Caracterización cinética de un preparado semipurificado de bromelina para uso antitumoral
Kinetic characterization of a semipurified preparation from bromelain for antitumor use
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Carol CarvajalI; Margarita MárquezII; Aurora T. PérezIII; María de los A. ChávezIV; Martha HernándezV
IMáster en Ciencias. Especialista en Análisis. Laboratorio de Ingeniería Metabólica. Centro de Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila. Ciego de Ávila, Cuba.
IIMáster en Ciencias. Facultad de Biología. Universidad de La Habana. Ciudad de La Habana, Cuba.
IIIMáster en Ciencias. Aspirante a Investigadora. Laboratorio de Ingeniería Metabólica. Centro de Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila. Ciego de Ávila, Cuba.
IVDoctora en Ciencias Biológicas. Facultad de Biología. Universidad de La Habana. Ciudad de La Habana, Cuba. ]]>
VDoctora en Ciencias Biológicas. Investigadora Titular. Laboratorio de Ingeniería Metabólica. Centro de Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila. Ciego de Ávila, Cuba.
RESUMEN
INTRODUCCIÓN: la mayor parte de la producción mundial de enzimas está destinada a la obtención de proteasas. Las aplicaciones de estas biomoléculas con fines terapéuticos son muy variadas. Algunas se conocen como remedios naturales y otras son fármacos modificadores de la respuesta biológica. Las plantas de piña contienen varias cisteíno-proteasas, el componente mayoritario aislado del tallo es la "bromelina de tallo" (EC 3.4.22.32). En el campo de la salud se le atribuyen varias acciones entre las que se destaca la de inducir la diferenciación de células tumorales y atenuar el crecimiento del tumor.
OBJETIVOS: caracterizar cinéticamente un preparado semipurificado de bromelina obtenida por un procedimiento desarrollado en Cuba para ser evaluado en el campo de la salud.
MÉTODOS: el extracto crudo de bromelina, obtenido a partir de tallos de plantas adultas de Ananas comosus (L.) Merr. cv. Española roja (piña) se purificó por cromatografía de intercambio iónico en carboximetilcelulosa-52 en un sistema semibach.
RESULTADOS: la caracterización cinética del extracto purificado permitió comprobar la existencia de un preparado activo y estable con una actividad específica de 0,94 U/mg de proteínas (2,34 veces superior a la del extracto crudo original), con una fracción proteica mayoritaria de masa molar 24 500 Da y un punto isoeléctrico, localizado en la zona de pH básico (9,55). Tiene pH óptimo 6,8 al utilizar hemoglobina 2 % como sustrato a 37 °C y una estabilidad en función del pH y de la temperatura aceptable. Si se conserva liofilizado a - 20 °C mantiene 80 % de la actividad durante 1 año.
CONCLUSIONES: la cromatografía de intercambio iónico en carboximetilcelulosa-52 posibilitó la obtención de un preparado semipurificado de bromelina, con una actividad específica superior a la del extracto original que puede ser utilizado en la medicina como antitumoral.
INTRODUCTION: most of the world production of enzymes is devoted to proteases obtaining. Applications of these biomolecules for therapeutical objectives are very varied. Some are known as natural remedies and other are drugs modifying the biological response. Pineapple plants contain some cysteine-proteases, the majority component isolated from stem is the "stem Bromelain" (EC 3.4.22.32). In the health field it has attributed some actions including the differentiation induction of tumor cells and attenuation of tumor growth.
OBJECTIVES: to characterize kinetically a semipurified preparation from Bromelain obtained by a procedure developed in Cuba to be assessed in the health field.
METHODS: the crude extract from Bromelain obtained from the adult plant stems of Ananas comosus (L.) Merr. Cv. Spanish red (pineapple) was purified by ion-exchange chromatography in carboxylmethylcelulose-52 in semibatch system.
RESULTS: kinetic characterization of purified extract allowed us to verify the existence of a stable and active preparation with a specific activity of 0,94 U/mg of proteins (2,34 times superior to that of original crude extract) with a protein fraction in the main of molar mass 24 500 Da and a isoelectric point, located in the basic pH zone (9,55). It has a 6,8optimal pH using the 2% hemoglobin as substrate at 37ºC and stability depending on pH and on acceptable temperature. If it is preserved lyophilized at 20 ºC it maintains the 80% of activity for a year.
CONCLUSIONS: the ion-exchange chromatography in carboxyl methylcellulose-52 allowed the achievement of semipurified preparation from Bromelain with a specific activity higher to that of original extract that may to be used in medicine as antitumor agent.
Key words: cysteine-proteases, Bromelain, Ananas comosus.
INTRODUCCIÓN ]]>
Las enzimas proteolíticas catalizan la hidrólisis de los enlaces peptídicos de proteínas. Participan en variados procesos fisiológicos, al estar involucradas en todo el ciclo de vida de las proteínas desde su biosíntesis, control de destino y activación, hasta su degradación (recambio proteico); además de otras funciones claves como la de facilitar el transporte de sistemas voluminosos en el organismo.1 Se afirma que actualmente las peptidasas constituyen uno de los tipos enzimáticos mejor caracterizados.
La producción mundial de peptidasas representa 38 % del total de enzimas obtenidas; si a esto se adiciona la producción de renina (10 - 15 %) y otras como la papaína, se concluye que en la actualidad la mayor parte de la producción de enzimas está destinada a la obtención de proteasas.2 Las aplicaciones de estas biomoléculas con fines terapéuticas son extraordinariamente variadas. Algunas (sobre todo combinadas) se reconocen como remedios naturales, otras están incluidas entre los fármacos modificadores de la de la respuesta biológica.3
La piña se utilizó como planta medicinal por varias culturas nativas. La bromelina (EC 3.4.22.32) se extrajo por primera vez del jugo de la fruta a finales del siglo XIX y se introdujo como suplemento terapéutico a mediados del siglo XX. Es una cisteíno-proteasa, aislada y purificada a partir de diferentes órganos de plantas de la familia Bromeliaceae, desempeña un papel fisiológico importante al intervenir en reacciones metabólicas y proteger al vegetal del ataque de plagas y enfermedades.4 Tiene varias acciones farmacológicas: aumenta la absorción de otros medicamentos, inhibe la agregación plaquetaria, se emplea como digestivo, antiinflamatorio y en la formulación de vacunas. 5-7 Por otra parte, se demostró que la proteasa induce la diferenciación de células tumorales y atenúa el crecimiento del tumor. Este hecho ha despertado el interés de muchos investigadores, que han demostrado que aumenta la resistencia al cáncer de piel inducido por radiaciones ultravioletas, favorece la diferenciación celular de tres tipos de leucemia y se le atribuye actividad antimetastizante.8-10
Relacionado con estos hallazgos, se ha informado que la bromelina induce la producción de citoquinas en células sanguíneas mononucleares periféricas, tiene acción sinérgica con los interferones a y g e incrementa los niveles del factor de necrosis tumoral a y las interleucinas 1, 2 y 12, lo que son premisas para explicar su probable mecanismo de actividad antitumoral.11-13 Estos estudios conducen al desarrollo de nuevos procedimientos de aislamiento y purificación de la enzima, que permitan potenciar su uso en la medicina.
La enzima tiene amplio espectro de utilización, pero necesita profundizar en las potencialidades terapéuticas para extender su uso en el campo de la salud. La producción nacional de bromelina en Cuba a partir de fuentes naturales constituye una alternativa que permite profundizar en los estudios de sus potencialidades terapéuticas, para formular nuevos productos de uso médico. El presente trabajo experimental se realizó con el objetivo de caracterizar cinéticamente un preparado semipurificado de bromelina, obtenida por un procedimiento desarrollado en Cuba para ser evaluado en el campo de la salud.
MÉTODOS
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Las investigaciones se realizaron en el Centro de Bioplantas (UNICA-MES, Ciego de Ávila, Cuba) y el Centro de Estudios de Proteínas de la Facultad de Biología (UH-MES, Ciudad de La Habana, Cuba).En los experimentos se utilizaron reactivos de grado analítico SIGMA. El material cromatográfico usado fue carboximetilcelulosa-52 (CMC-52, Whatman). La molécula aislada se comparó con un patrón de bromelina pura (SIGMA, B 5144, 5-10 mg/mL). El tratamiento estadístico se realizó con el empleo del utilitario Statistical Package for Social Sciences (SPSS, versión 8.0).
Material biológico: se utilizó como fuente de obtención de bromelina, plantas adultas de Ananas comosus (L.) Merr cv. Española roja (piña) después de su tercera cosecha. Se usaron tallos provenientes de la estación experimental "Juan Tomás Roig" de la Universidad de Ciego de Ávila.
Procedimiento de extracción: se utilizó el procedimiento descrito por Hernández y otros.14 El material vegetal (500 g) fragmentado se molió y homogeneizó en medio ácido a 4 °C, con la adición de sulfuro de sodio. La proporción utilizada de tampón de extracción fue 1:1,5 (m/v). Luego de filtrar el homogenado, el líquido remanente se centrifugó a 12 000 g durante 15 min. Se cuantificó el sobrenadante (extracto crudo) y se llevó a sequedad por liofilización. Se determinó la concentración de proteínas y la actividad enzimática.
Purificación de la bromelina de tallo
Cromatografía de intercambio iónico en CMC-52: el extracto crudo se dializó en tampón acetato de sodio (NaAc 0,005 M, pH 5) en membranas pretratadas Spectra/Por, MWCO (12000 - 14000). Para purificar la proteína mayoritaria se utilizó carboximetilcelulosa-52 como soporte cromatográfico equilibrada en tampón NaAc 0,005 mol/L, pH 5; 100 mL de extracto se añadieron a 20 g de soporte y se mezcló durante 30 min, tiempo al cual se filtró a vacío. El soporte con la enzima se utilizó en una columna (1,5 x 5 cm) que fue eluida con NaAc 0,5 mol/L, pH 5). Se colectaron fracciones de 2 mL. A los máximos de absorbancia a 280 nm se les determinó actividad enzimática y se colectaron los picos más activos obtenidos de más de 50 corridas cromatográficas que fueron utilizadas para la caracterización. El rendimiento (R en %) para cada etapa se calculó a partir de la actividad enzimática (AE) total. Para la determinación del grado de purificación (GP en veces) se tuvo en cuenta las veces que se incrementó la actividad específica en relación con la primera etapa.
Caracterización del preparado semipurificado: los picos procedentes de más de 50 purificaciones se homogeneizaron, el producto se caracterizó cinética y funcionalmente. ]]>
Concentración de proteínas (CP): se cuantificó por el método de Lowry y otros15 y se expresó en mg/mL o mg/kg de masa fresca referidos a una curva patrón de albúmina de suero bovino.Actividad enzimática (AE): se determinó por el método de Anson16 y se expresó en U/mL o U/kg de masa fresca. Se empleó como sustrato hemoglobina desnaturalizada al 2 %, pH 6,8. Una unidad (U) de AE se define como la cantidad de enzima que cataliza la formación de 1µmol de tirosina por minuto a 37 °C y pH 6,8.
Cálculo de la actividad proteolítica
La actividad enzimática se calculó por la fórmula siguiente:
AE = A650 nm/t · cot tirosina · K · 1/Ve · dil ]]>
Donde, AE es la actividad enzimática (U/mL), t es el tiempo de reacción, K es una constante de dilución (VT/VS) que relaciona el volumen total de ensayo (1,6 mL) y el volumen que reacciona en medio alcalino con reactivo de Folin-Ciocalteau (0,5 mL), Ve es el volumen de enzima (0,1 mL) y dil la dilución de la enzima.
Actividad específica: la actividad específica (A Esp) se calculó como el cociente de la actividad enzimática entre la concentración de proteínas (AE/CP) y se expresó en U/mg de proteínas.
Actividad en función del tiempo: se evaluó la hidrólisis de hemoglobina (Hb) al 2 %, pH 6,8 y 37 °C catalizada por la enzima durante 5, 10, 15, 20, 25 y 30 min. Se determinó la AE en cada tiempo y se correlacionó la velocidad de reacción medida con el tiempo y la concentración de enzima para garantizar que el resto de los experimentos se realizaran a velocidad inicial (vo).
Actividad en función de la concentración de enzima: se prepararon 6 diluciones de la enzima y se determinó la AE frente a la Hb al 2 %, pH 6,8 y 37 °C durante 20 min.
pH óptimo: se evaluó la actividad del preparado purificado frente a Hb (2 %, 37 oC) a valores de pH 2, 3, 4, 5, 6, 6.8, 7, 8, 9 y 10. Se correlacionó la actividad específica para cada pH.
Temperatura óptima: los valores de temperatura óptima para la de hidrólisis de Hb (2 %, pH 6,8) se obtuvieron al incubar la mezcla de reacción por 20 min a 5, 10, 15, 20, 25, 30, 37, 40, 50, 60 y 70 °C.
Estabilidad en función del pH: se ajustó el pH del producto a valores de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. Se determinó la AE frente a Hb (2 %, pH 6,8, 37 °C, 20 min) cada 15 min para cada valor de pH por 1 h.
Estabilidad térmica: el producto purificado se incubó a 30, 37, 40, 50, 60 y 70 °C. Se determinó la AE frente a hemoglobina (2 %, pH 6,8, 37 °C, 20 min), cada 15 min para cada temperatura durante 1 h. ]]>
Estabilidad del preparado purificado en el tiempo: lotes de bromelina semipurificada se conservaron a -20 °C durante 1 año y se estudió el comportamiento de la actividad específica en el tiempo. Muestras representativas de cada lote se analizaron cada mes.Estabilidad en suspensión del extracto purificado de bromelina: el producto liofilizado se disolvió en agua destilada, se conservó a 5 °C y se analizó el comportamiento de la actividad específica en el tiempo por 12 h.
Análisis electroforético: la masa molar de la proteína se estimó por el método de Andrew17 en geles de Sephadex G-100 y por electroforesis bidimensional de proteínas, utilizando como referencia patrones de masa molar conocida y el punto isoeléctrico (pI) de la fracción proteica de la preparación parcialmente purificada se determinó por isoelectroenfoque (IEF).
RESULTADOS
En la figura 1 aparece un cromatograma típico de las corridas cromatográficas y en la tabla los rendimientos correspondientes. Se colectó un pico mayoritario 2,34 veces más puro que el extracto de partida, con rendimientos en términos de actividad del orden de 40 %.
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Tabla. Rendimientos de la purificación del extracto crudo de bromelina por cromatografía de intercambio iónico| Etapas | Volumen | Concentración | Peso total ]]> (mg) | Actividad enzimática | Actividad enzimática | Actividad específica (U/mg) | Rendimiento | Grado de purificación |
| Extracto | ]]> 100 | 5,29 | 529,0 | 2,10 | 210,0 | 0,40 | 100 | 1 |
| CMC-52 | 20 | ]]> 3,86 | 77,2 | 3,60 | 72,0 | 0,94 | 34,3 | 2,34 |
Este proceso es muy ventajoso para la purificación de proteínas en etapas tempranas e intermedias, por su alta capacidad de procesamiento de muestra y posibilidades de ser utilizada en sistemas batch y semi-batch, fácilmente escalables, lo que determinó su selección para los estudios de aplicabilidad del producto en la terapéutica.
Caracterización cinética del preparado semipurificado ]]>
Los picos procedentes de más de 20 purificaciones por cromatografía de intercambio iónico en CMC-52 se homogeneizaron para su caracterización cinética y funcional.
Actividad específica del preparado semipurificado
El producto obtenido tiene una concentración de proteínas de 3,86 ± 0,05 mg/mL. La actividad enzimática es de 3,6 ± 0,03 U/mL y la actividad específica 0,94 ± 0,03 U/mg de proteínas. El preparado purificado es 2,34 veces más puro que el extracto crudo de tallos.
Actividad en función del tiempo y de la concentración de enzima
Para las concentraciones de proteínas analizadas (0,4 y 0,8 mg/mL), se observó que la velocidad de formación de productos tiende a decrecer en la medida en que la reacción procede. Con los resultados de este estudio se establecieron las condiciones de los ensayos cinéticos, de manera que se garantizó trabajar en zona de velocidad inicial (Vo). Se establecieron las concentraciones de enzima adecuada (0,02 a 0,40 mg/mL) para realizar el resto de los experimentos en la zona de velocidad inicial, utilizando como sustrato hemoglobina al 2 %.
pH óptimo
Al establecer el perfil de actividad específica en función del pH (Fig. 2), se comprobó que al realizar la reacción a 37 ºC, durante 20 min, el pH óptimo del producto parcialmente purificado es 7 si se utiliza Hb desnaturalizada 2 %. El preparado enzimático fue menos activo a valores de pH ligeramente ácidos. No se observaron diferencias significativas al conducir la reacción a pH 6,8 o 7. Este comportamiento puede estar relacionado con la distribución de cargas y la protección del centro activo de la enzima al pH del preparado purificado. ]]>
Temperatura óptima
En la figura 3 aparece el perfil de actividad específica de bromelina purificada en función de la temperatura, los mejores resultados se obtienen a 40 °C. Esta, por tanto, representa la temperatura óptima en las condiciones experimentales del ensayo durante un tiempo de 20 min.
Estabilidad en función del pH
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El pH influyó significativamente en la estabilidad funcional de la bromelina, los estudios de estabilidad del producto en función del pH permitieron ratificar que la enzima es más estable a valores de pH cercano al fisiológico (pH 4 y 5, donde conserva 100 % de la actividad al cabo de 1 h), a pH 2 y 10 la enzima pierde 92 % de actividad en 1 h (Fig. 4).
Estabilidad térmica
La variación de la actividad proteolítica en el tiempo al incubar el producto a diferentes temperaturas aparece en la figura 5. La temperatura influye considerablemente en la estabilidad del preparado enzimático. La bromelina mostró estabilidad, incubada por 1 h, hasta 50 °C; pero a 70 y 80 °C en los primeros 40 min pierde aproximadamente 90 % de la actividad y se observa una precipitación total de la proteína.
Estabilidad del preparado purificado en el tiempo
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La conservación en el tiempo de las enzimas sin pérdida de actividad es muchas veces un problema. Para prevenir pérdidas de actividad, las muestras deben congelarse a muy bajas temperaturas (- 20 o - 40 °C). La evaluación de la estabilidad en el tiempo de lotes liofilizados de bromelina purificada por CII, aparece en la figura 6. El preparado purificado de bromelina mostró un mantenimiento aceptable de la actividad específica en el tiempo de conservación. Durante los primeros 6 meses mantuvo más de 95 % de la actividad inicial y 80 % en el año.
Estabilidad en suspensión del extracto purificado de bromelina
Se estudió la variación de la actividad específica en el tiempo de muestras de producto liofilizado, disueltas en agua destilada (Fig. 7). La variación de actividad específica (U/mg de proteína) en el tiempo, de bromelina liofilizada y purificada y disuelta en agua destilada, tuvo un comportamiento cuadrático decreciente en las primeras 12 h. Estos resultados son de interés desde el punto de vista práctico, porque permiten hacer una aplicación correcta de las dosis del producto en el tiempo.
Análisis electroforéticos
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Al analizar el producto parcialmente purificado y comparado con bromelina SIGMA, se observó una banda mayoritaria con similar movilidad electroforética, cercana a los 25 000 Da (Fig. 8).
Se realizaron estudios de focalización isoeléctrica y electroforesis 2D (Fig. 9). El pico de mayor pureza mostró una banda única en la zona de pH básico. El punto isoeléctrico (pI) fue de 9,55.
DISCUSIÓN
Los sistemas de purificación batch y semi-batch ofrecen simplicidad, factibilidad de escalado, alta capacidad de procesamiento de muestra, y reproducibilidad del procedimiento cromatográfico. El preparado obtenido por cromatografía de intercambio iónico es un producto heterógeneo en actividades proteolíticas, con una actividad específica alta y comparable con la de otros preparados utilizados en la terapeútica (0,5 U/mg).18
En cuanto a la temperatura óptima, los resultados concuerdan con lo descrito en la literatura acerca de que las proteínas son menos estables en la medida en que se purifican.19 Esto está relacionado con el efecto protector de proteínas contaminantes y otros componentes presentes en las preparaciones crudas. La influencia de la temperatura en el mantenimiento de la estructura tridimensional y el dominio funcional de las enzimas ha sido discutida en la literatura.20 ]]>
El secado a temperatura ambiente usualmente provoca la inactivación completa de la enzima, pero el secado de soluciones congeladas a alto vacío y temperaturas bajas (liofilización) es un método recomendable, que frecuentemente rinde un polvo soluble y activo.21 El resultado obtenido en esta investigación resulta satisfactorio teniendo en cuenta que se han informado pérdidas de hasta 40 % por año.18Desde que se realizaron los primeros aislamientos de bromelina, la masa molar ha sido muy estudiada y se han informado resultados contradictorios en dependencia del grado de pureza del extracto. La determinación de la masa molar por espectroscopia de masa mostró un valor de 24 500 Da.21 Este valor coincide con la masa molar determinada por electroforesis bidimensional en este estudio. La masa molar y el punto isoeléctrico también coinciden con los descritos para esta enzima.22,23 Esta identificación constituye un control de calidad de los preparados enzimáticos, lo que demuestra sus potencialidades de uso en la industria y la biomedicina.
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Recibido: 15 de enero de 2008.
Aprobado: 30 de mayo de 2010.
MSc. Carol Carvajal. Laboratorio de Ingeniería Metabólica. Centro de Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila. Carretera a Morón Km. 9. Ciego de Ávila, Cuba. Teléf.: 053-33 224016, Fax: 053-33 266340. Correo electrónico: ccarvajal@bioplantas.cu ]]>
