ARTÍCULO ORIGINAL

Farm. Paula Marchiori Mariani,^I Farm. Paula Da Rós Freitas,^I MSc. Iêda Carneiro Kalil,^I MSc. Girlandia Alexandre Brasil,^I MSc. Silas Nascimento Ronchi,^I Dr. Dominik Lenz,^I Dr. José Aires Ventura,^II Dr Tadeu Uggere De Andrade,^I Dra. Denise Coutinho Endringer^I

^I Universidade Vila Velha. Vila Velha, ES, Brasil.
^II Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência Técnica e Extensão Rural (Incaper). Vitória, ES, Brasil.

Palavras-chave: Carica papaya L., teste do micronúcleo, compostos fenólicos.

Introduction: the fruits of Carica papaya L. are widely consumed around the world and in Brazil, but little is known about its cytotoxic, antimutagenic and chemoprotector effects.
Objectives: to evaluate the antimutagenic and chemoprotector potential of fruits of Carica papaya and quantify the phenolic substances present in those fruits.
Methods: mutagenic activity was evaluated by micronucleus assay and phenolic substances were analyzed by the Folin-Ciacalteau method (total phenolics), and by aluminum chloride colorimetric method (total flavonoids). ]]> Results: the hidroetanolic extract of fruits of Carica papaya elicited antimutagenic and chemoprotector effects (370 mg/100 g body weight). The content of phenolic substances of hidroetanolic extract of fruits was lower than 0.001 µg/mg.
Conclusions: the antimutagenic and chemoprotector effects observed must be related to other compounds. Chemical studies must be conducted to identify the substances involved in the activity.

Key words: Carica papaya L., micronucleous assay, phenolic compound.

Introducción: los frutos de Carica papaya L. son ampliamente consumidos en todo el mundo y en Brasil, pero poco se sabe acerca de su efecto citotóxico, antimutagénico y quimioprotector.
Objetivos: evaluar el efecto antimutagénico y quimiprotector de los frutos de Carica papaya y cuantificar las sustancias fenólicas.
Métodos: la actividad mutagénica se evaluó por micronúcleos y las sustancias fenólicas se analizaron por el método Folin-Ciacalteau (fenólica), y el método colorimétrico cloruro de aluminio (flavonoides).
Resultados: el extracto hidroetanólico de frutas de Carica papaya tiene efecto antimutagénico y quimioprotector (370 mg/100 g de peso corporal). El contenido de sustancias fenólicas de extracto hidroetanólico resultó inferior a 0,001 µg/mg.
Conclusión: el efecto antimutagénico y quimioprotector observado en extractos de frutos de Carica papaya puede estar asociado con otras sustancias. Estudios químicos deben llevarse a cabo para identificar las sustancias que intervienen en la actividad.

Palabras clave: Carica papaya L., prueba de micronúcleos, compuestos fenólicos.

INTRODUÇÃO

Atualmente a correlação entre uma dieta saudável e a saúde plena tem sido alvo de estudos.^1-3 O estudo de alimentos com finalidades terapêuticas, desperta grande interesse nos pesquisadores, as pesquisas visam comprovar a ação medicinal dos alimentos.²

Estudos demonstram que a alimentação balanceada, com alto consumo de verduras, grãos e frutas reduz o risco de inúmeras doenças, como arteriosclerose, enfermidades hepáticas, câncer, entre outras.^4,5 Os efeitos benéficos causados pela boa alimentação podem ser atribuídos a presença de substâncias funcionais encontradas nos alimentos, tais como vitaminas, compostos fenólicos, carotenos, ácidos graxos poli-insaturados, fibras entre outros,^4,5 algumas destas substâncias ainda tem propriedade antioxidante aumentando a sua capacidade protetora.^6-8

A dieta é a principal fonte de substâncias carcinogênicas para o organismo,³ deste modo, pode-se ligar algumas doenças ao tipo de dieta que o indivíduo tem, e há indícios de que intervenções dietéticas podem gerar uma diminuição na progressão de doenças como o câncer.^9,10

O câncer é uma doença difundida por todo o mundo, 12,7 milhões de pessoas foram diagnosticadas com a doença em 2008, e no mesmo período, 7,6 milhões morreram em decorrência dessa enfermidade,¹¹ por isso a prevenção passa a ser a melhor abordagem.

Estudos demonstram que dieta rica em alimentos funcionais tem papel importante nos primeiros estágios de evolução do câncer.¹² ]]> A espécie Carica papaya L., conhecida como mamoeiro, pertence à família Caricaceae,^13,14 e ocorre em países tropicais e sub-tropicais.¹⁵ As folhas desta espécie são consumidas por sua suposta ação anti-cancer,^13,14 e , frutos produzidos pelo mamoeiro possuem alto valor nutritivo, com produção abundante durante todo o ano, sendo uma das atividades de grande representatividade econômica do Brasil.¹⁶

Devido ao complexo perfil químico dos frutos, ricos em vitamina C, carotenóides, sais minerais e carboidratos,⁴ além de proteínas e alcalóides, estas partes da planta são utilizadas na produção de cosméticos e outros produtos industriais.¹³ Em função desse rico elenco de substâncias, esses frutos podem ser empregados como quimiopreventivos de doenças.

Uma das formas de avaliar o potencial protetor desses frutos é através do teste do micronúcleo. Silva e outros¹⁷ descrevem micronúcleos como estruturas provenientes de fragmentos cromossômicos ou cromossomos inteiros que durante a anáfase, não migraram para os pólos da célula. O teste do micronúcleo (MN) foi igualmente eficaz na detecção da mutação, em comparação aos tradicionais testes citogenéticos.¹⁷

Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar a possível ação antimutagênica da do extrato hidroetanólico do fruto de C. papaya através do ensaio do micronúcleo bem como as suas substâncias de natureza fenólica.

MÉTODOS

Os frutos verdes e maduros de C. papaya das variedades Solo (Improved Sunrise Solo Line 72-12) e Rubi (Rubi INCAPER 511) foram coletados em junho/2011 na Fazenda Experimental do Incaper em Sooretama ES, identificados e cedidos pelo INCAPER.¹⁸

Os frutos foram triturados com multiprocessador (TSK560, NKS-Brasil) na presença de etanol 90 % na proporção 1:3 (v/v). A suspensão permaneceu em repouso por 20 min, seguido de filtração. O extrato foi armazenado em frasco âmbar e o solvente foi evaporado em evaporador rotatório (Fisatom 802, São Paulo-Brasil) a fase aquosa residual foi evaporada em banho-maria à 50 ºC, este extrato foi empregado nas análises. ]]> Foram utilizados ratos da raça Wistar-Kyoto (WKY), machos com idade entre três e quatro meses e com peso corporal variando entre 200 e 300 g. Os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno com sistema de umidade e temperatura controladas, ciclo claro-escuro de 12 h e acesso a água e comida ad libitum. Esses animais foram fornecidos pelo Biotério do Complexo Biopráticas da Universidade de Vila Velha UVV.

Os animais foram divididos em seis grupos (n= 5 cada). Grupo controle positivo recebeu ciclofosfamida 40 mg/kg intraperitoneal. Grupo controle negativo recebeu, por gavage, o veículo (água ultrapura) e os grupos tratados (Rubi maduro, Sunrise solo maduro, Rubi verde e Sunrise solo verde) receberam, por gavage o extrato hidroetanólico de cada amostra de fruto (370 mg/100 g de peso corporal), nos intervalos de 60, 48, 36 24 e 12h antes da eutanásia. A dose do extrato, administrada de 24 h antes da eutanásia foi concomitante à dose ciclofosfamida 40 mg/kg (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA) intraperitoneal.

O protocolo do experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética e Bem-Estar Animal da Universidade Vila Velha (protocolo 116/2010), sendo respeitadas as normas de segurança e bem estar animal da Universidade Vila Velha.

O teste do micronúcleo desenvolvido inicialmente por Schimid,^19,20 foi executado como descrito em Ribeiro,²¹ seguindo as orientações recomendadas pela OECD.²²

Os animais foram anestesiados por deslocamento cervical e eutanasiados. Para a obtenção da medula óssea, a extremidade final do fêmur foi extraída para expor o canal da medula e com o auxílio de uma agulha foi injetado soro fetal bovino, de modo a empurrar a medula para dentro de um tubo de centrífuga o qual foi homogeneizado até a obtenção de uma suspensão homogênea. Essa suspensão foi centrifugada, por 10 min, a 1 200 rpm, e o sobrenadante foi parcialmente descartado e encaminhado para a preparação de esfregaços.

Três esfregaços foram preparadas para cara animal que foram fixadas com metanol e coradas com o corante de Leishman. As leituras das lâminas foram feitas em objetiva de imersão e para cada lâmina foram contadas 1 000 células, sendo nas primeiras 200 células contados eritrócitos normocromáticos (ENC) e eritrócitos policromáticos (EPC). Após atingir esse valor, seguiu-se a contagem de apenas EPC até completar-se 1 000 células. Pelo menos 2 000 EPC foram contados e analisados por animal, para pelo menos cinco animais por grupo de tratamento. As análises foram realizadas por analistas cegos para o experimento. Os critérios para identificação do micronúcleo (MN) são seu tamanho, forma e coloração. No tamanho, eles devem ter 1/10 a 1/20 do tamanho do EPC. O micronúcleo deve ser arredondado ou oval, com contorno liso e definido, e coloração azul escuro. O micronúcleo, geralmente, apresenta menor evidencia de estrutura interna que o núcleo das células nucleadas, mas são semelhantes, em aparência, a esses núcleos. Foram considerados 2.000 EPC's por animal, para pelo menos 5 animais por grupo de tratamento. Os MN identificados nos EPC foram identificados como EPCMN e nos ENC, ENCMN. A citotoxicidade foi avaliada pelo índice mitótico, calculado pela relação entre EPC/ENC. A mutagenicidade foi estipulada por meio do número de eritrócitos policromáticos contendo micronúcleos (EPCMN).

A determinação do teor de polifenóis totais foi realizada por meio de espectroscopia na região do visível utilizando o método de Folin-Ciacalteu com modificações.²³ Preparou-se, quantitativamente, uma solução 4,0 mg/mL da amostra. Uma alíquota de 100 µL desta foi agitada com 500 µL do reagente de Folin-Ciacalteu (Sigma Aldrich, St. Louis, EUA) e 5 mL de água ultrapura (Pure Lab, Ultra, ELGA, Bucks, UK) por alguns segundos. Após agitação, 2 mL da solução de Na₂CO₃ 15 % foram adicionado à mistura e agitada por 30 segundos. Finalmente, a solução teve seu volume completado para 10 mL com água ultrapura (Pure Lab, Ultra, ELGA, Bucks, UK).

As amostras foram armazenadas ao abrigo da luz por 2 h. Transcorrido esse tempo, a absorbância das amostras foi medida em espectrofotômetro (T80+UV/VIS Spectometer, PG Instruments Ltda) no comprimento de onda 750 nma, tendo como branco o metanol e todos os reagentes, excetuando-se o extrato. A curva de calibração foi preparada com solução de pirogalol (Sigma Aldrich, St Louis, EUA) (10 a 350 µg/mL). A quantificação dos polifenóis totais foi feita através da equação da reta da curva de calibração y= 1, 1429x + 0,007, r²= 0,9977. Os resultados foram expressos como µg de EP (equivalentes de pirogalol) por g de extrato seco. Todas as análises foram realizadas em triplicata.

Para determinação dos flavonóides total, foi utilizado o método colorimétrico de cloreto de alumínio.²⁴ Preparou-se, quantitativamente, uma solução 4 mg/mL da amostra. Para o ensaio, foram misturados 4 mL de metanol, 1 mL da solução do extrato 1,5 mg/mL, 200 µL de solução de AlCl₃ a 10 %, 200 µL de solução de NaCO₃ a 15 % e 5 mL de água ultrapura (Pure Lab, Ultra, ELGA, Bucks, UK). Incubou-se por 30 minutos à temperatura ambiente e protegida da luz. A absorbância foi determinada em espectrofotômetro (T80+UV/VIS Spectometer, PG Instruments Ltda) no comprimento de onda 415 nm. A curva de calibração foi preparada com soluções de rutina (Sigma Aldrich, St Louis, EUA) 3,91 a 500,00 µg/mL. A quantificação de flavonóides foi determinada a partir da equação de regressão de calibração y= 0,0033x + 0,0121, r²= 0,9991. As análises foram realizadas em triplicata.

A análise estatística para os bioensaios de medula óssea dos roedores foi feita utilizando análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste de comparação de médias a posteriore de Tukey com nível de significância de p< 0,05. ]]>  

RESULTADOS

Os grupos experimentais tratados com extrato hidroetanólicos de frutos verdes e maduros de variedades de C. papaya e que receberam a dose de ciclofosfamida 24h antes da eutanásia apresentaram uma diminuição no número de eritrócitos policromáticos com micronúcleo (EPMN) (tabela) que se aproxima do valor encontrado no grupo controle negativo. A análise do índice mitótico (EPC/ENC) indica que os grupos tratados com o extratos de frutos de C. papaya, apresentaram índice mitóticosemelhante ao grupo controle negativo, indicando que a C. papaya induziu a morte celular das células com alterações no DNA.

A análise dos resultados indica uma diferença da quantidade de EPCMN entre os grupos (tabela). Quando se analisa o grupo controle positivo, percebe-se um aumento na quantidade de micronúcleos encontrada, confirmando assim a genotoxicidade da ciclofosfamida, e ainda uma diminuição no Índice Mitótico, mostrando a indução de morte celular.

Na determinação de polifenóis totais e flavonóides totais os valores para estes constituintes para os extratos hidroetanólicos de frutos de C. papaya foram abaixo do limite de quantificação, de < 0,001 µg/mL e 3,9 µg/mL respectivamente.

DISCUSSÃO ]]>

O ensaio do micronúcleo pode ser empregado para a detecção de dano celular no processo da divisão, bem como a avaliação da extensão destes danos. Deste modo o ensaio pode mensurar a capacidade nociva ou protetora de determinada substância.²⁵

Ribeiro²¹ descreve que para realizar uma análise dos dados, devem-se avaliar as diferenças estatísticas nas frequências de EPCMN entre o grupo tratado e o grupo controle negativo. O índice mitótico (tabela) mostra que o tratamento com os extratos hidroetanólicos de frutos de variedades diferentes de C. papaya, em diferentes estágios de maturação diminui a formação de micronúcleos, porém não impede a morte celular causada pela ciclofosfamida.

Os grupos que foram tratados com os extratos hidroetanólicos de frutos de C. papaya apresentaram uma quantidade pequena de EPCMN, sendo semelhante ao grupo controle negativo e diferente do grupo positivo, indicando assim que o extrato de frutos maduros de C. papaya atua protegendo a célula medular quanto à formação de micronúcleos. Em estudo prévio utilizando extrato etanólico de folhas de C. papaya demonstrou a diminuição no número de EPCMN no grupo tratado indicando assim a possível antimutagenicidade do extrato.²⁶

Otsuki e outros¹⁴ estudando o extrato das folhas da mesma planta constataram a presença de atividade anti-proliferativa direta em células de diversas linhagens tumorais e ainda aumento de citocinas Th1, up regulation de genes antitumorais relacionados às células mononucleadas do sangue periférico humano. Estes dados indicam melhorada resposta humoral e celular frente às linhagens estudadas.

Substâncias fenólicas estão amplamente distribuídas na natureza, fazendo parte dos constituintes de vegetais e frutas.¹⁷ As substâncias são produtos do metabolismo secundário de plantas, importantes para a proteção dessas contra agressões do ambiente.⁶

Silva e outros²⁷ relatam que os níveis de substâncias fenólicas presentes em C. papaya variam na fruta, látex, folhas e raízes. Cultivares diferentes também apresentam quantidades variadas dessas substâncias.^6,27,28 Além disso, partes masculinas e femininas da planta também possuem diferenças, sendo a masculina rica em substâncias fenólicas quando comparado à feminina.²⁹

Uma pesquisa realizada com diversas plantas, dentre elas o mamão, relata que folhas de C. papaya são ricas em alcalóides e outras substâncias, sendo utilizadas no tratamento de doenças do coração.³⁰ A variedade, grau de maturação, clima, época do ano, fatores edáficos, como tipo de solo e fertilidade são outras variáveis que influenciam a composição dos frutos.⁶

Pesquisas investigando a presença de miricetina, quercetina, canferol, luteolina e apigenina, na polpa de mamão não obtiveram êxito na detecção dessas substâncias.²⁸ Outros estudos relatam a análise dos constituintes de frutas como substâncias fenólicas, carotenóides e ácido ascórbico e sua atividade antioxidante. Dentre as frutas estudadas, o mamão foi o que apresentou menor teor de substâncias fenólicas,²⁹ fato também observado no presente estudo.

A detecção de baixos níveis de substâncias fenólicas e flavonóides no presente estudo pode ser atribuído ainda à presença de enzimas que degradem essas substâncias. Normalmente, a atividade enzimática aumenta durante a maturação dos frutos.⁶ Enzimas como a polifenol oxidase e peróxido de hidrogênio redutase estão amplamente distribuídos em plantas³⁰ e agem catalisando a oxidação de fenóis, aminas aromáticas e outros compostos orgânicos. Estas reações contribuem para a perda da cor, sabor e textura, além das propriedades nutricionais bem como possíveis propriedades farmacológicas.⁶ ]]> Outro constituinte químico natural presente no latex e em frutos de mamão é o benzil-isotiocianato (BITC), que tem sido relatado com atividade biocida, principalmente ovicida para mosca das frutas, diminuindo a sua concentração com a maturação dos frutos ou quando estes estão infectados pelo vírus da meleira.³¹

Diante do exposto, os resultados demonstrados neste estudo evidenciam que o extrato hidroetanólico de frutos maduros de C. papaya apresenta baixa toxicidade e apresenta efeito antimutagênico e quimioprotetor, além de baixos teores de substâncias fenólicas e flavonóides.

AGRADECIMENTOS

Agradece-se à CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pelas bolsas de Mestrado (BRASIL, G.A e RONCHI, S.N.) Este trabalho foi financiado pela UVV (Universidade Vila Velha).

Colaboradores: todos os autores participaram da construção da pesquisa. P M. MARIANI, P.D.R. FREITAS, G. A. BRASIL e S. N. RONCHI participaram da obtenção dos dados, discussão do artigo e revisão da versão final. J.A. VENTURA contribuiu na obtenção da matéria prima vegetal, na discussão do artigo e revisão da versão final. T. U. ANDRADE e D. LENZ participaram da análise estatística dos dados e do processo de quantificação. I.C. KALIL contribuiu no planejamento, revisão bibliográfica, obtenção dos dados, discussão do artigo, redação do artigo e revisão da versão final. D.C. ENDRINGER responsabilizou-se pela orientação e coordenação do trabalho.

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Recibido: 28 de noviembre de 2012.
Aprobado: 10 de marzo de 2013.

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