Instituto Nacional de Endocrinología

Animales de laboratorio en la endocrinología. Biomodelos de las enfermedades tiroideas

Dra. Beatriz Hugues Hernandorena,1 Lic. Julio César Rodríguez González,2 Lic. Julio César Rodríguez García3 y Lic. María Teresa Marrero Rodríguez4

Resumen

Los modelos animales que se utilizan en las investigaciones sobre el tiroides ayudan al estudio de los mecanismos patogénicos que conducen a la presentación de los desórdenes de esta glándula, dan la oportunidad de explorar nuevos tratamientos y formas de prevención. El objetivo de este trabajo fue brindar una información detallada sobre los biomodelos de enfermedades que afectan el tiroides, a partir de una revisión bibliográfica sobre el tema, que comprenda los que se obtienen de forma espontánea o inducida, exponiendo los factores ambientales que influyen sobre ellos. En conclusión, se expresaron las ventajas que ofrecen estos biomodelos para los investigadores que se dedican a estudiar esta rama de la endocrinología, aunque no constituyan un reflejo exacto de lo que ocurre en el hombre y no necesariamente reúnan todas las características distintivas de la patología tiroidea en cuestión.

DeCS: ANIMALES DE LABORATORIO; ENFERMEDADES DE LA TIROIDES/prevención y control; ENFERMEDADES DE LA TIROIDES/terapia; MODELOS BIOLOGICOS.

El objetivo del presente trabajo es realizar una descripción de los biomodelos que son utilizados en el estudio anatómico, fisiológico y patológico de esta glándula, lo cual resulta importante para los investigadores que se dedican a la experimentación en esta rama de la endocrinología.

En este artículo se muestran los biomodelos que se utilizan en el estudio de las enfermedades autoinmunes del tiroides y el bocio.

Enfermedades autoinmunes tiroideas

Las enfermedades autoinmunes tiroideas (EAT) se deben a un efecto patogénico de los anticuerpos o a una autorreactivación de las células T que provocan inflamación, alteraciones funcionales y/o lesiones anatómicas. Están caracterizadas por una infiltración mononuclear de la glándula tiroides que, en casos extremos, destruye la estructura folicular. Dicha infiltración consiste en células T CD4+ y CD8+, macrófagos y unas pocas células ß (< 5 %).2 La autoinmunidad es una causa muy común de disfunción tiroidea. Las manifestaciones clínicas son muy amplias, contemplan desde hipotiroidismo como en la enfermedad de Hashimoto, hasta tirotoxicosis como en la enfermedad de Graves y también se incluye la tiroiditis posparto.

• Los modelos animales se obtienen de forma espontánea o inducida por la aplicación de diversos métodos.4

Biomodelos espontáneos

Las EAT aparecen espontáneamente en diversas clases de animales como los pollos obesos, ratas, ratones, gatos y perros, los 3 primeros son los más utilizados en las investigaciones.

• Pollos obesos: la tiroiditis aviar fue descrita por Witebsby en una línea de pollos White Leghorn, en los que las características más notables eran la obesidad y la disminución de la postura.5 La variedad de pollos obesos (OS) muestra aspectos fenotípicos, patohistológicos, serológicos y endocrinológicos muy parecidos a los de la enfermedad de Hashimoto del ser humano.6 Existe otra variedad de pollos, la Cornell C (progenitora de la OS) que presenta una incidencia significativa de tiroiditis, pero se manifiesta de forma menos severa y aparece más tarde que en los OS. Ambas variedades constituyen modelos interesantes para estudiar el papel etiológico de las anormalidades tiroideas autoinmunes y de las relacionadas con el proceso de yodación de la síntesis de hormonas tiroideas.7 En estudios recientes sobre la regulación genética de la tiroiditis autoinmune espontánea en los pollos OS, se ha planteado que posiblemente estén involucrados factores genéticos, se han demostrado 2 transcriptos específicos de la enfermedad responsables de su iniciación, correspondientes a los genes de los virus endógenos aviares -1, -3 y -6. El producto de estos genes puede ser yodado dentro de la glándula tiroides e influir en el metabolismo de la tiroglobulina (Tg).
  

  Esta hipótesis necesita ser demostrada.8 En todos los modelos espontáneos de EAT, el suministro de yodo en la dieta constituye un factor importante en su presentación.9

• Ratas: Las principales líneas de ratas elegidas son la BB/Wor y Búffalo. En las ratas BB y los ratones diabéticos no obesos (NOD) es posible estudiar múltiples endocrinopatías espontáneas autoinmunes como la diabetes mellitus (DM) y la tiroiditis linfocítica (TL) del ser humano.10 En estos animales primero se desarrolla la TL y secundariamente, la DM, con destrucción linfocítica de las células b del páncreas.11

Las ratas propensas a la TL y a la DM (BB/Wor LT/DM) presentan anticuerpos contra células parietales gástricas, músculo liso, timocitos, antitiroglobulinas y anticélulas pancreáticas,13 por lo cual representan un modelo de gran utilidad en las investigaciones sobre autoinmunidad en órganos específicos.

En las ratas Búffalo, la incidencia alcanza el 25 % en las hembras multíparas.14

• Ratones: En la línea NOD existe una asociación entre la diabetes y la tiroiditis. Se ha reportado una alta incidencia (67-90 %) de tiroiditis en animales que tienen 2-25 sem de nacidos15 asociada a una alta incidencia de anticuerpos contra Tg. La incidencia de una y otra enfermedad varía entre las colonias, lo cual puede ser explicado por la influencia de los factores ambientales entre los cuales desempeña un papel importante el suministro de yodo. En los ratones NOD se pueden estudiar la DM, la TL y otras enfermedades autoinmunes como la sialitis y la anemia hemolítica.16
• Gatos: Schumm-Draeger y otros17 obtuvieron un modelo en esta especie a partir de una colonia de gatos criados bajo un estricto control genético. Se observaron casos clínicos en los que se mostraban rasgos típicos de EAT, dirigidos hacia un severo hipotiroidismo parecido a la enfermedad de Hashimoto del hombre, por lo cual este modelo permite investigar la patogénesis, patofisiología y posibilidades de tratamiento de esta enfermedad.
• Perros: La TL canina presenta un cuadro semejante al de la tiroiditis de Hashimoto humana. Afecta sobre todo a los sabuesos. No se presentan manifestaciones clínicas en los que la padecen.5

Biomodelos inducidos

• Inmunización con antígenos tiroideos: Un procedimiento tradicional para desarrollar un modelo animal de una enfermedad autoinmune tiroidea, es inmunizar al animal con antígeno soluble en adyuvante. El primer modelo experimental de inducción de la tiroiditis de Hashimoto fue establecido en 1956 por Rose y Witebsky al inmunizar conejos con Tg humana y adyuvante completo de Freund (ACF).18,19 A partir de entonces se lograron otros modelos de animales -sobre todo en ratas, ratones y pollos- utilizando otros antígenos tiroideos como la tiroperoxidasa (TPO) y péptidos del receptor de tirotropina (TSHR),20 así como distintos tipos de adyuvantes, los más efectivos son el ACF y los lipopolisacáridos de Salmonella enteritidis (LPO).21

En la tabla 1 se citan algunas experiencias de diferentes investigadores al respecto. Como se puede observar en la misma, los antígenos utilizados pueden ser autólogos o no.

Tabla 1. Obtención de modelos inducidos por la inmunización de antígenos tiroideos

La inmunización con Tg tiene como resultado la producción de células T activadas y la formación de anticuerpos Tg. Existen factores inmunogenéticos y ambientales que inciden en la presentación de la tiroiditis autoinmune inducida por la Tg . En estudios genéticos se ha demostrado que la Tg es un antígeno que ha sentado las bases para entender la interrelación de los genes del sistema principal de histocompatibilidad (MHC) con las EAT, tanto en los animales como en el hombre. Los principales modelos derivan de los ratones,22 las ratas BB/Wor23 y los pollos obesos OS, aunque la susceptibilidad de las diferentes líneas es variable. Algunos investigadores han utilizado otras líneas de ratas genéticamente susceptibles, como de Assis-Paiva y otros23 que emplearon animales AUG y PVGc. En relación con los factores ambientales, la cantidad de yodo que contiene la dieta afecta de manera determinante la aparición de las EAT inducida por Tg. Bajas concentraciones de Tg yodada inducen pobremente su aparición.24 Otros factores comprenden el estrés, el hábito de fumar (en el ser humano) y las infecciones.11 Brazillet y otros25 indujeron EAT en ratones CBA/J inyectando Tg desnaturalizada xenogénica (porcina) sin emplear adyuvante, lo cual provoca la producción de células T citotóxicas.

Kotani y otros28 indujeron TL en ratones, inmunizándolos con TPO porcina purificada, lograron una gran producción de anticuerpos contra la TPO porcina con respecto a la TPO murina, se desarrolló la TL sin hipotiroidismo, esta inducción es dependiente de las células T.

Por la ausencia de un modelo animal espontáneo para la enfermedad de Graves, en los últimos 30 años se han realizado numerosos intentos para desarrollar modelos inducidos de esta enfermedad, se han empleado distintos procedimientos entre los que se encuentran: la generación de anticuerpos antiidiopáticos de la TSH, inmunización con formas solubles del receptor humano de TSH como antígeno acoplado a adyuvante , inmunización genética y, más recientemente, inmunizaciones con fibroblastos singénicos que expresan el TSHR y moléculas clase ll del MHC.29 Después del clonamiento del TSHR , se han realizado numerosos intentos para desarrollar un modelo animal del hipertiroidismo de Graves. Conejos y ratones inmunizados con péptidos de TSHR o la molécula proteica expresada en bacteria o células de insectos, desarrollan anticuerpos séricos que reaccionan con preparaciones del receptor en ELISA los cuales han servido como reactivos importantes para caracterizar al receptor. La inmunización con TSHR puede inducir diferentes manifestaciones clínicas.30 Si la respuesta humoral consiste en la producción de anticuerpos estimulantes de la función tiroidea (actividad TSAb), se desarrolla hipertiroidismo, como sucede en la enfermedad de Graves, y si se producen anticuerpos bloqueadores, entonces se desarrolla el hipotirodismo (actividad TBAb).31 Por ser una proteína antigénica (TSHR), la respuesta inmunológica debe ser dependiente de las células T. La naturaleza del antígeno, la vía, dosis y frecuencia de la administración, el sexo y la edad de los animales, así como la naturaleza del adyuvante influyen en los resultados.31

FIG. Modelos animales para la enfermedad de Graves

A pesar de usarse diferentes preparaciones del receptor, diferentes líneas gemelas de ratones y diferentes adyuvantes, este procedimiento no fue exitoso dado que no simulaba en gran medida el hipertiroidismo de Graves. En la actualidad, la inmunización tradicional con el ectodominio del TSHR humano en adyuvante no logra inducir el tipo particular de respuesta de anticuerpos que ocurre in vivo.29 Una alternativa para la inmunización de un animal con una proteína y adyuvante es inyectar un vector (plásmido) de expresión genética que contiene el DNA complementario (DNAc) de una proteína determinada.32 Reportes preliminares indican que la inmunización con el DNAc del TSHR humano en ratones no consanguíneos indujo actividad TBAb y TSAb localizados en la fracción IgG del suero,33-35 se logró un biomodelo para el estudio de la enfermedad de Graves con un acercamiento adecuado a esta. Muy recientemente, el empleo de un ingenioso proceder, consistente en la inmunización de ratones AKR/N con fibroblastos transformados establemente con el DNAc para el receptor de TSH humano y moléculas MHC clase ll singénicas del TSHR ha permitido el desarrollo de un modelo animal que claramente simula el hipertiroidismo de Graves.36 De este modelo (figura) es necesario enfatizar varias características importantes. Los ratones inmunizados con fibroblastos transformados solamente con el DNAc del TSHR y los ratones que recibieron solamente las células transformadas con el vector (plásmido) no presentaron niveles elevados de T4 y T3 o anticuerpos contra TSHR, sin embargo, la mayoría de los ratones inmunizados con fibroblastos que expresan tanto moléculas MHC clase ll como el TSHR desarrollaron anticuerpos que inhibían la unión de la TSH a su receptor y, aproximadamente, el 25 % de estos fueron claramente tirotóxicos con elevados niveles de T4 y T3 , actividad TSAb detectable e hipertrofia de las células tiroideas. Por lo tanto, por primera vez, se estableció un modelo animal en el cual una proporción de individuos tienen las características distintivas del hipertiroidismo de Graves desde el punto de vista inmunológico y endocrinológico. La reproducibilidad de este modelo ha sido confirmada por 2 laboratorios independientes. A pesar de la presencia de bocio, ninguno de los ratones presentó infiltración linfocitaria de la tiroides,37,38 una de las características distintivas de la enfermedad de Grave, así como la no estimulación específica de la respuesta inmune.39 Estas limitaciones afectan de diferentes formas el uso del modelo de Shimojo y otros.36 Primero, la ausencia de un infiltrado tiroideo impide investigaciones de poblaciones linfocitarias dentro del órgano blanco de la respuesta autoinmune, como ha sido realizado en ratones Balb/c inmunizados con TSHR.32,40 Segundo, la estimulación no específica de la respuesta inmune tiene grandes consecuencias como la imposibilidad de generar anticuerpos monoclonales específicos contra el TSHR a partir de ratones inmunizados con células de fibroblasto-TSHR y el bajo nivel de anticuerpos antígeno específico que son secretados, así como dificultades para caracterizar la respuesta proliferativa de células T y B antígeno específicas.39

Técnicas de manipulación genética ]]>

La obtención de animales transgénicos (se les adiciona uno o varios genes) y knockout (se les extrae uno o varios genes) ha permitido estudiar el efecto de determinados genes simples, efecto que ha podido ser demostrado solamente en animales vivos. En la actualidad constituyen una herramienta muy potente en este campo.

En la tabla 2 se muestran algunos ejemplos de animales de esta clase empleados en el estudio de las EAT.41,42

Tabla 2. Ratones trangénicos y knockouts empleados en el estudio de las EAT

Xenotrasplantes

Este método permite estudiar la fisiopatología, diagnóstico y efecto terapéutico en condiciones in vivo de los procesos autoinmunes.

Tabla 3. Xenotrasplantes en ratones

Los ratones atímicos desnudos han sido empleados durante muchos años -más de 15-, los de inmunodeficiencia combinada severa (SCID) son de reciente incorporación. Ambas líneas tienen propiedades inmunológicas diferentes, lo cual hace posible establecer estudios complementarios que resultan beneficiosos.44 Ratones atímicos desnudos han sido trasplantados con tejido tiroideo normal de seres humanos, ratas, puercos y curieles para estudiar el efecto de la TSH y de los anticuerpos tiroideos estimulantes (TSAb).46 ]]>

Los ratones SCID aceptan los xenotrasplantes de tejido humano porque ellos carecen de células B y T.47 Este tipo de ratón trasplantado con suspensiones de linfocitos de sangre periférica de pacientes con enfermedad de Graves y tiroiditis de Hashimoto, linfocitos intratiroideos y tejido tiroideo intacto han desarrollado anticuerpos IgG contra Tg y TPO.29 Por otra parte, algunos ratones SCID xenotrasplantados con tejido de pacientes de enfermedad de Graves desarrollan actividad TSAb e hipertiroxinemia transitoria.48 Sin embargo, la producción de autoanticuerpos tiroideos, incluyendo los TSAb se pierde entre 8 y 10 sem posterior al trasplante, lo cual podría relacionarse con la disminución acelerada de la función de las células T poco después de una transferencia de linfocitos.47 Otra dificultad que presentan los modelos de autoinmunidad con ratones SCID es la variabilidad entre los mismos animales.49

Se han desarrollado 2 nuevos procedimientos para inducir una respuesta autoinmune más potente en los ratones SCID:29

1. Trasplante combinado de tejido tiroideo con células mononucleares de sangre periférica o con clones de células T.
2. Xenotrasplante simultáneo de tejido tiroideo de enfermedad de Graves y células de médula ósea autólogas.

En el primer caso, aunque el tejido tiroideo trasplantado perdió y aumentó en tamaño, se desarrolló una baja respuesta de TSAb, pero detectable, y los niveles de T3 no se alteraron.50 En el segundo, se han inducido anticuerpos tiroideos, pero muy variables, incluyendo los TSAb. Además, los niveles de T4 eran más elevados en los ratones que recibieron la transferencia de linfocitos de sangre periférica, al menos en el término de 8 sem de estudio.51

Inducción por yodo

Como se expresó anteriormente, se ha visto que la cantidad de yodo administrada en la dieta incide en la presentación de las EAT. Many y otros52 demostraron que altas dosis de yodo causan cambios necróticos en la tiroides de los ratones. Estas altas concentraciones del mineral suministradas por largos períodos produjeron tiroiditis transitorias en las líneas C3H e ICR, y en los NOD (que habían sido tratados previamente con bajas dosis para inducir bocio) provocaron tiroiditis crónica.

El bocio

Constituye la dilatación no neoplásica y no inflamatoria de la tiroides, que se desarrolla en todos los mamíferos domésticos, aves y vertebrados submarinos. Los mecanismos patogénicos más importantes responsables del mismo incluyen dietas deficientes de yodo, compuestos bociogénicos que interfieren con la tiroxinogénesis, exceso de yoduro en las dietas y defectos enzimáticos y genéticos en la biosíntesis de las hormonas tiroideas.

El bocio se clasifica como: hiperplásico difuso, coloidal, por exceso de yoduro, nodular y dishormonogénico congénito.53

En los animales, de forma experimental, se han estudiado los cambios de los vasos sanguíneos (vasodilatación y proliferación de células endoteliales) los cuales son observados en ratones en los que el bocio se desarrolla de forma lenta o rápida. Para investigar la transformación del bocio hiperplásico en coloidal se han aplicado ciclos de deficiencia de yodo y resuministro, o por la administración de dosis altas (10 veces por encima de las necesidades diarias normales). La involución de este estado se ha logrado al aplicar dosis moderadas de yodo solamente o por altas dosis asociadas con el suministro de T4. El bocio coloidal se ha obtenido en algunos modelos animales mediante ciclos de deprivación y nuevo suministro de yodo, por la supresión de la secreción de TSH durante el bocio, o por el contrario administrando TSH en animales con un suplemento normal de yodo, o al dar sustancias como la difeniltiohidantoína, que produce la pérdida de la T4 y un incremento de la TSH endógena sin deficiencia de yodo o inhibición de la tiroperoxidasa.

El bocio congénito dishormonogénico ha sido encontrado en líneas de ratones mutantes algunos de los cuales se exponen en la tabla 4.54

Tabla 4. Bocio dishormonogénico congénito hipotiroideo en ratones mutantes

En los últimos años se han empleado las técnicas del xenotransplante de tejidos de bocio maligno y benigno en ratones desnudos atímicos para el estudio de esta patología en biomodelos experimentales; incluyen todas las variantes de tejido de bocio nodular benigno humano, de bocio difuso nodular, nódulos fríos y calientes o áreas de bocio y nódulos de rápido crecimiento. En gatos se han realizado trasplantes de bocio de origen tóxico con vistas a dilucidar la patogenia del hipertiroidismo.46

En conclusión, a pesar de que los modelos animales no reflejan, en todos los aspectos, las características de las disfunciones tiroideas del ser humano, las investigaciones relacionadas con las mismas resultan imprescindibles por el aporte que se obtiene en el conocimiento sobre la patogénesis, diagnóstico y tratamiento de dichas enfermedades in vivo.

Summary

Subject headings: ANIMALS, LABORATORY; THYROID DISEASES/prevention and control; THYROID DISEASES/therapy; MODELS, BIOLOGICAL.

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Recibido: 18 de abril de 2002. Aprobado: 27 de junio de 2002. ]]> Dra. Beatriz Hugues Hernandorena. Instituto Nacional de Endocrinología, Zapata y D, El Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba.

1 Médico Veterinario. Diplomado en Homeopatía Veterinaria. Responsable del Vivario del Instituto Nacional de Endocrinología.
2 Licenciado en Bioquímica. Investigador Agregado. Jefe de la Sección de Tiroides. INEN.
3 Licenciado en Biología. Investigador Agregado. INEN.
4 Licenciada en Biología. Aspirante a Investigadora. INEN.