ARTÍCULO ORIGINAL

Bacterias degradadoras de pesticidas organofosforados presentes en suelos contaminados

Organophosphorus pesticides degrading bacteria present in contaminated soils

Dra. Beatriz E. Jaramillo Colorado, Dra. Adriana Bermúdez Tobón, M.Sc. Irina Tirado Ballestas

RESUMEN

Se realizó la caracterización de bacterias degradadoras de compuestos organofosforados de tres submuestras de un terreno contaminado por pesticidas, ubicado en la zona suroriental de la ciudad de Cartagena de Indias–Bolívar, Colombia. Estas muestras se homogenizaron y trataron como una sola muestra, una parte se empleó para la extracción de pesticidas y la segunda fracción del suelo se expuso a una concentración conocida de un pesticida organofosforado, monocrotofós (200 ppm) por 30 días. Se aislaron, de la muestra de suelo, las bacterias con capacidad para desarrollarse en medio altamente selectivo para pesticidas organofosforados y se identificaron bioquímicamente usando el kit BBL Crystal^©. El crecimiento bacteriano fue confirmado por medio de espectroscopia UV-VIS del medio líquido M9, y la verificación de la degradación del pesticida fue realizada por medio de Cromatografía de gases acoplada a detector de ionización en llama. De acuerdo con el estudio a nivel molecular del gen ribosomal 16S, se pudo determinar que las tres cepas bacterianas aisladas de los suelos (C1, C2 y C3) pertenecen a la familia Enterobacteriaceae. Estas especies demostraron su capacidad para la degradación de pesticidas organofosforados.

Palabras clave: suelo, organofosforado, biodegradación, metabolismo, bacterias.

ABSTRACT

Characterization of Organophosphorus degrading bacteria present at three subsamples in soils from a contaminated land by pesticides, at southeast of Cartagena de Indias-Bolivar, Colombia. These samples were homogenized and treated as a single sample, one part was separate for pesticide extraction and the second one was subject to monocrotophos (200 ppm) for 30 days. Bacteria capable to develop in a highly selective media with Organophosphorus were isolated and biochemically identified by using BBL Crystal©kit. Bacterial growing was confirm by means of UV-VIS spectroscopy of M9 liquid medium, and verification of Organophosphorus bacterial degradation was perform by gas chromatography coupled flame ionization detector. According to the study at the molecular level of ribosomal gene 16S, it was determined that the three bacterial strains isolated from soil (C1, C2 and C3) belong to the family Enterobacteriaceae. These species showed their ability to degrade organophosphorus pesticides.

Key words: soil, organophosphorus, biodegradation, metabolism, bacteria.

INTRODUCCIÓN

Los compuestos químicos organofosforados (OF), fueron desarrollados durante la década de los años cincuenta y usados como “gases nerviosos”, durante la Segunda Guerra Mundial (de Silva et al., 2006). Actualmente, se les reconoce principalmente por su utilización en la agricultura como fertilizantes e insecticidas, existiendo en el mercado aproximadamente cincuenta mil tipos de estos compuestos (Eddleston et al., 2012; Zhang et al., 2014). Debido al uso indiscriminado e irresponsable de los OF en agroindustria, existe un alto índice de intoxicaciones agudas caracterizadas por el desarrollo del síndrome colinérgico y múltiples complicaciones crónicas, matando al menos a 400.000 personas anualmente a nivel mundial (Eddleston y Phillips, 2004; Eddleston et al., 2012).

Colombia ocupa el tercer puesto en América Latina en el uso de plaguicidas después de Brasil y México. De acuerdo con la Food and Agricultural Organization (FAO), la agroindustria colombiana constituye el 40% de la fuerza laboral y representa el 50% de las divisas nacionales (Bruinsma y FAO, 2003). Por lo que, por ejemplo, durante el año 2002, el empleo de agroquímicos de tipo plaguicida o fertilizante superó los 28 millones de kilogramos de los cuales el 97% correspondieron a insecticidas (principal menteorgano fosforados y carbamatos) seguidos por herbicidas y fungicidas (Alegrett, 2002; Mojica y Guerrero, 2010). Uno de los problemas asociados al uso de OF es que dada su efectividad, se abusa de los productos y no se tiene un manejo adecuado de las sustancias o sus residuos, ocasionando un problema de salud pública (MAVDT, 2006; Murcia y Stashenko, 2008). En los años 2008 y 2009 la Corporación Autónoma Regional del Sur de Bolívar (CSB) realizó un monitoreo de la zona costera de la región Caribe, encontrando compuestos plaguicidas en las aguas costeras y sedimentos, por encima del límite de detección¹. Un caso grave, debido a la magnitud del daño ambiental, fue documentado por el Grupo de Epidemiología y Salud Poblacional de la Universidad del Valle, en el cual, en una localidad de Cartagena de Indias (Ciudadela 2000), fueron hallados plaguicidas enterrados sobre la margen derecha de la Troncal de Occidente, afectando 4 barrios y un colegio² (MAVDT, 2006).

Dado el impacto de la contaminación por OF en nuestro país, se requiere el uso de técnicas que mitiguen el impacto de este tipo de contaminantes en suelos y fuentes hídricas (Das y Adhya, 2015) O-diethyl O-(3,5,6-trichloro-2-pyridinol. Una de las técnicas empleadas para reducir los OF en el medio ambiente, es la biorremediación bacteriana (Abraham et al., 2014). Ésta, utiliza microorganismos capaces de degradar compuestos químicos complejos por medio de diversas rutas metabólicas bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas (Cycoń et al., 2009; Marín y Jaramillo, 2015). Lo que conlleva a obtener altas tasas de eficiencia y eficacia a bajos costos en la reducción del nivel de contaminación por OF.

En Cartagena de Indias, se realizó la confirmación cualitativa de la presencia de compuestos OF en los suelos contaminados de la localidad Ciudadela 2000 y se aislaron cepas bacterianas autóctonas. Posteriormente se caracterizaron bioquímica y molecularmente aquellos microorganismos seleccionados en M9 (medio altamente selectivo) con OF como única fuente de carbono.

MATERIALES Y MÉTODOS

Las muestras de suelos fueron colectadas en el Lote Santa Elena, localizado en la salida del municipio de Cartagena hacia Turbaco, sobre la margen derecha de la Troncal de Occidente, Cartagena, Bolívar, Colombia. La toma de muestras se realizó de acuerdo con la metodología propuesta por Hudson (1982), que recomienda un muestreo en zigzag, a una profundidad de 20 cm, con mezcla del suelo y almacenamiento en bolsas limpias y gruesas para transporte. Una vez colectadas las muestras fueron llevadas al laboratorio y almacenadas a 4 °C.

Extracción. Para realizar el análisis cromatográfico de las muestras, cada una de ellas fue sometida a extracción Soxhlet (Klute y Page, 1982). Para este paso se tomaron 5 a 10 g de muestra, se adicionó sulfato de sodio anhidro (Na₂SO₄) hasta desecar completamente la mezcla. Posteriormente se colocó el preparado en un cartucho de celulosa impregnado con una solución de acetona–hexano (1:4) por 20 horas. Al finalizar, la muestra se concentró mediante el uso de un rota evaporador hasta llevarla a un volumen final de 5 mL y luego con corriente de N₂ hasta un volumen de 1 mL.

Tratamiento Microbiológico. Una parte de las muestras de suelo colectadas fue utilizada para lograr la expresión del metabolismo degradador de OF, de acuerdo con lo recomendado por Cycoń et al. (2009). Primero se realizó una dilución de Monocrotofós a 200 ppm, de esta dilución se tomaron 20 mL y se impregnaron 300 g de suelo colectado, se dejó secar y se colocaron en oscuridad a 30 °C por 30 días.

Se tamizaron 300 g de suelo tratado con monocrotofos utilizando una malla de 2 mm. Luego fue adicionado 1g del tamizado en 9 mL de agua destilada estéril. Esta dilución fue la base para la realización de soluciones sucesivas de 10^-1 a 10^-4 utilizando como solvente medio mínimo M9 con monocrotofos como única fuente de carbono (Fernández et al., 2005).

La solución de medio mínimo M9 (con un contenido de monocrotofos a 200 ppm) fue preparada con Fosfato ácido de sodio hidratado (6 g), Fosfato ácido de potasio (3 g), Cloruro de amonio (4 g), Cloruro de sodio (0,5 g), Sulfato de manganeso hepta hidratado (0,25 g), Cloruro de calcio hidratado (0,0168 g), Patrón de monocrotofos (0,2 g) y se completó a 1L con agua destilada y agitación constante (Elbing y Brent, 2002). El pH se ajustó a 7-7,2 con ácido clorhídrico 1 N e hidróxido de sodio 5 N y se refrigeró hasta su utilización. De la solución de medio mínimo M9 se prepararon 16 medios de fase sólida utilizando agar-agar, siguiendo las indicaciones dadas por el fabricante.

Para el aislamiento de microorganismos bacterianos con capacidad de crecimiento en medio mínimo M9 fue realizada una siembra masiva del suelo diluido en agar nutritivo. Luego, el mismo fue llevado a incubación por 1 semana a una temperatura de 36°C±1.Una vez se comprobó el crecimiento de las colonias, las más grandes y con mejores cualidades organolépticas fueron inoculadas en el medio líquido M9.Transcurrida una semana, después de la siembra de las colonias en la matriz líquida de medio M9, se verificó el crecimiento bacteriano mediante la espectrofotometría Ultravioleta Visible (UV/VIS) y se realizaron lecturas consecutivas durante cuatro días siguientes.

Para la identificación, las colonias bacterianas aisladas en medio sólido M9 fueron tomadas y repicadas en tres oportunidades en agar nutritivo utilizando la técnica por agotamiento y garantizar así el aislamiento de cada una. Después del tercer repique, las colonias fueron sometidas a tinción de Gram y sembradas en kits de identificación bacteriana por métodos bioquímicos BBLCrystal©.

Las colonias aisladas, purificadas y caracterizadas bioquímicamente, fueron genotipificadas, mediante la amplificación del gen ribosomal 16S por medio de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y la secuenciación de un fragmento de 1465 pb. Una vez obtenidas las secuencias de los fragmentos se ensamblaron y compararon con las secuencias depositadas en las bases de datos de NBCI (National Center For Biotechnology Information) y RDP (Ribsomal Database Project). Procedimientos realizados comercialmente por CORPOGEN (Bogotá-Colombia).

Validación de la degradación del pesticida OF por acción bacteriana. La verificación de la actividad degradadora de las bacterias aisladas e identificadas, fue realizada mediante la medición de la concentración de OF usando GC/FID. Las cepas bacterianas fueron sembradas en la matriz líquida de medio M9 utilizando tubos Eppendorf © e incubadas a 36±1°C por 7 días y se tomó como referencia el valor inicial de concentración del medio M9 con Monocrotofós a 200 ppm y 24 horas más tarde se realizó la primera medición de concentración con el cromatógrafo, con dos mediciones posteriores espaciadas cada una por 24 horas durante 3 días.

Análisis estadístico. Los datos obtenidos fueron analizados por medio de estadística descriptiva de variables continuas, para distribución normal y homogeneidad de varianzas utilizando los test de Kolmogorov-Smirnov y Bartlett (Allen, 1976), respectivamente.

Los suelos analizados evidenciaron la presencia de pesticidas OF, se obtuvieron tres cepas bacterianas con tasas de crecimiento aceptables y con capacidad de sobrevivir en medios saturados con OF (patrón de OF Monocrotofós) (Tabla 1). Una vez aisladas y purificadas las cepas presentes en el medio mínimo M9 se identificaron como bacilos Gram negativos no esporulados sugestivos de Enterobacterias. Luego de confirmar el crecimiento aceptable de las bacterias en presencia de un patrón de OF como única fuente de carbono, las mismas fueron sometidas a identificación tanto bioquímica como molecular para determinar género y especie, del cual fueron obtenidos los resultados sintetizados en la Tabla 2.

La caracterización bioquímica de las cepas C1, C2 y C3 mostraron la presencia de tres especies diferentes: Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae y Pseudomonas aeruginosa respectivamente. Sin embargo, los resultados de la secuenciación del genribosomal 16S, ubican a las cepas C1 y C2 relativas con el género Enterobacter, lo que difiere de lo encontrado con las técnicas de identificación BBL Crystal®. Al comparar estas cepas se encontraron similitudes en cuanto a la morfología de colonias, caracteres microscópicos, metabolismo no oxidativo, siendo anaerobias facultativas no exigentes y metabolismo muy similar. Incluso taxonómicamente las dos especies hacen parte de la familia Enterobacteriaceae. Se encontró que entre las Cepas C1 y C2 se obtuvo una similitud genética entre 99 y 100% con Enterobacter cancerogenusy otras especies no identificadas. Posiblemente, debido a que se está utilizando un solo gen y no el genoma completo de la especie.

Los análisis de la secuencia del gen 16S mostraron, para la cepa 1, una secuencia de 1475 pb, que la relacionan en un 99% con especies del género Enterobacter,entre las cuales está Enterobacter cancerogenusy con otras no identificadas. Sin embargo, el clasificador de RDP (Ribosomal Database Project) sólo llegó hasta una secuencia no clasificada del grupo Enterobacteriaceae (Figura 1). En cuanto a la cepa 2, los resultados del análisis taxonómico indican que la secuencia de 1477 pb, tiene un 99% de identidad en el 100% de su longitud, con secuencias pertenecientes a varias especies del género Enterobactery con otras no identificadas. Siendo más cercana a la especie Enterobacter cancerogenus (Figura 1).

Finalmente, la cepa 3 tuvo un 99% de identidad con varias especies del género Pseudomonas siendo más cercana genéticamente a una secuencia de la especie Pseudomonas aeruginosa (Figura 1).

Los medios de cultivo líquidos fueron sometidos a GC/FID para determinación del pesticida presente. Además de las tres cepas evaluadas, se tuvo un Blanco o Control Negativo, en el cual se utilizó el medio sin sembrar. La información obtenida de la GC/FID que monitoreó la degradación del estándar monocrotofos por parte de las tres cepas bacterianas aisladas (C1, C2 y C3) y el Blanco de reacción se muestra en la Tabla 3. Transcurridas 72 h de incubación se evidenció una marcada disminución del pesticida, la degradación del estándar de monocrotofos fue de hasta un 100% transcurrida 48 horas de incubación (Figura 2).

La capacidad de crecimiento de las cepas aisladas quedó demostrada al encontrar densidades ópticas cercanas a 0,7. En investigaciones similares, las densidades ópticas encontradas tras una o más semanas de crecimiento fueron de 0,7 hasta 10 (Cycoń et al., 2009, 2013; Acuña et al., 2010). Incluso en cepas bacterianas de la misma familia taxonómica que la utilizada en esta investigación (Cycoń et al., 2009, 2013). Las diferencias encontradas entre los dos métodos de identificación pueden atribuirse a la variabilidad genética debido a intercambio del material entre las especies (Winn y Koneman, 2006).

El poder degradativo de las cepas aisladas del suelo, fue comprobado a través de la degradación de monocrotofos. Al parecer este proceso produce metabolitos secundarios que, aunque también son considerados contaminantes, probablemente estos sean degradados por la misma vía metabólica, hasta lograr inocuidad. La biotransformación de monocrotofós se desarrolla por medio de tres diferentes reacciones metabólicas: N-desmetilación, O-desmetilación, y la escisión del enlace fosfato de vinilo. Generalmente el monocrotofós es metabolizado en N-hidroxi-metilamida (Rao, 2006) y n-metilacetoamida. Este último tiende a acumularse en suelos contaminados (Gundi y Reddy, 2006). Monocrotofós es convertido en hidroximetilo utilizando la ruta metabólica oxidativa (Hodgson, 2012). Los metabolitos producidos por las bacterias aisladas del suelo podrían estar generando fosfato inorgánico y enzimas bacterianas como la fosfatasa, lo cual potencian su capacidad de captar este tipo de moléculas en medios libres de fosfato, permitiendo el crecimiento de las colonias (Ríos y Solari, 2010).

En cuanto a la velocidad de descomposición y desaparición de los compuestos organofosforados, carbamatos y otros, es sólo relativa, ya que algunos factores como la propia estructura química del compuesto, tipo de suelo, contenido en materia orgánica, contenido y naturaleza de los minerales de la arcilla presentes en el suelo, composición granulométrica, pH, humedad y temperatura pueden influir decisivamente en el grado de persistencia. Pierre y Betancourt (2007) demostraron que los pesticidas OF utilizados en agricultura generan bioacumulación y pueden permanecer como contaminantes por un período de tiempo prolongado (Abo-El-Seoud et al., 1995; Pierre y Betancourt, 2007).

-Se aislaron tres cepas bacterianas (C1, C2, C3) de suelos contaminados por pesticidas organofosforados. De acuerdo con el estudio a nivel molecular del gen ribosomal 16S, se pudo determinar que las bacterias cultivadas de las muestras C1, C2 y C3 pertenecen a la familia Enterobacteriaceae, obteniendo las dos primeras una similaridad genética entre 99 y 100% con Enterobacter cancerogenusy otras especies no especificadas, sin embargo, la interacción más acorde con cada una es muy diferente, por lo que puede ser concluido que las mismas podrían ser subespecies. Las bacterias cultivadas de la muestra C3, fueron ubicadas dentro de la Familia Enterobacteriaceae, con un grado de similaridad del 99 a 100% con el de la especie Pseudomonas aeruginosa. Estas especies demostraron su capacidad para la degradación de pesticidas OF.

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo fue financiado por la Universidad de Cartagena, con el apoyo decidido de la Vicerrectoría de Investigaciones. Agradecemos al Grupo de Investigaciones Agroquímicas de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. A Orlando de la Rosa por su colaboración en los análisis cromatográficos. A la Universidad de San Buenaventura por el préstamo de sus instalaciones. A los Químicos Héctor Pertúz y Fernando Fernández.

NOTAS AL PIE

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Recibido: 17/12/2015
Aprobado: 03/06/2016

Beatriz E. Jaramillo Colorado, Universidad de Cartagena, Campus San Pablo, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Grupo de Investigaciones Agroquímicas, Cartagena, Colombia. Email: bjaramilloc@unicartagena.edu.co