Alteraciones histológicas por hipervitaminosis A en huesos largos de ratas Sprague Dawley recién nacidas

Histological alterations due to hypervitaminosis A in the long bones of newly born Sprague Dawley rats

Rayza Hernández Díaz, ¹ José Guillermo Sanabria Negrín, ² Isvel Zaldívar Garrit, ³ Margarita LLanuch Lara ⁴

¹ Médica. Especialista en Medicina General Integral y en Histología. Profesora Asistente. Facultad de Ciencias Médicas de Pinar del Río. Cuba. rayza@infomed.sld.cu

³ Médico. Especialista de Primer Grado en Embriología. Profesor Asistente. Universidad de Ciencias Médicas de Pinar del Río. Cuba. izvelzg@infomed.sld.cu

⁴ Médica. Especialista de Segundo Grado en Histología. Profesora Auxiliar. Universidad de Ciencias Médicas de Pinar del Río. Cuba. margarita.llanuch@infomed.sld.cu

Recibido: 4 de diciembre de 2017
Aprobado: 9 de febrero de 2018

RESUMEN

Introducción: el consumo en altas dosis de vitamina A a dosis mínima teratogénica podría ser causa posible de alteraciones histológicas del hueso durante el crecimiento intrauterino.
Objetivo: evaluar el efecto de la hipervitaminosis A inducida en ratas sobre los huesos largos de la descendencia. ]]> Método: se realizó un estudio experimental en ratas Sprague Dawley preñadas: dos grupos con tres animales c/u: control negativo y casos con dosis de VA 50 µg/g durante los primeros 16 días de preñez entre septiembre 2015 y febrero 2016. Se tomaron los fémures derechos de todas las ratas (n=12 en cada grupo) con 2 horas de nacidas. Los huesos fueron descalcificados, procesados en parafina y teñidos con hematoxilina/eosina. Se realizó morfometría de corte longitudinal de fémur derecho en el punto medio de las diáfisis del grosor del periostio, endostio, cortical y total de la diáfisis. Las variables cualitativas fueron resumidas mediante frecuencias y las cuantitativas, mediante la media y desviación estándar. Las comparaciones se verificaron mediante las pruebas de X²y T de Student al 95 % de certeza.
Resultados: tanto el grosor del periostio, como el del endostio, de la cortical y el diámetro de la diáfisis del fémur mostraron disminuciones altamente significativas (p<0.0001) en la comparación de medias entre los grupos de estudio y control. El cartílago endocondral aumentado, y la dilatación de los vasos medulares fueron más frecuente entre los casos (p<0.0001).
Conclusiones: la hipervitaminosis A durante la preñez en ratas Sprague Dawley reduce el tamaño del fémur en la descendencia.

DeCS: VITAMINA A: HIPERVITAMINOSIS A; RATAS; HUESOS.

ABSTRACT

Introduction: the consumption in high doses of vitamin-A at a minimum teratogenic dose could be a possible cause of histological alterations of bones during intrauterine growth.
Objective: to assess the effect of hypervitaminosis A induced in rats on the long bones of offspring.
Method: an experimental study was conducted on pregnant Sprague Dawley rats: two groups with three animals each: negative control and cases with VA dose 50 μg / g during the first 16 days of pregnancy between September 2015 and February 2016. The right femurs of all rats were taken (n = 12 in each group) 2 hours after birth. The bones were decalcified, processed in paraffin and stained with haematoxylin / eosin. Longitudinal section morphometry of the right femur was performed at the midpoint of the diaphysis of the thickness of the periosteum, endosteum, cortical and total of the diaphysis. The qualitative variables were summarized by frequencies and the quantitative using the mean and standard deviation. The comparisons were verified by X₂ and Student's-T tests at 95 % certainty.
Results: thickness of the periosteum and endosteum, cortex thickness, and diaphysis of the femur showed highly significant decreases (p <0.0001) when comparing the means between the study and control groups. Increased endochondral cartilage and dilation of medullar vessels were more frequent among cases (p <0.0001).
Conclusions: hypervitaminosis A during pregnancy in Sprague Dawley rats reduces the size of the femur in offspring.

INTRODUCCIÓN

La vitamina A (VA, retinol) es un micronutriente esencial, que solamente puede obtenerse de la dieta, ya que ningún animal tiene la capacidad para la síntesis de novo. ⁽¹⁾ Cumple varias funciones en el organismo, pero su naturaleza liposoluble y su larga semivida biológica favorecen ciertos rasgos tóxicos. ⁽²⁾

Tanto su carencia como la hipervitaminosis A (HVA) constituyen problemas de salud. La HVA se está transformando en un problema clínico de frecuencia creciente y de alto riesgo en diversos países desarrollados y no desarrollados, debido a la automedicación y al exceso de prescripción. ^{(2, 3)}

Con el interés actual en incrementar los estilos de vida saludables y la disponibilidad de la VA en alimentos y medicamentos, existe potencial para que la toxicidad por esta vitamina pueda volverse un problema en el transcurso de la vida. El consumo elevado de formas de retinol se puede proponer como una gran amenaza. ⁽⁴⁾

Se conoce que una de las funciones más importantes de la VA es el mantenimiento estructural y funcional de las células. Incluso en el hueso media numerosas funciones celulares, sin embargo, se ha reconocido por mucho tiempo que el aumento en los niveles de esta vitamina tiene efectos deletéreos en este componente del sistema osteomioarticular, produciendo aumento en la fragilidad del esqueleto. Y se ve más afectada la función osteoblástica, por lo que en una persona adulta puede causar fracturas espontáneas, y en los fetos afecta de manera significativa el desarrollo óseo. ^{(5, 6)}

A pesar de conocerse las malformaciones inducidas por HVA en los fetos, se describen muy pocos defectos óseos por esta causa, y son muy escasos además los estudios sobre las alteraciones tisulares del hueso que puedan presentarse en estos casos.

Al revisar la bibliografía sobre vitamina A y su relación con el crecimiento óseo en la vida prenatal y las alteraciones histológicas que puedan presentarse, se encontró que en Cuba y específicamente en Pinar del Río no se han realizado investigaciones experimentales relacionadas con la influencia que ejerce este micronutriente sobre la histología del hueso. Entonces ¿cómo contribuir al conocimiento y la integración básica clínica en la relación entre la hipervitaminosis A en el embarazo y las alteraciones tisulares del hueso?

MÉTODO

Se realizó un estudio de paradigma cuantitativo, experimental, prospectivo en el tiempo, transversal en la observación y determinaciones, de casos y controles en un modelo animal de ratas Sprague Dawley.

El estudio fue conducido y se rigió por lo establecido en la Guía de Buenas Prácticas para el Cuidado, Uso, y Reproducción de los Animales para la Experimentación del CENPALAB. ⁽⁷⁾

Todas las hembras fueron alojadas en grupos de tres por caja (cajas T2) y los machos a razón de dos por caja (cajas T3). Antes del apareamiento los machos fueron ubicados individualmente en cajas T2. Posterior al apareamiento, las hembras presuntamente preñadas, se alojaron a razón de una por caja (cajas T2) hasta el final del estudio. Todas las cajas son plásticas con tapa de rejilla (INPUD)y se ubicaron en estantes. Se mantuvieron con encamado de bagazo de caña desmeollado, esterilizado en autoclave (POT 01.01.05.003) en la Dirección de Animales Gnotobióticos de la institución previamente mencionada.

Para el estudio se utilizaron seis hembras que fueron seleccionadas y distribuidas aleatoriamente en los dos grupos de tratamiento, empleando el programa LABTOOLS, ⁽⁸⁾ constituidos cada uno de la siguiente manera: tres hembras preñadas en cada grupo. En el control no se suministró ninguna sustancia adicional a la dieta normal, y en el grupo experimental se suministró vitamina A (50 µg/g de peso corporal) desde el día cero hasta el día 16 de la gestación, una sola vez al día, a las 9:00 am.

Se sacrificaron todos los animales en el primer día de nacidos. Para ellos los mismos fueron narcotizados con éter dietílico.

Se tomaron los fémures derechos de todas las ratas, identificados por cada grupo de estudio. Los huesos fueron descalcificados en solución ácida Osteosof^R alrededor de 15 días hasta su total reblandecimiento lo que permitió la preparación hística.

Para arrastrar todo el ácido descalcificador se trató el tejido con abundante agua y se comenzó la fijación en formalina tamponada al 12 % por no más de 24 horas, más tarde se trataron con alcoholes a concentraciones crecientes, se aclararon con xilol para procesarlos por el método de inclusión en parafina y al final obtener los cortes hísticos mediante micrótomo con cuchilla de acero. Los portaobjetos de vidrio con el tejido fueron teñidos mediante la técnica de rutina de hematoxilina/eosina.

La morfometría se realizó en los portaobjetos de vidrio que contenían el corte de hueso descalcificado, y teñido con hematoxilina y eosina. Los cortes se examinaron con un microscopio óptico MOTIC y se realizaron fotos a 40x con la cámara digital MOTICAM 3, conectado a un ordenador para la recogida de estas imágenes, utilizando el software MOTIC para análisis morfométrico de las imágenes a una magnificación de 2500 y cámara de 3MP entre 2048 x 1536 pixeles.

Se realizaron cortes longitudinales en los fémures derechos de todas las ratas estudiadas y en el punto medio de las diáfisis se midió el grosor del periostio, endostio, cortical y grosor total de la diáfisis. Se buscó el punto de mayor grosor a razón de una medición por fémur derecho de la rata recién nacida.

Las variables utilizadas fueron:

Cuantitativas: grosor del periostio, de la cortical, del endostio, y el grosor total de la diáfisis, medidas en µm.

Cualitativas: Prominencia o no del cartílago metafisario y dilatación o no de los vasos medulares.

Las variables cualitativas fueron resumidas mediantes frecuencias absolutas y relativas porcentuales, Las cuantitativas, además, mediante la media y la desviación estándar, y en caso de no normalidad mediante la mediana y el intervalo intercuartílico.

Las medias se compararon mediante la prueba de la T de Student previa verificación de homocedasticidad con la prueba F de Levene. De no resultar homocedásticas se empleó la prueba T´. Las frecuencias se compararon mediante la prueba de X²y se utilizó la prueba de Odds ratio para mediar la fuerza de la asociación entre las variables en consideración en casos y controles. En todos los casos el nivel de confianza fue del 95 %.

El ensayo fue conducido y se rigió por lo establecido en la Guía de Buenas Prácticas para el Cuidado, Uso, y Reproducción de los Animales para la Experimentación según las normas del CENPALAB ⁽⁷⁾, así como la realización de la eutanasia en animales de experimentación.

Tanto el grosor del periostio, como el del endostio, de la cortical y el diámetro de la diáfisis del fémur mostraron diferencias altamente significativas en la comparación de medias entre los grupos de tratamiento. (tabla 1)