Biomarcadores para la predicción de la gravedad del dengue

Biomarkers for Dengue Severity Prediction

Cira C. León Ramentol ¹, José A Betancourt Bethencourt ², Elizabeth Nicolau Pestana ³, Kirene Torres Tellez ⁴

1. Máster en Enfermedades Infecciosas. Especialista en Medicina General Integral y en Laboratorio Clínico. Asistente. Centro de Inmunología y Productos Biológicos (CENIPBI). Universidad de Ciencias Médicas de Camagüey. Camagüey. Cuba.
2. Doctor en Medicina Veterinaria. Profesor Auxiliar. Centro de Inmunología y Productos Biológicos (CENIPBI). Universidad de Ciencias Médicas de Camagüey. Camagüey. Cuba.
3. Máster en Bacteriología-Micología. Licenciada en Biología. Asistente. Centro de Inmunología y Productos Biológicos (CENIPBI). Universidad de Ciencias Médicas de Camagüey. Camagüey. Cuba. 
4. Máster en Gestión Turística. Licenciada en Biología. Instructor. Centro de Inmunología y Productos Biológicos (CENIPBI). Universidad de Ciencias Médicas de Camagüey. Camagüey. Cuba.

RESUMEN

De las personas que presentan dengue, el 10% evoluciona en los días iniciales hacia complicaciones y no es posible a partir del diagnóstico clínico epidemiológico predecir de manera precisa cuales pacientes van a evolucionar hacia la gravedad. El propósito de este artículo radica en familiarizar a investigadores y estudiantes de la salud con el tema relacionado con los biomarcadores, para integrar equipos de trabajo interdisciplinarios y convertir los resultados de las investigaciones en soluciones a los problemas de salud. Se describen los métodos de laboratorio efectivos para el diagnóstico y predicción clínica, así como el uso de biomarcadores productos de la respuesta inmunológica y que pueden indicar al clínico cual paciente tiene mayores probabilidades de ir a la severidad del dengue.

Palabras clave: biomarcador, dengue, interdisciplinariedad, laboratorio, inmunología.

ABSTRACT

From people who acquire dengue, 10 % of them become seriously ill in the first days; it is not yet possible to make an accurate diagnosis only based on clinical and epidemiological diagnosis and either to predict the severity of future behavior of disease. This article is aimed at familiarize health researchers and students with the use of biomarkers for predicting the severity of dengue to integrate interdisciplinary team for making translational research.  The effective laboratory method for diagnosing dengue are described and also the clinical prediction based on different biomarkers,

Keywords: biomarker, dengue, interdisdisciplinarity, laboratory, immunology.

INTRODUCCIÓN

En Cuba, se logra baja mortalidad por dengue dado que de manera sistemática los pacientes son hospitalizados y se les administra líquidos intravenosos a los casos de mayor riesgo, lo que minimiza la frecuencia de complicaciones del dengue relacionadas con la disminución de la resistencia vascular por pérdida de la integridad capilar, que conlleva a la extravasación de líquidos ².

Guzman y Harris realizan una revisión bibliográfica sobre dengue que abarca varios aspectos de interés de este enfermedad, tales como, dinámica de transmisión, evolución del virus, diagnóstico, nueva clasificación, respuesta inmune, patogénesis, intervenciones y nuevas tendencias ³.

De las personas que presentan dengue, el 10% evoluciona en los días iniciales hacia complicaciones y no es posible a partir del diagnóstico clínico epidemiológico predecir de manera precisa cuales pacientes van a evolucionar hacia la gravedad. Se acepta el papel determinante que en este proceso juega la respuesta inflamatoria ante la infección, en particular, distintas citocinas cuyos niveles séricos pueden detectarse desde etapas tempranas de la enfermedad, por lo que, en los pacientes con fiebre por dengue, los niveles séricos de algunos biomarcadores pueden facilitar la predicción del curso clínico de la enfermedad ⁴.

El propósito de este artículo radica en familiarizar a investigadores y estudiantes de la salud con el tema relacionado con los biomarcadores, para integrar equipos de trabajo interdisciplinarios para convertir los resultados de las investigaciones en soluciones a los problemas de salud, como se realiza actualmente en diversas partes del mundo ^5-10.

DESARROLLO

Las fiebres hemorrágicas se caracterizan por decrecimiento del número de plaquetas, acompañado del aumento de la degradación de los productos del fibrinógeno, el tiempo de protrombina y tiempo de la protrombina parcial. Como promedio al quinto día de comenzar la fiebre se manifiesta una marcada leucopenia y viremia. Otro hallazgo radica en el incremento de la alaninaaminotransferasa (ALAT) y de la aspartatoaminotransferasa (ASAT), enzimas que primariamente se deben al daño hepático. El sangramiento es común en este tipo de enfermedades y se debe a una coagulación intravascular diseminada que afecta los factores de coagulación lo que provoca la extravasación masiva de plasma, hipovolemia y shock, fallos de órganos y muerte ^11-14.

Con respecto al dengue, para evaluar la función hepática y renal se utiliza el conteo de plaquetas, los niveles de fosfatasa alcalina sérica, urea, creatinina, albúmina, y la concentración de proteínas. En este estudio en particular solo se determinó de valor diagnóstico la albúmina, urea y la creatinina, estos biomarcadores pudieran tener valor predictivo para la severidad del dengue en los estadios tempranos de la enfermedad , pero no para diferenciar el dengue del dengue hemorrágico ¹⁵.

En la actualidad el diagnóstico del dengue está dirigido principalmente a la vigilancia epidemiológica y es una necesidad urgente el contar con métodos que permitan un diagnóstico temprano de la enfermedad y en consecuencia, adoptar medidas terapéuticas adecuadas para el tratamiento y control del paciente ¹⁶.

• Dengue: con o sin signos de alarma

• Dengue grave: escape severo de fluidos, hemorragia severa y daño severo de órganos.

Esta última es la clasificación utilizada actualmente para el manejo de los casos con diagnóstico de dengue.

Criterios de la OMS para el diagnóstico del dengue ¹⁷:

1.1 Dengue probable sin signos de alarma: vivir o viajar a zona endémica, fiebre, tener dos o más de las siguientes manifestaciones:

• ]]> Náuseas o vómitos.

• Erupción cutánea.

• Dolor intenso o persistente.

• Prueba del torniquete positiva.

• Leucopenia.

]]>

Dolor o sensibilidad abdominal.

• Vómitos persistentes.

• Acumulación de líquido en el examen físico.

• Sangramiento de las mucosas.

• Letargo o agitación.

]]>

Agrandamiento del hígado > 2 cm.

• Aumento del hematocrito con descenso rápido del conteo de plaquetas.

2.1. Dengue severo (puede desarrollarse incluso sin signos de alarma):

• Pérdida severa de plasma que conduce a shock o acumulación de líquido con distrés respiratorio.

• Hemorragia severa.

]]>

Daño severo a órganos.

• Alaninaaminotransferasa o aspartatoaminotransferasa ≥ 1 000 unidades/L.

• Alteraciones de la conciencia.

• Participación de otros órganos, por ej. el corazón.

2.2. Dengue confirmado en el laboratorio:

]]>

Cultivo viral positivo para dengue.

• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) positiva para ARN de dengue.

• Seroconversión de la inmunoglobulina M en sueros pareados (uno durante la infección aguda y uno después de la recuperación).

• Seroconversión de la inmunoglobulina G (IgG) o cuadruplicación de los títulos de IgG en sueros pareados.

Exámenes de laboratorio utilizados para clasificar pacientes de dengue ¹⁸

• Hemograma con diferencial: leucopenia, linfocitosis, monocitosis, hematocrito aumentado, en casos de fiebre hemorrágica de dengue (FHD) este es superior al 20% (hemoconcentración).

• Coagulograma: trombocitopenia (frecuentemente por debajo de 100 x 10⁹/L en casos de FHD), en los casos más graves tiempo de protrombina prolongado.

• Hemoquímica: elevación de enzimas hepáticas y de los niveles séricos de urea, hipoalbuminemia.

• Parcial de orina: hematuria y albuminuria

La detección de NS1 (glicoproteína de 50 kDa de 353 o 354 aminoácidos que no forma parte del virión, pero que se libera de las células infectadas por el dengue) por ELISA o test rápidos tiene una sensibilidad entre 87% y 99% y especificidad entre 82% y 84%, que facilita el diagnóstico precoz del dengue. Pasados los cinco días, la seroconversión de anticuerpos IgM e IgG por hemaglutinación o ELISA permite confirmar el diagnóstico. El aumento de IgM denota una infección reciente y la IgG una infección reciente o antigua ²¹. La seroconversión de IgM e IgG anti-VDEN y el aumento de cuatro veces o más de la IgG en el suero son muy usadas para confirmar la infección viral. Sin embargo, los altos niveles de IgM e IgG en una única muestra pueden sugerir la infección aguda por VDEN ².

Los anticuerpos IgG antidengue se incrementan lentamente a partir del sexto día del comienzo de los síntomas, son máximos hacia los 15 – 21 días, después declinan y permanecen detectables de por vida. Para el diagnóstico se requieren muestras de sueros pareados (seroconversión o aumento del título de IgG en cuatro veces o más) ²².

Durante la fase aguda o fase de viremia (hasta cuatro o cinco días) de la enfermedad puede ser diagnosticado el dengue mediante aislamiento viral, detección del ácido nucleico del virus o del antígeno NS1 en el suero. Al final de la fase aguda de infección, la serología es el método de elección ¹⁶.

Se desarrollan muchas pruebas comerciales tipo ELISA (del inglés enzime - linked immunosorbent assay) o ensayo inmunoenzimático sobre fase sólida y también pruebas rápidas que aun están en fase de evaluación para detectar el antígeno NS1. El MAC-ELISA (del inglés IgM antibody capture ELISA) se utiliza generalmente para la detección de la IgM anti-VDEN. Por otro lado, el método de ELISA de inhibición (MEI), que detecta y titula las inmunoglobulinas totales contra el VDEN, permite clasificar el caso de dengue como primario o secundario ^{19, 20}.

La técnica de inmunofluorescencia indirecta mediante la utilización de anticuerpos monoclonales específicos de serotipo, permite la identificación del serotipo. La técnica de PCR permite la detección del genoma viral y su identificación en serotipos mediante el uso de suero, tejido, larvas o mosquitos adultos. Además de su utilidad como método de diagnóstico rápido, también es empleado en el estudio genómico de cepas de dengue, lo que permite por medio del análisis mediante enzimas de restricción o secuenciación nucleotídica, la clasificación de las cepas en genotipos ¹⁹.

Presencia de biomarcadores relacionadas con las respuestas inmunológicas al dengue

El complejo dengue lo constituyen cuatro serotipos virales serológicamente diferenciables (dengue 1, 2, 3 y 4) que comparten analogías estructurales y patogénicas, por lo que cualquiera puede producir las formas graves de la enfermedad, aunque los serotipos 2 y 3 han estado asociados a la mayor cantidad de casos graves y fallecidos; son virus constituidos por partículas esféricas de 40 a 50 nm de diámetro que constan de las proteínas estructurales de la envoltura (E), membrana (M) y cápside (C), así como un genoma de ácido ribonucleico (ARN). También tienen otras proteínas no estructurales (NS): NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5-3. Los virus del dengue pertenecen al género Flavivirus de la familia Flaviviridae ¹⁵.

El rol del NS1 en la replicación viral es desconocido pero se demues­tra que es secretada por las células infectadas (sNS1) y que tiene importante actividad inmunológica ¹. Los anticuerpos contra NS1 podrían causar disfunción endotelial por reacción cruzada a las proteínas del huésped y al endotelio. Asi­mismo, puede ser un modulador en la vía del complemento y proteger al virus de la acción neutralizadora del mismo ²³.

Recientemente se ha publicado el hallazgo del virus dengue serotipo 5 (DENV-5) en un paciente de Tailandia que cursa con un cuadro clínico grave. La secuenciación y análisis del genoma completo del virus ubica al nuevo virus en el árbol filogenético en un lado diferente respecto a los otros serotipos; asimismo, las pruebas serológicas confirmaron el hallazgo. Este descubrimiento implica adicionar el DENV-5 a la clasificación de los cuatro serotipos reportados anteriormente (DENV-1, 2, 3, 4) además, de complicar todavía más la difícil situación clínico epidemiológica del dengue a nivel mundial ²⁴.

A pesar de que la fisiopatología del dengue no está completamente esclarecida, se acepta que es multifactorial. En esta compleja interacción multifactorial participan factores del virus y del hospedero que pueden conducir al dengue grave y hasta la muerte ^{17, 18}.

Estudios clínico-epidemiológicos y de factores de riesgo demuestran que las enfermedades crónicas y otras condiciones concomitantes como el embarazo, el primer año de vida y tener 60 años o más de edad, se asocian a mayor gravedad de la enfermedad por dengue. La diabetes mellitus, el asma bronquial, las hepatopatías crónicas, la insuficiencia renal crónica, la obesidad y las anemias hemolíticas, en particular la drepanocitosis, constituyen un grupo de problemas clínicos que, además, de estar relacionados con mayor gravedad complican considerablemente el tratamiento clínico de los enfermos. Por tanto, los pacientes febriles con sospecha de dengue y alguna comorbilidad o condiciones concomitantes deben ser evaluados de forma individual, se recomienda su ingreso y seguimiento especializado desde el inicio de la enfermedad febril para evitar complicaciones ².

El principal órgano blanco del dengue es el endotelio vascular y los elementos formes de la sangre. El daño fun­cional, no morfológico, de estas células se debe a la propia replicación viral intracelular y como consecuencia de la gran liberación de citocinas, producen un aumento de la permeabilidad capilar con fuga plasmática al intersticio de todos los órganos. Otros mecanismos del daño celular incluyen a los inmunocomplejos, efecto de los linfocitos T, reacción cruzada entre los anticuerpos circulantes y el endotelio vascular, aumento de los anticuerpos y complemento, mediadores solubles como las citocinas, cepas extremadamente virulentas, pero el más reconocido es la gran liberación de anticuerpos y citocinas o citoquinas cuando ocurre una segunda infección generando lo que se conoce como “tsunami de citoquinas”. Característicamente, las manifestaciones clínicas de las complicaciones se inician a partir del tercer día de enfermedad, cuando la fiebre cede y la viremia se halla en descenso, pero coincide con el aumento de las defensas inmunes del cuerpo ²⁵.

Los mastocitos, células implicadas en reacciones alérgicas e infecciones parasitarias, son objeto de atención de aquellos que estudian la infección por dengue. Durante años se especula sobre el posible papel de esas células en la patogenia de esta virosis. A favor de ello se observan niveles elevados de histamina, un mediador soluble de estas células, en la orina de pacientes de cuadros severos de dengue. Sin embargo, el papel preciso de los mastocitos en relación con la patogenia del dengue no está bien explorado aún ^{26, 27}.

Los mastocitos están involucrados tanto en la inmunidad innata como en las fases de iniciación y efectora de la inmunidad adaptativa. Recientemente, se constata que pueden inducir la secreción de interferón alfa (IFN-α) así como, otras quimoquinas. Su participación en la fase efectora de la inmunidad adaptativa se asocia principalmente a las señales inducidas por los receptores Fc que están en su superficie, porque a través de estos se activan respuestas celulares como endocitosis, fagocitosis de complejos particulados, exocitosis de aminas vasoactivas, enzimas proteolíticas y moléculas citotóxicas, así como, mediadores proinflamatorios de derivados lipídicos, citoquinas, quimoquinas y factores de crecimiento ²⁸.

La inmunidad que deja la infección por cada serotipo viral es duradera, probablemente de por vida y se expresa por la presencia de anticuerpos neutralizantes hemotípicos. No existe inmunidad cruzada de serotipos, excepto durante las primeras semanas o meses después de la infección. Sin embargo, cuando una persona tiene anticuerpos subneutralizantes contra uno de los virus del dengue y es infectado por otro serotipo viral se produce una respuesta infrecuente, casi exclusiva de la infección por dengue: una amplificación dependiente de anticuerpos (ADA) que se traduce en una elevada replicación viral y aumento de la viremia, lo cual condiciona y favorece el desarrollo la forma grave de la enfermedad ^{29, 30}.

Experiencias foráneas con biomarcadores para predecir gravedad del dengue

En la última década, se hacen numerosos esfuerzos para identificar marcadores en el suero que puedan predecir la severidad del dengue, con énfasis en las citoquinas. Varios estudios proponen que citoquinas de inmunidad innata, ejemplo: IFN-α, interleucina-8 (IL-8) se elevan durante la fase febril temprana mientras que las citoquinas inmune adaptativas, como son factor de necrosis tumoral alfa (FNTα), interleucina-10 (IL-10), interferón gamma (IFN-γ) parecen aumentar durante la fase de efervescencia de la infección del dengue ³¹.

Varios factores limitan tradicionalmente la utilidad de estos estudios en el desarrollo de biomarcadores.

Se observan niveles elevados de muchas citoquinas diferentes en la infección del dengue, en particular, en el suero de pacientes con dengue severo altas concentraciones de citoquinas como IFNα, FNTα e IL-10; reducidos niveles de óxido nítrico asociado con niveles elevados de IL-10 se describen en los pacientes con dengue severo. El óxido nítrico contribuye a la regulación inmune, bajos niveles pueden producir incremento de citoquinas de expresión proinflammatoria, además, se conoce que el incremento de los niveles IL-10 se correlaciona con disminución de los niveles de plaquetas y alteraciones de su función. Este fenómeno puede, en parte, contribuir al desarrollo de los trastornos de la coagulación observados como complicación en la enfermedad severa; elevados niveles de IL-6 se observan en los niños con ascitis ^{32, 33}.

El FNT promueve el aumento de la permeabilidad del endotelio y es probable que el aumento de los niveles de esta citoquina pueda producir un curso de la enfermedad más severo. El FNTα se encuentra en pacientes con dengue y su relación con la gravedad es propuesta recientemente ²².

Otro mediador de interés es el Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand, TRAIL (ligando inductor del factor de necrosis tumoral relacionado con la apoptosis), que regula la replicación de monocitos infectados con el virus del dengue, lo cual evidencia así su actividad antiviral ¹⁶. La liberación de TRAIL como respuesta a la infección por el virus del dengue, hace parte importante de la respuesta inflamatoria que esta induce.

En otros estudios se asocian los niveles de la proteína 1 de tipo receptor de interleucina-1, llamada IL-1RL1 o proteína ST2 con la fiebre por dengue con valores mayores en aquellos que sufren infección secundaria, lo cual sugiere una posible asociación con la gravedad de la enfermedad ^{5, 23}. Estos niveles se correlacionaron negativamente con el número de plaquetas y positivamente, con el valor de las transaminasas séricas y la prolongación del tiempo de protrombina. Todo ello fundamenta la idea de que la ST2 podría ser un marcador temprano de la gravedad del dengue ³⁴.

El factor de necrosis tumoral gamma (FNTγ) es el más potente inductor de indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO), una enzima que ha estado implicada en la defensa antimicrobiana y en la regulación auto-inmunitaria. En la infección por el virus del dengue, se reportan niveles elevados de IDO en células endoteliales infectadas por este virus ³⁵. Las ferritinas pueden servir como un potencial biomarcador para la predicción temprana de la severidad del dengue ³⁶. Igualmente los niveles elevados de células rojas derivadas de las micropartículas (derivadas de la muerte apoptótica de la célula y la activación celular) en la fase aguda de la enfermedad pude servir como biomarcador para identificar pacientes con enfermedad severa ³⁷.

Métodos analíticos utilizados para definir biomarcadores adecuados

a) Para el desarrollo de un panel candidato para biomarcadores de dengue ³⁸

• Análisis multivariado de varianza (MANOVA): en el que se buscaban diferencias entre la enfermedad y los grupos de géneros.

]]>

Para clasificación, un método de regresión no paramétrico. (MARS) válido para cuando existen muchas variables, este evalúa su interacción, por lo que se adecua a la complejidad del dengue.

• Modelo generalizado aditivo (GAMs) para identificar relaciones no lineales entre las variables predictores y las salidas clínicas cuando hay gran número de variables independientes.

b) Para encontrar métodos de selección de variables para determinar biomarcadores adecuados para la predicción del dengue hemorrágico39

• El procedimiento para seleccionar las variables adecuadas es esencial para generar resultados reproducibles y generalizables, el mejor método encontrado en este artículo fue el modelo de regresión generalizado regularizado, método que puede lidiar con variables categóricas, en este caso se eleva la verosimilitud y se minimiza el número de variables. Con este método se determina que el conteo de IL-10, de plaquetas y de linfocitos fueron los más importantes sobre la base de la química sérica y las medidas de citoquinas.

c) Para determinar un panel de tres biomarcadores para la predicción del dengue hemorrágico40

]]>

Se utiliza regresión logística y análisis de área bajo la curva (ROC), se encuentra un ROC de 0,9615 en la que las IL-10, las plaquetas y los linfocitos son los mejores elementos predictivos.

CONCLUSIONES

Con la presente revisión bibliográfica se logró familiarizar a investigadores y estudiantes de la salud con el tema relacionado con los biomarcadores para el diagnóstico precoz de la gravedad del dengue. El conocimiento de estos temas facilita integrar equipos de trabajo interdisciplinarios para convertir los resultados de las investigaciones en soluciones sostenibles a los problemas de salud.

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Recibido: 12 de junio de 2015
Aprobado: 26 de abril de 2016

Dr. José A Betancourt Bethencourt. Centro de Inmunología y Productos Biológicos (CENIPBI). Universidad de Ciencias Médicas de Camagüey. Cuba.
Correo electrónico:  josebetancourt.cmw@infomed.sld.cu