácido gálico como estándar y graficando los valores de delta absorbancia (diferencia entre absorbancia final e inicial) vs. concentración.¹⁴

El radical hidroxilo (OH^•) se generó en una mezcla de reacción que contenía 0,2 mM de ácido ascórbico, 0,2 mM de FeCl₃, 0,208 mM EDTA, 1 mM H₂O₂ y 0,56 mM desoxirribosa disueltos en PBS 20 mM, pH 7,4. A 900 mL de esta mezcla se le adicionaron 100 mL de los extractos (0,0327 y 0,0699 mM EAG) e infusión 1 %, la cual se incubó a 37 °C durante 1 h. La reacción colorimétrica se produjo luego de agregar 1 mL de ácido tiobarbitúrico 1 % (TBA, Sigma Mo, USA) en NAOH 0,05 M y 1 mL de ácido tricloroacético 2,8 %; la solución resultante se incubó por 30 min a 100 °C.

Las absorbancias luego de enfriadas las soluciones, se midieron a 532 nm (Jasco, Japan).

Para cuantificar la capacidad de estabilización (CERH) se utilizó la fórmula siguiente: % CERH = [(1 _ Abs muestra)/Abs blanco] x 100.^14,15 ]]> Las muestras biológicas se obtuvieron por venopunción en voluntarios sanos no fumadores y con índice de masa corporal dentro del rango normal para cada uno (n= 20), utilizando heparina como anticoagulante, antes y después de haber ingerido la infusión 1 % de hojas de A. chilensis. La infusión se administró 2 veces al día durante 3 d, siguiendo el normal hábito alimenticio.

Las muestras de sangre fueron centrifugadas a 2 600 rpm durante 15 min (Kubota, Japan). Obtenido el plasma se procedió a oxidarlo agregando 400 mL de CuSO₄ (5 mM) y completando a un volumen de 8 mL con PBS 10 mM a pH 7,4; para luego incubarlo a 37 °C por 24 h. La oxidación se detuvo con EDTA (5 mM) y BHT (40 mM). Las muestras fueron almacenadas a 4 °C y en oscuridad, hasta el momento de su utilización.¹⁶

El estado de oxidación de las muestras plasmáticas se monitoreó por la formación de dienos conjugados a 234 nm (Jasco, Japan) y sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARs), como sigue: se tomaron 500 mL de las muestras de plasma y se mezclaron con 1 mL del reactivo TBARS, incubando la mezcla a 100 °C durante 30 min. Luego de enfriadas en hielo y centrifugadas a 2 600 rpm por 15 min (Kubota, Japan), las absorbancias de los sobrenadantes se midieron a 532 nm (Jasco, Japan). Los resultados fueron expresados en términos de porcentaje de protección frente a la oxidación a las 24 h.¹⁷

Este estudio se llevó a cabo con la aceptación del Comité de Ética de la Universidad de Concepción, y se reclutaron a los voluntarios bajo consentimiento informado.

La variación estadística de los promedios se determinó usando la distribución normal y representadas por la desviación estándar (DE). Al comparar 2 valores, se establecieron los intervalos de confianza y se compararon los percentiles, usando la distribución t de Student (2 colas).

RESULTADOS

Los extractos obtenidos con solventes polares (EAE y EME), estabilizaron al radical ABTS^•; resultó más eficiente el extracto EAE (tabla 1).

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Este comportamiento, también se observó frente al radical OH^• (tabla 2).

La infusión de A. chilensis no tiene un efecto claro sobre la formación de dienos conjugados. De la totalidad de voluntarios sometidos al tratamiento (n= 20), en solo 6 disminuyó la formación de dienos conjugados para 21 % como promedio. En tanto, la formación de TBARs disminuyó en todos los voluntarios 30,27 % como promedio (fig.).

DISCUSIÓN

La literatura científica se refiere a los compuestos fenólicos como "antioxidantes que actúan con una variada gama de mecanismos".¹⁸ También se señala que los antioxidantes fenólicos son moléculas que en pequeñas concentraciones protegen a las biomoléculas (fosfolípidos, ácidos nucleicos) del daño provocado por radicales libres.¹⁹ Lo cierto es que la naturaleza de los radicales libres los hace muy reactivos, sin embargo los compuestos fenólicos son capaces, al colisionar con ellos, de cederles un electrón o un hidrógeno, estabilizándolos y evitando así el inicio o la propagación del daño oxidativo.²⁰

Mediante la donación de hidrógeno los compuestos fenólicos estabilizan radicales libres. Esto último se puede medir, entre otros métodos, a través del radical preformado ABTS^•, porque es un cromóforo que pierde su color al estabilizarse cuando una molécula antioxidante le cede un protón.²¹ La mayor actividad (9,52 mM EAG) a concentraciones menores (0,0327 mM EAG) la presentó el extracto EAE, lo que guarda relación con la mayor concentración de fenoles totales presentes en este extracto. Sin embargo, la mayor actividad se presenta a la concentración más baja estudiada (0,0327 mM EAG), lo que sugiere cierta competencia entre principios activos, o bien, una mejor "disposición" cinética de los principios activos que facilitaría su interacción con el radical. ]]> Las concentraciones de los extractos en estudio (0,0327 mM EAG y 0,0699 mM EAG), fueron definidas de acuerdo con las concentraciones plasmáticas de compuestos fenólicos encontradas en otros estudios.²²

La estabilización del radical hidroxilo, cuantifica la formación de un aducto entre ácido tiobarbitúrico y malondialdehído (MDA), este último es el producto final del proceso de lipoperoxidación in vivo.²³ La disminución del valor de absorbancia, frente a un blanco, significa una disminución de la producción de MDA.

Los resultados muestran que el extracto metanólico ejerció la mayor capacidad de estabilización del radical OH^•, pero sin mostrar diferencia significativa entre las 2 concentraciones evaluadas (40,6 % para 0,0327 mM EAG y 42,8 % para 0,0699 mM EAG). Mientras que en el extracto EAE se observó diferencia entre las concentraciones ensayadas,; la muestra de menor concentración presentó una mayor capacidad de estabilización (36,9 % para 0,0327 mM EAG frente a 18,1% para 0,0699 mM EAG). Otra explicación para este hecho podría ser la presencia de taninos que a esa concentración (0,0699 mM EAG), estén formando parte de un polímero que impide su interacción con el radical.²⁴

Sobre un total de 20 voluntarios sanos, se midió la capacidad antioxidante, antes y después de la administración de infusión (1 %) de hojas de A. chilensis, a través de la formación de dienos conjugados y el método TBARS en el plasma humano. La dosis fue la descrita por la etnomedicina para el tratamiento de distintos cuadros, es decir, la ingesta de infusión 1 % durante 3 d, teniendo en cuenta que dentro de los posibles efectos adversos, en tales condiciones, se encuentra el estreñimiento, por causa de la presencia de taninos. Ninguno de los voluntarios acusó este efecto u otros.

La formación de dienos conjugados se describe como el evento primario en el proceso de lipoperoxidación. El ataque inicial de un radical libre sobre el grupo metileno de un ácido graso poliinsaturado, tiene como consecuencia la pérdida de un átomo de hidrógeno, que transforma al PUFA en un radical lipídico. Los radicales lipídicos tienden a estabilizarse mediante un reordenamiento interno que da origen a la formación de dienos conjugados, los que son capaces aún de continuar el proceso de lipoperoxidación, reaccionando con oxígeno molecular para formar lipoperóxidos.³

La medición de dienos conjugados arrojó resultados que impiden dar una visión general acerca de la influencia de la infusión sobre la protección antioxidante plasmática.

En cambio, en términos porcentuales, el aumento promedio de la capacidad antioxidante a las 24 h observado por medio de TBARS fue de 30,27 %. Como la formación de dienos conjugados es la primera etapa del daño oxidativo en membranas biológicas y al hacer referencia a los resultados observados en TBARS, donde se midió el aumento de la capacidad antioxidante a las 24 h, luego de inducida la oxidación (37 ºC, Cu⁺²), se puede decir que la actividad antioxidante es clara sobre la etapa de propagación del daño oxidativo y no sobre la etapa de inducción.²⁵

Un aspecto importante de la interacción con las membranas biológicas, es el peso molecular de los flavonoides como la cantidad de grupos hidroxilos que poseen, los que permiten la formación de puentes de hidrógeno.²⁶ Una de las consecuencias de esta interacción tiene relación con la permeabilidad de las membranas, que podrían impedir el paso de radicales libres.

Uno de los aspectos que determinan la capacidad antioxidante en plasma humano es la genética, otros están relacionados con el tipo de alimentación, de modo que quienes acostumbran a consumir alimentos ricos en flavonoides y compuestos relacionados, tendrían una mayor defensa que quienes no los consumen o ingieren mayor cantidad de alimentos ricos en grasas. Aunque la alimentación no fue estandarizada en el estudio de intervención, un voluntario que tuvo un mínimo aumento de la capacidad antioxidante (5 %), comentó que dentro de su alimentación es habitual el consumo de té verde y frutas, lo que podría indicar, quizás de manera lógica, que la eficacia de la infusión de A. chilensis es mayor cuando el aporte de antioxidantes exógenos son menores. Además, esta persona fue la misma cuya formación de dienos conjugados aumentó en 48 % luego de la ingesta de la infusión, que mostró un claro efecto prooxidante. Entonces, lo antes expuesto sobre la alimentación y su influencia sobre la capacidad antioxidante solo es cierto en alguna medida, puesto que a altas dosis, los polifenoles pueden actuar como prooxidantes que producen radicales libres, mutagénicos e inhibidores de enzimas relacionadas con el metabolismo hormonal,²⁷ por lo que su consumo excesivo podría sobrepasar los beneficios que lleva un consumo moderado.

Los resultados aquí expuestos permiten aventurar el posible uso de A. chilensis como fuente natural de antioxidantes. Aspectos fundamentales como biodisponibilidad, metabolismo y toxicidad, entre otros, deben ser tratados en el futuro, de manera que aporten información para avalar estos resultados. ]]>

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Recibido: 8 de agosto de 2008.
Aprobado: 10 de octubre de 2008.

M. C. Marcia Avello Lorca. Facultad de Farmacia. Universidad de Concepción. Casilla 237. Concepción, Chile. Correo electrónico: maavello@udec.cl. ]]> 1 2001 15 2 2000 2ª 382-3, 673-6 3 1997 349 9053 9053 699 4 1979 1 8124 8124 1017-20 5 1998 1394 187-98 6 1996 273 5271 5271 59-63 7 1979 59 527-605 8 2003 133 3 3 933S-40S 9 1985 1-8 10 1998 30 11 11 1603-7 11 1992 307 108-12 12 1973 39 13 1998 46 10 10 4113-7 14 1998 46 2 2 363 15 1986 244 227-341 16 2005 4 2 2 33-9 17 1996 224 2 2 338-44 18 2000 48 4874-82 19 1990 9 1-32 20 2003 133 3275S-84S 21 1999 25 9/10 9/10 1231-7 22 1997 23 1978 75 7 7 3173-7 24 1989 55 1 1 1-8 25 2000 16 2 2 91-8 26 2005 12 19-25 27 2000 29 3-4 3-4 375-83