Efecto in vitro de siete fungicidas químicos sobre Beauveria bassiana (Bals.) Vuil.

Effect in vitro of Seven Chemical Fungicides on Beauveria bassiana (Bals.) Vuil.

Leónides Castellanos González,¹ Berta Lina Muiño García,² María E. Lorenzo Nicao,³ Ana Rodríguez Fernández³ y Medardo Gómez Albernal³

¹Centro de Estudio para la Transformación Agraria Sostenible, Universidad de Cienfuegos. Carretera a Rodas Km 3, Cuatro Caminos, Cienfuegos, Cuba, lcastellanos@ucf.edu.cu.
²Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, La Habana, C.P. 11600.
³Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera a Palmira Km 4, Cienfuegos, Cuba.

Se estudió el efecto in vitro de siete fungicidas sobre el hongo entomopatógeno Beauveria bassiana cepa LBb-1. (Bals) Vuil. a concentraciones de los fungicidas de 10, 100, 200, 500, 1000 y 2000 mg • L^_1. Se evaluó la inhibición del crecimiento de la colonia del hongo, el efecto sobre la capacidad esporulativa y la germinación de los conidios. La DL-50 y la DL-95 del fungicida tebuconazol se estimaron por debajo de 10 mg • L^_1. La DL-50 para difenoconazol se estimó en 30,45 mg • L^_1, para mancozeb en 161,49 mg • L^_1, para azoxystrobin en 1463,11 mg • L^_1 y para folpet en 398,92 mg • L^_1. Para óxido cuproso y zineb la DL-50 fue > 2000 mg • L^_1.La DL-95 para difeconazol se estimó en 1019,04 mg • L^_1, mientras que para el resto de los fungicidas se estimaron por encima de 2000 mg • L^_1. Tebuconazol se clasificó como tóxico para Beauveria bassiana por la escala de la OILB, mientras que el resto se clasificaron como ligeramente tóxicos. Los siete fungicidas estudiados se clasificaron como muy tóxicos para el hongo entomopatógeno de acuerdo con su valor T, y no fueron compatibles con este. No se observó germinación de los conidios de Beauveria bassiana a ninguna de las concentraciones ensayadas de tebuconazol, difenoconazol, mancozeb, azoxystrobin y folpet, pero sí frente a zineb y óxido cuproso hasta 1000 mg • L^_1 y 2000 mg • L^_1, respectivamente.

Palabras claves: fungicidas, hongos entomopatógenos, toxicidad, Beauveria bassiana.

ABSTRACT

The effect of seven fungicides on the entomopathogen fungus Beauveria bassiana strain LBb-1. (Bals) Vuil.) was studiedin vitro with fungicides concentrations of 10, 100, 200, 500, 1000 and 2000 mg • L^_1. The inhibition of fungus colony growth, the effect on spore production capacity and conidia germination were evaluated. DL-50 and the DL- 95 of fungicide tebuconazol were considered below 10 mg • L^_1. DL-50 for difenoconazol was considered in 30.45 mg • L^_1, for mancozeb it was 161.49 mg • L^_1, for folpet it was 398.92 mg • L^_1 and for azoxystrobin it was 1463.11 mg • L^_1. DL-50 for copper oxide and zineb were > 2000 mg • L^_1. DL-95 for difeconazol was considered as 1019.04 mg • L^_1, while for the rest of the fungicides it was considered above 2000 mg • L^_1. Tebuconazol was classified as toxic for Beauveria bassiana by the OILB scale, while the rest were classified as lightly toxic. The seven studied fungicides were classified as very toxic for the fungus according to their T value, and they were not compatible with this. Conidia germination of Beauveria bassiana were not observed in none of tebuconazol, difenoconazol, mancozeb, azoxystrobin and folpet concentrations assayed, while in front of zineb and copper oxide they germinated up to 1000 mg • L^_1 and 2000 mg • L^_1, respectively.

Key words: fungicides, entomopathogen fungi, toxicity, Beauveria bassiana.

INTRODUCCIÓN

Los bioplaguicidas constituyen un importante medio de control biológico de plagas en la agricultura, con probada efectividad en muchos países [Batista, 1997]. El grupo más importante de hongos entomopatógenos son los deuteromicetos u hongos imperfectos, en los cuales se desconoce la fase sexual. Los géneros más importantes son Beauveria, Verticillium, Metarhizium, Hirsuthella y Paecilomyces [Fernandez-Larrea, 2001]. El hongo Beauveria bassiana (Bals.) Vuil. se ha estudiado como agente de control de insectos plaga pertenecientes a diferentes órdenes. En cultivos de la agricultura urbana [Minag, 2007] lo recomendaron para el control de varias especies de crisomélidos que afectan a muchos cultivos hortícolas. Por otra parte, numerosas enfermedades afectan los cultivos sembrados en canteros en organopónicos y huertos intensivos [Castellanos et al., 2005], las cuales requieren del empleo de fungicidas químicos para su control, que pueden afectar los hongos entomopatógenos que se aplican para el control de insectos plaga. Entre los fungicidas que se recomiendan para el control de enfermedades fúngicas en la agricultura urbana se encuentran difenoconazol, oxicloruro de cobre, mancozeb, zineb, azoxystrobin, matalaxyl y azufre [Minag, 2007]. Estos están autorizados en muchos cultivos en Cuba donde se realizan tratamientos con hongos entomopatógenos, entre ellos con B. bassiana [CNSV, 2005]. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de siete fungicidas que se recomiendan para el control de enfermedades en diferentes cultivos en Cuba sobre el hongo entomopatógeno Beauveria bassiana. ]]>

MATERIALES Y MÉTODOS

Se seleccionaron siete fungicidas de diferente grupo químico, los cuales se emplean con frecuencia para el control de enfermedades fúngicas en cultivos hortícolas tanto en la agricultura urbana como en áreas rurales, según recomendaciones del Centro Nacional de Sanidad Vegetal [CNSV, 2005].

Se empleó para los ensayos al hongo entomopatógeno Beauveria bassiana cepa LBb-1, obtenido de la colección del Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal de Cienfuegos. Esta cepa se conservó a 9°C en tubos sobre el medio de cultivo agar-Sabouraud-dextrosa.

Las soluciones de los fungicidas se prepararon en agua previamente esterilizada a partir de una solución madre de 5000 mg • L^_1 i.a. de cada producto, de la cual derivaron las diluciones de menor concentración.

Los medios se envasaron en erlermeyers y se esterilizaron en una autoclave por 15 min a 121°C, luego se dejaron enfriar hasta 45°C y se añadieron las cantidades correspondientes de las soluciones de cada fungicida, hasta obtener el rango de concentraciones de estudio de 10, 100, 200, 500, 1000 y 2000 mg • L^_1. Posteriormente se extendieron en placas de Petri de 9 cm de diámetro, sobre las que se ubicaron discos de 0,5 cm de diámetro de los cultivos del hongo de cinco días de edad. Se incluyó una variante con medio de cultivo sin adicionar fungicida como testigo, y cada variante se replicó cinco veces. Las placas se incubaron a 27°C en la oscuridad, y la evaluación se realizó a los diez días, la cual consistió en medir el diámetro de la colonia del hongo en milímetros. Con los datos obtenidos se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento mediante la fórmula de Abbot [Ciba Geygi, 1981].

Se determinaron los valores de DL-50 y DL-95 según la curva dosis del fungicida-porcentaje de inhibición del crecimiento del hongo a los diez días de iniciado el ensayo, para lo cual se trabajó con un nivel de probabilidad de error del 5%.

Se clasificó la toxicidad del fungicida por los valores de inhibición del crecimiento de la colonia a los diez días a la dosis de campo de cada producto [CNSV, 2005], en una solución final de 400 L • ha_1, con la escala de la Organización Internacional de Lucha Biológica (OILB) [Viñuela et al., 1993]. ]]>

Para medir el efecto de cada fungicida sobre la capacidad esporulativa (conidiogénesis) se prepararon los medios de forma similar a como se describió anteriormente. La evaluación se inició a partir de los tres días y finalizó a los diez, y se enfatizó en la última evaluación para hacer las comparaciones. El parámetro medido como indicador del efecto fungicida fue la intensidad de esporulación, para lo cual se tomó un disco de 0,5 cm de diámetro del hongo por placa por día y se colocó en 2 mL de agua destilada estéril con tween al 0,01%. Se agitó reiteradamente la suspensión y más tarde se realizaron los conteos (conidios por centímetro cuadrado) en la cámara de Neubauver.

La compatibilidad de cada fungicida con el hongo entomopatógeno se calculó según el valor T propuesto por Alves et al. (1998), y se emplearon los dos indicadores evaluados anteriormente: porcentaje de inhibición del crecimiento y el efecto sobre la capacidad esporulativa a través de la fórmula

T = 20 [CV] + 80 [ESP] / 100

donde:

T: Valor corregido para la clasificación del producto

CV: Porcentaje de crecimiento vegetativo con relación al testigo

ESP: Porcentaje de esporulación con relación al testigo.

Los valores de T se clasificaron según la escala establecida como:

]]> Se determinó el efecto de cada fungicida sobre la germinación del hongo entomopatógeno, para lo cual se emplearon portaobjetos, sobre los que se colocaron 0,5 mL del medio de cultivo envenenado con las diferentes concentraciones de cada fungicida; luego se le añadió 0,1 mL de una suspensión conidial de 108 conidios/mL del hongo y se incubaron a 27°C en la oscuridad. Se utilizaron cinco portaobjetos (réplicas) por variante, los cuales se mantuvieron en cámaras húmedas dentro de placas de Petri. El porcentaje de germinación se determinó a las 16 y 24 h por medio de un microscopio óptico. Se contaron 100 conidios por cada réplica.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tebuconazol presentó el 100% de inhibición del crecimiento micelial de Beauveria bassiana a todas las concentraciones del fungicida en estudio, con diferencia estadística siempre con el resto, excepto a la concentración de 2000 mg • L^_1, en que difenoconazol también manifestó el 100% de inhibición (Tabla 1). Le siguió en segundo orden difenoconazol, que presentó siempre diferencia estadística con el resto de los fungicotas, excepto con mancozeb a 10 mg • L^_1, concentración a la que ambos fungicidas presentaron similares niveles de inhibición del crecimiento del hongo.

Zineb resultó ser el fungicida de menor efecto inhibitorio sobre el crecimiento micelial de Beauveria bassiana, y manifestó siempre diferencia estadística con el resto de los fungicidas. Mancozeb y folpet resultaron intermedios, seguidos de azoxystrobin y óxido cuproso, al manifestar niveles de inhibición del crecimiento micelial que a veces diferían estadísticamente y otras no.

La DL-50 y la DL-95 del fungicida tebuconazol se ubicaron fuera del rango de concentraciones ensayadas, por ser muy inferiores a 10 mg • L^_1. La DL-50 para difenoconazol se estimó en 30,45 mg • L^_1, para mancozeb en 161,49 mg • L^_1, para azoxystrobin en 1463,11 mg • L^_1 y para folpet en 398,92 mg • L^_1. Para óxido cuproso y zineb la DL-50 fue > 2000 mg • L^_1. La DL-95 para difeconazol se estimó en 1019,04 mg • L-1, mientras que para el resto con excepción, del tebuconazol, al cual se había hecho referencia ya, se estimaron por encima de 2000 mg • L^_1., lo que evidencia que estos fungicidas triazólicos afectan mucho más que el resto el crecimiento micelial de B. bassiana ( Tabla 2 ).

Todos los fungicidas químicos estudiados manifestaron algún nivel de toxicidad con respecto a la inhibición del crecimiento micelial sobre Beauveria bassiana cepa LBb-1, aunque tebuconazol fue el más destacado en este sentido, por lo que se clasificó como tóxico por la escala de la OILB, mientras que el resto se ubicó en la clasificación de ligeramente tóxico. De acuerdo con esta clasificación, aunque seis fungicidas se ubicaron en la categoría como ligeramente tóxicos, el de menor toxicidad, entre ellos, sería zineb, que solo manifestó el 36,9% de inhibición del crecimiento micelial a la dosis de campo (2000 mg • L^_1), y cuya DL-50 estuvo por encima de ese valor, lo cual ocurrió también para el óxido cuproso (Tabla 3).

]]> Los fungicidas triazólicos difenoconazol y tebuconazol inhibieron totalmente la producción de las conidios de Beauveria bassiana a todas las concentraciones en estudio, lo que ocurrió de forma similar para mancozeb, excepto a 10 mg • L^_1, donde ocurrió la conidiogénesis, pero con una disminución sensible en la producción de esporas con respecto al testigo (Tabla 4). El hongo entomopatógeno esporuló a todas las concentraciones ensayadas de óxido cuproso y de azoxystrobin; sin embargo, la conidiogénesis no se produjo en el medio envenenado con folpet a 500, 1000 y 2000 mg • L^_1, y con zineb a 2000 mg • L^_1.

Es de señalar que en los medios de cultivos envenenados con azoxystrobin y óxido cuproso se produjo una estimulación de la conidiogénesis de Beauveria bassiana, y aunque el hongo siempre esporuló frente a estos fungicidas a partir de 100 mg • L^_1, se observó una disminución de la producción de conidios en la medida en que aumentó la concentración del producto con respecto a testigo sin envenenar (Tabla 5). Para los fungicidas folpet, mancozeb y zineb, en todos los casos en que se produjo la conidiogénesis se manifestó una reducción notable de la producción de conidios con respecto al testigo.

Es importante señalar que zineb, que manifestó menor efecto sobre el crecimiento micelial del hongo y la DL-50 más alta, no permitió su esporulación a la dosis de campo, mientras que azoxystrobin sí consintió que Beauveria bassiana esporulara a una concentración cuatro veces por encima de su dosis de empleo en campo (500 mg • L^_1), lo cual sería interesante comprobar bajo estas condiciones. Para el caso de óxido cuproso se produjo la conidiogénesis del hongo a la dosis de campo, aunque solo con una de la producción de conidios que representó el 22% de la que se observó en el testigo sin envenenar.

Los siete fungicidas estudiados se clasificaron como muy tóxicos para Beauveria bassiana cepa LBb-1, de acuerdo con su valor T. Óxido cuproso y azoxystrobin reportaron los valores T más altos, pero no sobrepasaron el valor de 30, por lo se que consideran muy tóxicos (Tabla 6).

No se observó germinación de los conidios de Beauveria bassiana a ninguna de las concentraciones ensayadas de tebuconazol, difenoconazol, mancozeb, azoxystrobin y folpet. Los conidios del hongo solo germinaron frente a zineb hasta 1000 mg • L^_1 (valor inferior a la dosis de campo) y frente a óxido cuproso a todas las concentraciones. Es importante destacar que a la dosis de empleo en el campo delóxido cuproso se observó el 99% de germinación (Tabla 7).

Los presentes resultados indican que debe tenerse extremo cuidado al aplicar estos fungicidas en áreas sometidas a tratamientos con Beauveria bassiana, ya que todos afectaron el creciendo micelial del hongo, la conidiogénesis (aunque azoxystrobin y óxido cuproso lo hicieron en menor medida) y la germinación de los conidios (con excepción del óxido cuproso). Tebuconazol se clasificó como tóxico, y difenoconazol, mancozeb, azoxystrobin, óxido cuproso, zineb y folpet como ligeramente tóxicos, según la escala de la OILB [Viñuela et al., 1993], mientras que según el valor T [Alves et al., 1998], todos los fungicidas se clasificaron muy tóxicos, y por lo tanto incompatibles con B. bassiana. Resultó de interés la baja afectación de óxido cuproso sobre la germinación de los conidios del hongo, lo cual pudiera dar la posibilidad de aplicar el entomopatógeno después de tratamientos con el fungicida con un riesgo mínimo de afectar la germinación de los conidios, pero con un riesgo grande de que se afecten las colonizaciones anteriores del entomopatógeno. ]]> No se han encontrado trabajos del efecto de fungicidas sobre B. bassiana en Cuba, pero sí en Lecanicillium lecanii [Muiño y Larrinaga, 1998] y Trichoderma spp. [Muiño et al., 2001]. Sobre este último los fungicidas menos tóxicos resultaron oxicloruro de cobre y zineb, tendencia observada también en la presente investigación con zineb y óxido cuproso. Por otra parte, el herbicida Quizolofop-p etilo resultó ligeramente tóxico sobre Beauveria bassiana cepa LBb-1 y Lecanicillium lecanii cepa Y-57, dos hongos entomopatógenos que se emplean en el cultivo de la papa en Cuba, según la escala de la OILB, mientras que según el valor T, este herbicida se clasificó como compatible para Lecanicillium lecanii y muy tóxico para Beauveria bassiana, lo que da una medida de la alta sensibilidad de este último

hongo entomopatógeno a los químicos [Castellanos et al., 2008]. Siete fungicidas evaluados frente a Beauveriabassiana resultaron muy tóxicos a este hongo entomopatógeno, mientras que de ellos solo cinco alcanzaron esta categoría frente a Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok., lo cual también evidenció mayor efecto de los fungicidas sobre el primero [Loureiro et al., 2002].

Loureiro et al. (2002) clasificaron a tebuconazol y mancozeb como muy tóxicos sobre Beauveria bassiana por obtenerse con ellos valores de T = 0, lo que discrepa de los presentes resultados para el último fungicida por el valor alcanzado, pero no por la clasificación obtenida. Óxido cuproso y folpet fueron clasificados también por los mismos autores como muy tóxicos al alcanzar valores T de 10,30 y 27,32, respectivamente, con lo cual coincide la clasificación obtenida en el presente estudio.

Siete fungicidas evaluados por Loureiro et al. (2002) frente a Beauveria bassiana resultaron muy tóxicos a este hongo entomopatógeno, mientras que de ellos solo cinco alcanzaron esta categoría frente a Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok., lo que evidenció mayor efecto de los fungicidas sobre el primero.

Ante la necesidad que se presenta en ocasiones de hacer tratamientos foliares con fungicidas químicos contra las enfermedades en organopónicos y huertos intensivos [Minag, 2002, 2007] y también en muchos cultivos hortícolas en áreas donde se realizan tratamientos con Beauveria bassiana, deben tenerse en cuenta los presentes resultados, y evitar los tratamientos con difenoconazol y tebuconazol, que aunque son más efectivos contra los hongos fitopatógenos, tienen mayor nivel de toxicidad sobre este entomopatógeno, a pesar de ser sistémicos, selectivos y aplicarse a bajas dosis, y se debe utilizar azoxystrobin, que fue el de menor efecto negativo, o priorizar los fungicidas de contacto. Entre estos últimos debe priorizarse el empleo de óxido cuproso, sobre todo si es de origen mineral y está autorizado para la producción orgánica, y en segunda instancia a zineb, que evidenció menor inhibición sobre el crecimiento micelial del hongo, la conidiogénesis y la germinación de los conidios que mancozeb y folpet.

CONCLUSIONES

• Tebuconazol se clasificó como tóxico para Beauveria bassiana cepa LBb-1 por la escala de la OILB, mientras que difenoconazol, mancozeb, azoxystrobin, folpet, óxido cuproso y zineb se clasificaron como ligeramente tóxicos.

• Los siete fungicidas estudiados se clasificaron como muy tóxicos para Beauveria bassiana cepa LBb-1 de acuerdo con su valor T, y no son compatibles con el hongo entomopatógeno.

• No se observó germinación de los conidios de Beauveria bassiana a ninguna de las concentraciones ensayadas de tebuconazol, difenoconazol, mancozeb, azoxystrobin y folpet, pero sí frente a zineb y óxido cuproso hasta 1000 mg • L^_1 y 2000 mg • L^_1, respectivamente. ]]>

REFERENCIAS

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Recibido: 23/2/11
Aceptado: 28/3/11 ]]> 1998 217-238 1997 59 2 2 79-86 2005 2008 12 1 1 45-50 Ciba Geigy 1981 2.a ed CNSV Minag^dDepartamento Registro de Plaguicidas, CNSV 2005 Inisav 2001 2002 31 2 2 263- 269 Minag 2000 Minag 2007 1998 2 1-2 1-2 33-35 2001 5 2 2 3-9 1993 45 18-25