ARTÍCULO ORIGINAL
Actividad antibacteriana y citotoxicidad in vivo de extractos etanólicos de Bauhinia variegata L. (Fabaceae)
Antibacterial activity and in vivo cytotoxicity of ethanol extracts from Bauhinia variegata L. (Fabaceae)
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MSc. Maby M. Martínez, MSc. Diana M. Ocampo, BSc. Jhon H. Galvis, Andrea ValenciaUniversidad de Caldas, A. A. 275. Manizales, Colombia.
Introducción: diversas investigaciones han identificado el potencial biológico de diferentes compuestos como flavonoides, taninos, esteroides, naftoquinonas y sesquiterpenoides presentes en el género Bauhinia. Se ha reportado para la especie Bauhinia variegata la presencia de flavonoides con propiedades antidiabéticas y antivirales; sin embargo, el estudio del potencial antibacterial y citotóxico in vivo es incipiente, tanto para compuestos de flavonoides como de alcaloides.
Objetivo: determinar la actividad antibacteriana y citotóxica in vivo de los extractos alcaloidales de Bauhinia variegata L.
Métodos: se aplicó cromatografía de columna para la extracción y el aislamiento de los alcaloides presentes en las hojas de B. variegata. Extractos y fracciones alcaloidales se evaluaron para determinar el potencial citotóxico por medio del bioensayo sobre "camarones de mar" (Artemia salina) y el potencial antibacterial sobre Escherichia coli por medio del método de difusión en disco (antibiograma por difusión).
Resultados: se obtuvieron 6 compuestos depurados, a los cuales se les determinó la presencia del núcleo protoberberinico según espectrofotometría ultravioleta. En relación con el bioensayo sobre Artemia salina, el extracto crudo mostró menor toxicidad (CL50> 1 000 µg/mL), mientras que la fracción de los alcaloides totales y el compuesto CD1 mostró alta toxicidad (CL50< 500 µg/mL); contrario a lo evidenciado para el bioensayo antimicrobiano, porque no se presentaron halos de inhibición para los tratamientos con los extractos y compuestos utilizados.
Conclusiones: la actividad citotóxica reportada se debe al efecto sinérgico del conjunto de metabolitos secundarios que pudieron evidenciarse en la planta y a los cuales también se les reconoce esta actividad (alcaloides y terpenos), que explica así la toxicidad mostrada por la fracción de los alcaloides totales.
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Palabras clave: alcaloides, Artemia salina, Bauhinia, citotoxicidad, Escherichia coli.Introduction: several research studies have identified the biological potential of different compounds such as flavonoids, tannins, steroids, naphtoquinones and sesquiterpenoid present in the genus Bauhinia. It has been reported for the species B. variegata the presence of flavonoids with anti-diabetic and antiviral properties, but the study of antibiotic and cytotoxic potential is just incipient for both flavonoid and alkaloid compounds.
Objective: to determine the antibacterial and in vivo cytotoxic activity of alkaloid extracts from Bauhinia variegata L.
Methods: column chromatography for extraction and isolation of alkaloids in B. variegata.leaves was performed. Alkaloid extracts and fractions were tested through bioassay for their cytotoxic potential on "brine shrimp" (Artemia salina) and the antibacterial potential on Escherichia coli through the disk diffusion method (antibiogram by diffusion).
Results: six compounds were purified and measured the presence of the protoberberinic nucleus by means of UV spectrophotometry. Regarding Artemia salina bioassay, the crude extract (CE) showed less toxicity (LC50> 1000 µg/mL), whereas the fraction of the total alkaloid fraction (TA) and the CD1 compound showed high toxicity (LC50< 500 µg/mL). Unlike the evidence for the antimicrobial bioassay, no inhibition zones for treatment with the extracts and the compounds appeared.
Conclusions: the reported cytotoxic activity is caused by the synergistic effect of all secondary metabolites that could occur in the plant, which were also associated with this activity (alkaloids and terpenes) that account for the toxicity shown by the total alkaloid fraction.
Key words: alkaloids, Artemia salina, Bauhinia, cytotoxicity, Escherichia coli.
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INTRODUCCIÓN
En países como Colombia, poseedores de una alta biodiversidad, resulta especialmente importante el estudio de las plantas, extractos o sustancias puras que presentan significativa actividad terapéutica. Dentro de las múltiples estrategias que se pueden utilizar para la selección de especies vegetales como fuentes de principios activos, el estudio de la letalidad que producen los extractos sobre larvas de Artemia salina, ha demostrado ser útil para estos propósitos.1,2
Desde 1982 se han venido desarrollando bioensayos para la determinación de la citotoxicidad in vivo con la utilización de "camarones de mar" (Artemia salina); los cuales son utilizados como vía inicial de tamizaje citotóxico in vivo de extractos, fracciones y compuestos depurados, con el fin de discriminar aquellas muestras de elevada toxicidad, debido a que presenta buena correlación con la citotoxicidad in vitro. Además de esta actividad tóxica a nivel celular, se presenta la exploración de la actividad antimicrobiana, debido a la facilidad de detección de este potencial, mediante la observación de la respuesta al crecimiento o inhibición de varios microorganismos a tejidos o extractos de plantas puestos en contacto con ellos;3 principalmente sobre Escherichia coli, la cual está presente en grandes concentraciones en la microflora intestinal normal de las personas y animales, donde, por lo general, es inocua. Sin embargo, en otras partes del cuerpo puede causar enfermedades graves como infecciones en vías urinarias y del aparato excretor, cistitis, meningitis, peritonitis, mastitis, septicemia y neumonía gramnegativa.4-6 De acuerdo con lo anteriormente expuesto, estos métodos son los más adecuados para poner en manifiesto metabolitos secundarios relacionados con actividades biológicas interesantes.7
La familia Fabaceae se caracteriza por la presencia de numerosas sustancias bioactivas de diversa naturaleza química en corteza, hojas y raíz. De esta familia se han caracterizado y reportado alcaloides, flavonoides y polifenoles. La bioactividad de este tipo de metabolitos de plantas está asociada a su efecto antidiabético,8-13 antiinflamatorio14 y antimicrobiano.15 Entre las especies más estudiadas fitoquímicamente, se pueden citar Bauhinia manca,16 Bauhinia candicans,17 Bauhinia uruguayensis,18 Bauhinia purpurea ,19 Bauhinia forficata20 y Bauhinia splendens.21 En este género hay una mayor variedad de compuestos como esteroides, terpenoides y flavonoides. Sin embargo, aunque muchos compuestos son conocidos, se sabe poco sobre la actividad farmacológica de la mayoría de las sustancias aisladas del género Bauhinia.22
La especie Bauhinia variegata L. (Fabaceae), conocida comúnmente como "casco de buey", "casco de vaca" o "mororó", es la más utilizada en la medicina tradicional como un "remedio" para el tratamiento de la diabetes.23 Sin embargo, B. variegata presenta escasos reportes en la literatura, desde el punto de vista citotóxico y antibacterial; por esta razón fue seleccionada de la información etnobotánica, con el fin de determinar la bioactividad de los extractos etanólicos foliares sobre Artemia salina y Escherichia coli.
MÉTODOS
Colección del material vegetal ]]>
Las hojas de B. variegata se colectaron en el municipio Manizales, departamento Caldas, Colombia; un ejemplar reposa en el herbario adscrito a la Facultad de Agronomía de la Universidad de Caldas (FAUC) bajo el número 20601. Las hojas se secaron a temperatura ambiente durante 48 h; posterior a ello, fueron molidas, con el fin de realizar extracciones sucesivas con etanol 96 % mediante el método de maceración en frío, esta percolación se llevó a cabo hasta que se obtuvieron filtrados incoloros. Al extracto etanólico se le realizó un desengrase con hexano y luego se realizó la extracción clásica de alcaloides totales, donde el extracto se disuelve en HCl 3 %, con el fin de obtener los alcaloides totales (AT) en forma de sales y, luego, extraerlos puros en medio básico con diclorometano.24 Estas sales fueron monitoreadas por cromatografía de capa fina (CCF), reactivo de Dragendorff y lámpara de luz UV, y fraccionadas utilizando cromatografía de columna (CC), con el empleo de sílica gel como fase estacionaria y un sistema binario de solventes como fase móvil (MeOH/AcOET).
Ensayos de actividad biológica
Determinación citotóxica de los extractos y compuestos depurados aislados de Bauhinia variegata utilizando como organismo de ensayo Artemia salina
El potencial citotóxico in vivo de los extractos se determinó mediante la evaluación de su toxicidad para el crustáceo Artemia salina. Los extractos se consideraron activos cuando presentaron concentraciones letales medias (CL50) menores a 1 000 µg/mL. La selección del bioensayo se realizó, considerando que en repetidas ocasiones se ha encontrado una correlación entre la presencia de alcaloides citotóxicos y la toxicidad mostrada frente al crustáceo por los extractos crudos.25
Protocolo experimental para la preparación de bioensayos de citotoxicidad con Artemia salina
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Los huevos de Artemia salina se incubaron en solución de sal marina en presencia de luz artificial y a temperatura ambiente durante 48 h. Las muestras se evaluaron a concentraciones de 1000, 500 y 250 µg/mL, solubilizadas en etanol, el cual se dejó durante 24 h a temperatura ambiente para su evaporación; posterior a ello la goma se solubilizó en solución de sal marina (en todos los casos los ensayos se efectuaron por triplicado). A cada tubo se le agregaron 10 organismos ("nauplii") y se incubaron a temperatura ambiente por 24 h, se realizó un monitoreo cada 4, 6, 8, 12 y 24 h. Como control se usó la solución de sal marina, sin los extractos/fracciones/compuestos depurados, con 10 individuos. Al cabo de ese tiempo se contabilizaron los organismos vivos y por diferencia se determinó el porcentaje de mortalidad. El cálculo de la concentración de extracto que provoca la muerte de 50 % de los organismos (CL50) y su intervalo de confianza de 95 % se efectuó por medio del método estadístico Probit.26
Actividad antibacteriana sobre Escherichia coli
El ensayo de actividad antibacterial se efectuó por el método de antibiograma por difusión o difusión en disco de papel filtro Whatman® (6 mm de diámetro; 0,6 mm de espesor) en agar Müeller-Hinton para la valoración de los halos de inhibición de E. coli;27-32 previamente se realizó la estandarización de la turbidez para la preparación del inoculo por medio del estándar de 0,5 McFarland,33 con la finalidad de obtener una suspensión de 1 a 2 × 108 UFC/mL. Los discos se impregnaron con las diluciones etanólicas de los extractos y compuestos depurados a concentraciones de 1 000, 500 y 250 µg/mL, incubados a 37 ºC durante 48 h en cajas de petri.34,35 Como control se utilizó sultamicilina (ampicilina/sulbactán; 1 000 µg/mL). En todos los casos los ensayos se efectuaron por triplicado. Se midió el diámetro (mm) de todos los halos de inhibición, para comparar el efecto de los extractos con el medicamento utilizado como control y así determinar los puntos de corte, basados en los criterios del European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), documento Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters version 1.3,36 para identificar la sensibilidad o resistencia del microorganismo frente a los tratamientos.
RESULTADOS
Del extracto etanólico de las hojas de Bauhinia variegata se identificaron aquellos alcaloides de los cuales se disponía de la cantidad necesaria (CD1 y CD7), por medio de espectrofotometría UV; que evidencia máximos de absorción hacia 225 y 280 nm y entre 250 y 260 nm; además de un pico pronunciado hacia 650 y 700 nm (Fig. A y B), característico de sistemas protoberberínicos;37 igualmente, el compuesto CD1 se caracterizó por presentar puntos de fusión entre 250 y 260 ºC. ]]>
Actividad biológica
Los datos reportados en el bioensayo de citotoxicidad in vivo, el cual se efectuó para el extracto crudo (EC), la fracción de los alcaloides totales (AT) y el compuesto CD1, demostraron que el AT y CD1 presentaron niveles altos de toxicidad, 129,96 µg/mL y 302,37 µg/mL, respectivamente; esta toxicidad se atribuye a que las CL50 se mantuvieron entre 100 y 500 µg/mL. Para el EC evaluado, se evidenció menor número de individuos muertos, además de presentar valores en la CL50 mayores que la máxima concentración evaluada (tabla 1). Con respecto a la evaluación antibacterial, no se evidenció actividad antibiótica para los tratamientos con EC, AT y D6, debido a que no presentaron diámetros de inhibición; el compuesto D3 presentó un diámetro menor que 14 mm y el compuesto D5 un diámetro cercano a 14 mm en la máxima concentración evaluada (13 mm/1 000 µg/mL). Esto lo hace un candidato promisorio para futuras investigaciones, utilizándolo con un mayor grado de purificación. Aunque se evidenció este punto de corte aproximado al límite de la susceptibilidad, se evidencia la resistencia del microorganismo a estos compuestos (tabla 2).
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DISCUSIÓN
El uso medicinal de las plantas del género Bauhinia por la población en diferentes partes del mundo ha encontrado apoyo en los estudios científicos que demuestran la eficacia de estas plantas en diferentes modelos experimentales. En este contexto, algunos efectos biológicos o farmacológicos, como antimicótico, antibacterial, analgésico, antiinflamatorio y sobre todo antidiabético, son reportados en la literatura, lo que confirma y justifica el uso de estas especies en la medicina popular. Aunque muchos compuestos, incluidos los alcaloides, terpenos, esteroides y flavonoides, se han aislado e identificado en estas especies, hay pocos estudios que se relacionan con los efectos biológicos de tipo citotóxico, sobre todo de los compuestos de tipo alcaloidal.
De acuerdo con lo anterior, se evidenció un potencial farmacológico de tipo citotóxico de los alcaloides aislados; este efecto se atribuye al núcleo protoberberínico identificado por medio de la espectrofotometría UV, el cual está presente en los extractos y fracciones sometidos a los ensayos. Aunque los compuestos de este núcleo han sido empleados en los tratamientos para la tumefacción esplénica, malaria y leishmaniosis cutánea; además de tener propiedades antibacterianas y antimicóticas,38-41 no se evidenció el potencial antibacterial debido quizá a la purificación parcial de los compuestos utilizados en los bioensayos.
La bioactividad reportada por la etnobotánica colombiana para esta especie, podría fundamentarse no solo en los diferentes mecanismos ejercidos por los compuestos fenólicos (flavonoides, taninos y quinonas), sino además por efecto sinérgico del conjunto de metabolitos secundarios que pudieron evidenciarse en la planta y a los cuales también se les reconoce esta actividad (alcaloides, terpenos), lo cual explica la alta toxicidad mostrada por la fracción de los alcaloides totales.
Los resultados permiten concluir que en las hojas de Bauhinia variegata se encuentran metabolitos de tipo alcaloidal que poseen propiedades farmacológicas de tipo citotóxico; por lo cual, se hace necesario continuar estudiando estos principios activos que permitan determinar las propiedades antitumorales de esos compuestos. Asímismo, es importante continuar estudios para determinar la actividad antiparasitaria de los compuestos alcaloidales (leishmaniosis, malaria y enfermedad de chagas), utilizando sistemas in vitro con células no tumorales como son los cultivos primarios de macrófagos humanos o de hámster.
AGRADECIMIENTOS
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Los autores agradecen a la Universidad de Caldas. La asistencia técnica de Gerardo Herrera del Laboratorio de Bioquímica de la Universidad de Caldas es también apreciada.
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Recibido: 11 de mayo de 2011. ]]> Aprobado: 8 de agosto de 2011.
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