ARTÍCULO ORIGINAL

Evaluación de la actividad antiproliferativa de extractos metanólicos de plantas de la familia leguminosae

Evaluation of the antiproliferative activity of methanolic extracts of plants from the Leguminosae family

Dionisio Antonio Olmedo Agudo,^I Nadja Shantall Marrone Paredes,^II Alex Fernando Espinosa Rivas,^III Carlos Patricio Guerra Torres,^I Mahabir Prashad Gupta^I

^I Departamento de Química Medicinal y Farmacognosia, Escuela de Farmacia, Facultad de Farmacia, Universidad de Panamá. Panamá.
^II Centro Educativo Hernando Bárcena, Provincia de Panamá Oeste. Panamá. ]]> ^III Oficina de F.A.O. Panamá.

RESUMEN

Introducción: la familia Leguminosae es rica en isoflavonoides y puede tener efecto anticáncer. Las especies panameñas de esta familia no han sido estudiadas para explorar su potencial en los cánceres de mamas y próstata, dos principales causas de mortalidad en la población adulta panameña.
Objetivo: evaluar el efecto antiproliferativo contra cáncer de mamas estrógeno dependiente (RE+) y cáncer de próstata andrógeno dependiente (RA+) en extractos metanólicos de la familia Leguminosae.
Materiales: las 69 especies de plantas de esta familia fueron recolectadas en las provincias de Veraguas y Darién, República de Panamá. Para la preparación de los extractos, el material vegetal desecado y pulverizado de diversas partes de las plantas fue macerado con metanol por 24 h con agitación, luego filtrado y concentrado en un rotavapor a < 40 °C y posteriormente liofilizado. Los extractos crudos así obtenidos fueron evaluados en las líneas celulares de cáncer de mamas: MCF-7(RE+) y MCF-7(RE-), y cáncer de próstata (CaP (RA+)), utilizando el ensayo antiproliferativo con sulforodamida (SRB) y tretazolio (MTT).
Resultados: los extractos más activos contra cáncer de mama estrógeno-dependiente (ER+) fueron Neptunia pubescens (fruto), Zygia latifolia (tallo) y Albizia adinocephala (corteza) con valores de GI₅₀ entre 1,1 a 5,9 µg/ml, mientras que contra cáncer de próstata-andrógeno-dependiente (AR+) corresponden a Zygia latifolia (hoja), Pithecellobium dulce (hojas) y Acosmium panamense (tallo), que mostraron una GI₅₀ entre 1,2 a 5,1 µg/ml. Además, el extracto de Albizia adinocephala (corteza) fue activo contra cáncer de mamas que expresa el receptor HER-2, mostrando una IC₅₀ de 4,8 µg/ml.
Conclusiones: los extractos crudos de las especies promisorias podrían ser útiles como fuentes potenciales para la obtención de sustancias con actividad antiproliferativa contra cánceres receptores dependientes (RE+), (RA+) y (HER-2+).

Palabras clave: actividad anticáncer; bioensayo; GI₅₀; Receptores RE+; RA+; HER-2.

Introduction: the Leguminosae family is rich in isoflavonoids potentially effective against cancer. No studies have been conducted of Panamanian species from this family to explore their possible use in the treatment of breast and prostate cancer, two main causes of mortality among the adult population in Panama.
Objective: evaluate the antiproliferative effect of methanolic extracts from the Leguminosae family against estrogen-dependent breast cancer (ER+) and androgen-dependent prostate cancer (AR+).
Materials: all 69 species of plants from this family were collected from the provinces of Veraguas and Darién in the Republic of Panama. Dried, pulverized material from various parts of the plants was macerated in methanol for 24 h with stirring. The material obtained was filtered, concentrated in a rotary evaporator at < 40°C, and lyophilized. The crude extracts obtained were evaluated for breast cancer cell lines MCF-7(ER+) and MCF-7(ER-), and prostate cancer cell lines (CaP (AR+)), using the antiproliferative assay with sulphorhodamine (SRB) and tetrazolium (MTT).
Results: the most active extracts against estrogen-dependent breast cancer (ER+) were obtained from Neptunia pubescens (fruit), Zygia latifolia (stem) and Albizia adinocephala (bark) with GI₅₀ values of 1.1 to 5.9 µg/ml, whereas the most active extracts against androgen-dependent prostate cancer (AR+) were obtained from Zygia latifolia (leaves), Pithecellobium dulce (leaves) and Acosmium panamense (stem), with GI₅₀ values of 1.2 to 5.1 µg/ml. Additionally, extract from Albizia adinocephala (bark) was active against breast cancer expressing receptor HER-2, with an CI₅₀ of 4.8 µg/ml.
Conclusions: crude extracts from promising species could be useful as potential sources of substances with antiproliferative activity against receptor-dependent cancers (ER+), (AR+) and (HER-2+).

Keywords: anticancer activity; bioassay; GI₅₀; ER+; AR+; HER-2 receptors.

INTRODUCCIÓN

La familia Leguminosae, es la tercera más grande de las Angiospermas, con 740 géneros y 19,400 especies,¹ contiene compuestos bioactivos tales como: ácido fítico, compuestos fenólicos, isoflavonas, fitoesteroles, saponinas, taninos, carbohidratos² y alcaloides³ con efectos benéficos por sus propiedades antioxidante, antimutagénica, anticancerígena, antihiperglucémica, prevención de enfermedad coronaria y accidente cerebrovascular.²

A nivel mundial en 2012, el cáncer de mama fue el cáncer más común y el que ocasionó la mayor mortalidad en la población adulta femenina.⁵ En Panamá, la probabilidad de padecer de cáncer de mama en las mujeres es de 40 por cada 100 mil habitantes; los casos de próstata 67 por igual cantidad de habitantes siendo la sobrevida en estos casos de 5 años, si no son detectados a tiempo.⁶ Las alteraciones genéticas y moleculares que ocasionan progresión del cáncer de mamas involucran los receptores de estrógeno (RE), receptores de progesterona (RP) y el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER-2).^7,8 El cáncer de próstata (CaP) puede desarrollarse por estimulación o no del receptor androgénico (RA), lo que se denomina cáncer de próstata (RA+) y (RA-).^9-12 Este tipo de tumor constituye una de las 5 causas de muerte en la República de Panamá⁶ y sigue ocasionando muertes en la población mundial.¹²

El objetivo de este estudio fue evaluar el potencial antiproliferativo de extractos metanólicos provenientes de la familia Leguminosae, en la búsqueda de flavonoides e isoflavonoides con potencial efecto antitumoral contra el cáncer de mamas y próstata receptor hormona dependiente.

MÉTODOS

Selección de las plantas de estudios

La especies fueron seleccionadas con base en la búsqueda a través de las Base de Datos Napralert®, PuBMed, AGRICOLA y Chemical Abstracts.

Recolección del material vegetal

Se recolectaron 69 especies de la familia Leguminosae distribuidas en diferentes lugares desde el Parque Nacional Chagres, en la provincia de Panamá hasta el Parque Nacional Coiba en la Provincia de Veraguas. Estas fueron recolectadas e identificadas por Alex F. Espinosa y Carlos P. Guerra, taxónomos de CIFLORPAN. Las muestras Voucher fueron depositadas en el Herbario de la Universidad de Panamá (PMA).

Procesamiento del material vegetal

Preparación de extractos metanólicos

50 g del material vegetal procesado fue macerado con 600 ml de metanol y macerados con agitación por 24 h. Luego los extractos fueron filtrados, el filtrado concentrado in vacuo a una temperatura < de 40ºC y posteriormente liofilizados. Cada extracto liofilizado fue debidamente rotulado y almacenado a -20°C.

Ensayos antiproliferativos

Líneas celulares

Se utilizaron las líneas celulares de cáncer de mama: MCF-7: (ATCC-HTB-22 (RE+), MCF-7-Hs 578t (ATCC-HTB-126 (RE-) y de carcinoma de próstata: CaP (RA+) (CRL-2505-ATCC-22Rv1), adquiridas a través de American Type Culture Collección (ATCC) en USA.

Materiales y Reactivos

DMEM (Dubelco's modified Eagle Medium Applichem (4,5 g/l D-glucosa, L-glutamina, piruvato sódico, sin rojo fenol), MEN Lonza (Basic minimum essential aminoacids), EMEM (Modifed Eagle's Medium), (RPMI-1640 Lonza; Estreptomicina/Penicilina 10,000/10 mg Sigma, Sulfato de Gentamicina 50 mg/ml Lonza , Suero Fetal Bovino (FBS) Lonza, L-glutamina 200 mM Lonza; insulina porcina 50 mg/vial Sigma; Sulforodamina B (SRB), Tripsina-EDTA 0,25 % Sigma, PBS Lonza, ácido tricloracético, TRIS-HCl Sigma, Adriamicina (Doxorubicina Hidrocloruro) Sigma, Microplatos de 96 pocillos Nunc, pipetas de 5 ml 10 ml, puntas de micropipetas Eppendorf de 20-200 µL, Frascos Flash de 75, 150 ml, crioviales de 3 ml, viales de Eppendorf 1,5 ml, viales de 1,5, 5, 10 y 25 ml.

Preparaciones de muestras

Se disolvieron 3 mg de los extractos crudos en DMSO (dimetilsulfóxido DMSO y/o etanol 0,1 %.) para lograr una concentración de solución madre de 1000 µg/ml. La solución madre se diluyó para obtener una concentración inicial de 200 µg/ml. El control positivo de inhibición utilizado fue la Adriamicina (Sigma), en concentraciones de 1,2 x 10-⁶ M a 3,4 x 10-⁸ M, variable dependiendo de la línea celular utilizada, mientras que las células sin tratar fueron utilizadas sirvieron como control negativo. Estas células mostraron un porcentaje de crecimiento celular de 95 %, 100 %, 112 %, 127 %, 140 % y 154 % en las tres líneas celulares utilizadas en los ensayos.

Las células viables de cáncer de mama MCF-7 (RE+), MCF-7 (RE-) y CaP (RA+) fueron cultivadas con 50 ml del medio de cultivo específico (DMEM, MEM, EMEM, RPMI-1640) y suplementado con 10 % de Suero Fetal Bovino, 2 mm de L-glutamina, 100 U de penicilina con 50 μg/ml de estreptomicina o 50 μg/ml gentamicina e insulina porcina (1 x 10 M en frascos de 175 ml o en lo frasco de 150 ml por 48, 72 o 96 h según la línea celular, en atmosfera inerte de CO₂ y 95 % de humedad relativa, en un incubador a 37ºC ± 2°C. La células fueron subcultivadas semanalmente y fijadas con mezcla de Tripsina 0,05 %-EDTA 0,25 % para almacenar una solución madre de las mismas. La línea celular MCF-7 (RE+) fue subcultivada en DMEM, MCF-7 (RE-) en MEM o EMEM y CaP (RA+) en RPMI-1640, y 10 % de Suero Fetal Bovino (FBS). Las células fueron incubadas por 24 a 48 h y observadas en un microscopio invertido y contadas en un Western blot hasta una cantidad de 10,000 a 15,000 células/ml.

Las células fueron revisadas diariamente y contadas hasta obtener un crecimiento óptimo y exponencial entre 5 x 10³ a 5 x 10 ⁵ (10 % de confluencia), para inocularlas en los microplatos de 96 pocillos para realizar el ensayo de proliferación celular. Transcurrido un período de dos a tres días, 100 µL del medio de cultivo fueron remplazados por igual cantidad de medio fresco que contenía los extractos crudos o compuestos a evaluar. El ensayo fue detenido después de 2 a 3 días por remoción del medio de los pocillos, las células fijadas utilizando 1 % de ácido tricloroacético a una temperatura de 4°C y luego lavadas varias veces con PBS y secadas y luego solubilizados con 10 mM de TRIS (pH 10,5) en un agitador de microplatos por 20 min y teñido con sulforodamida B. Se midió la densidad óptica (O.D) a 492 nm usando un lector ELISA (Bio-Rad modelo 450).

La proliferación celular fue analizada por el ensayo de SBR descrito previamente por Skehan¹³, Monk¹⁴ y modificado por Kim.¹⁵

Se realizaron diluciones seriales a diferentes concentraciones de los extractos activos y compuesto patrón para elaborar una curva dosis-respuesta (Log [ ] M vs valores de O.D y se calculó el valor de GI₅₀ µg/ml. La determinación de la actividad antiproliferativa definida como GI₅₀ µg/ml: la concentración del extracto que inhibe el 50% del crecimiento celular. Todas las determinaciones se realizaron en triplicados y el promedio fue calculado. Los criterios de selección para la actividad antiproliferativa se basaron según lo establecido por el Instituto Nacional del Cáncer¹³ y modificado por Monks^{14 .}Se consideró un extracto activo, si su GI₅₀ fue <10 µg/ml.

Ensayo con MTT

La línea celular SKBR3 que sobreexpresa el receptor HER-2+ fue sembrada en la placa de microtitulación de 24 pocillos a razón de 20,000 células por pocillo. Las células fueron cultivadas durante 24 a 72 hr a 37 °C, 5 % de CO₂ para permitir la unión de las células a la superficie del pozo. Los extractos fueron preparados en DMSO 0,1 %, luego 1 μl de la solución de muestra fue añadido a los pocillos correspondientes. Cada ensayo se realizó en triplicado. Se incubó por un periodo de 24 a 72 h en una incubadora. Transcurrido ese tiempo se adicionaron a cada pocillo 50 μL de MTT en la placa de microtitulación y se incubó por 1 h para permitir la formación de cristales de formazán y después 500 μl de DMSO fueron agregados y la placa almacenada a temperatura ambiente hasta lograr la disolución de los cristales de formazán. Posteriormente se leyó la placa a 570 nm. Este ensayo fue realizado por el Instituto del Cáncer de Salamanca a cargo de Atanasio Pandiella.

La viabilidad celular (expresada en porcentaje) se calculó de la siguiente manera:

% de viabilidad = OD x 100 células / OD control de las células tratadas.

Los extractos fueron ensayados en los experimentos de dosis-respuesta como si fueran compuestos individuales. El control negativo (disolvente solo), el control positivo (sustancia citotóxica conocida), y células no tratadas fueron incluidas en cada ensayo que se realizó en triplicado.

ESTADÍSTICA

Los valores de GI₅₀ µg/ml obtenidos en el ensayo de SRD B a través de las curvas dosis-respuesta (Log [ ] M vs valores de O.D y los de % de viabilidad = OD x 100 células / OD control de las células tratadas generado por el bioensayo de MTT, fueron analizados con el programa Microsoft Excel 2003. Se reportan los promedios de tres ensayos.

RESULTADOS

Se han evaluado 160 extractos frente a la línea celular de cáncer de mama y cáncer de próstata mostrando en la tabla 1 aquellas especies con GI₅₀ 200 µg/ml.

En la tabla 2 se presentan los valores de inhibición de crecimiento (GI₅₀) en µg/ml en las tres líneas celulares utilizadas.

En la línea celular de cáncer de mama estrógeno dependiente (MCF-7 (RE+) resultaron 10 plantas con una GI₅₀ < 100 µg/ml. De éstas,7 mostraron una GI₅₀ comprendida entre 10 a 90 µg/ml y 3 resultaron los más activos con una GI₅₀ entre 1,1 a 5,9 µg/ml. Además, se han evaluado estos mismos extractos contra carcinoma de próstata andrógenos dependientes (CaP (RA+)) en el que 12 extractos mostraron una GI₅₀ comprendida entre 10 a 47 µg/ml y 5 una GI₅₀ entre 1,2 y 9,1 µg/ml, según el protocolo modificado por el Instituto Nacional del Cáncer utilizando Sulforodamida (SRB).

Los extractos más activos contra cáncer de mamas estrógeno dependiente son Neptunia pubescens (fruto), Zygia latifolia (tallo) y Albizia adinocephala (corteza) con valores de GI₅₀ 1,1, 1,4 y 5,9 µg/ml, respectivamente, mientras que contra cáncer de próstata los extractos biactivos corresponden a: Zygia latifolia (tallo), Pithecelobium dulce (hojas), Acosmium panamense (tallo), Macroptilium lathyroides (rama), Albizia adinocephala (corteza) y Aeschynomene sp., (raíz), demostrando una actividad contra el cáncer de próstata con una GI₅₀ de 1,2, 3,7, 5,1, 7,0, 7,8 y 9,1 µg/ml, respectivamente.

El análisis fitoquímico preliminar (Datos no publicados), llevado a cabo mediante cromatografía de capa fina en cromatoplacas de sílica gel 60 F₂₅₄ MercK y sílica gel RP-18 F₂₅₄ Merck, revelado con FeCl₃/0.5 N HCl y Reactivo NP/PEG nos indicó la presencia de compuestos fenólicos tipos flavonoides que podrían ser los responsables de la actividad antiproliferativa contra el cáncer de mamas y próstata. Están en marcha estudios para aislar y caraterizar estos compuestos por cromatografía líquida de alta resolución acoplada a detectores monocromático UV, Diodo y Espectrometría de Masas.

En la línea celular MCF-7 (RE-), nueve extractos metanólicos mostraron actividad a la concentración 100 µg/ml. Estos corresponden a Pithecelobium dulce (hojas), Machaerium sp. (tallo), Pterocarpus Officinalis (peciolo y raquis), Macroptilium lathyroides (raíz), Zygia latifolia (hoja), Leucaena leucocephala (tallo); Pterocarpus officinalis (tallo), Macroptilium lathyroides (rama) y Albizia adinocephala (corteza). De todos los extractos evaluados solo tres extractos metanólicos presentaron actividad contra las tres líneas celulares cancerosas: Macroptilium lathyroides (raíz), Machaerium sp. (tallo) y Albizia adinocephala (corteza).

DISCUSIÓN

En este estudio 20 extractos metanólicos mostraron efecto antiproliferativo de un total de 160 pertenecientes a 58 géneros y 69 especies de la familia Leguminosae. Está familia posee flavonas, isoflavonas y alcaloides como los indican los resultados preliminares de los estudios de cromatografía líquida de alta resolución que se están ejecutando.

Estudios similares en la búsqueda de extractos crudos con actividad antitumoral contra cáncer de mamas (RE+ y HER-2+) se han realizado en plantas como Pimienta dioica,¹⁸ Pueraria mirifica,¹⁹ hierbas utilizadas en la medicina China²⁰ y actividad inhibidora del receptor de andrógeno (RA+) en el extracto de Wedelia chinensis.²¹

Los extractos crudos promisorios para continuar con el aislamiento de los compuestos bioactivos contra cáncer de mamas estrógenos dependiente sonNeptunia pubescens, Zygia latifolia y Albizia adinocephala mientras que los activos contra cáncer de próstata fueron Pithecellobium dulce, Acosmium panamense y Zygia latifolia.

Investigaciones fitoquímicas realizadas por otros autores indican que de la corteza de Pithecellobium dulce se han aislados flavonoides prenilados²² mientras que de Ascomium panamensis corteza se han aislado ácido cafeico y varias pironas,²³ y de Albizia adinocephala corteza del tallo y hojas nuestro grupo ha aislado alcaloides tipo espermina²⁴ probablemente los responsables del efecto antiproliferativo en cáncer de mamas (RE+ y HER-2). Cabe destacar que Zygia latifolia muestra actividad antiproliferativa tanto contra cáncer de mamas de 1,1 μg/ml mientras que contra el cáncer de próstata 1,2 μg/ml. Mostrando el efecto antiproliferativo frente a cáncer hormona-dependiente, cuyos mecanismo de acción involucra la interacción del receptor de estrogenos (RE+) y el receptor androgénico (RA+), ambos involucrados en la progresión tanto del cáncer de mamas como el de próstata. Además, Albizia adinocephala posee actividad contra cáncer hormona dependiente /independiente similar a reportado por Williams et al 2014.

Este es el primer estudio donde se reporta la actividad anticáncer de mamas estrógenos dependientes y cáncer de próstata andrógenos dependientes en plantas de la familia Leguminosae de la República de Panamá.

AGRADECIMIENTOS

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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