Rizobios aislados de leguminosas forrajeras de un ecosistema ganadero árido de Holguín, Cuba. Nodulación y evaluación morfocultural (fase I)

Rhizobia isolated from forage legumes of an arid cattle rearing ecosystem in Holguín, Cuba. Morpho-cultural evaluation and nodulation (phase I)

C. J. Bécquer,^I Yaldreisy Galdo,^I Yamilka Ramos,^I Maida D. Peña,^II N. Almaguer,^II Y. F. Peña,^II Analeidis Mirabal,^I Maribel Quintana,^I Adelaida Puentes,^III

^I Instituto de Investigaciones de Pastos y Forrajes, Estación Experimental Sancti Spíritus, Apartado 2255, ZP. 1, C. P. 62200, Sancti Spíritus, Cuba

^II Centro de Estudios para Ecosistemas Áridos, Universidad de Holguín, Cuba

RESUMEN

Se colectaron nódulos radicales de leguminosas forrajeras nativas o naturalizadas de ecosistemas áridos de Holguín, Cuba: Desmodium canum, D. triflorum, Centrosema virginianum, Indigofera mucronata y Alysicarpus vaginalis. Se realizaron 20 aislados con el objetivo de identificarlos como rizobios y determinar sus características morfoculturales y tintoriales. Se maceraron los nódulos y su contenido se sembró en medios específicos. Asimismo, se inocularon plántulas de Macroptilium atropurpureum para la identificación de los aislados. De estos, 11 se identificaron como rizobios por su fenotipo y por formar nódulos en M.atropurpureum. Se formaron tres grupos de colonias con diferentes características morfológicas, todas con lento o muy lento crecimiento, así como con producción de álcali en el medio, excepto un aislado que produjo ácido y cuatro sin reacción. Se concluye que  los 11aislados que formaron tres grupos de lento crecimiento, pertenecen a la familia Bradyrhizobiaceae. Sin embargo, los aislados de Alysicarpus vaginalis e Indigofera mucronata no presentaron características como rizobios. La mayor parte de los aislados proceden de Centrosema virginianum y se observó que el crecimiento en todos los grupos fue lento o muy lento. Sin embargo, el diámetro de las colonias, la producción de ácido o álcali, así como la formación de goma, varió sensiblemente entre los grupos formados. Se recomienda realizar ensayos de fenotipo y genotipo con el fin de determinar de forma más exacta su posición taxonómica hasta el nivel de especie.

Palabras clave: leguminosas forrajeras, fenotipo, Bradyrhizobium.

ABSTRACT

Radical nodules of naturalized and native forage legumes of arid ecosystems in Holguín, Cuba (Desmodium canum, D. triflorum, Centrosema virginianum, Indigofera mucronata and Alysicarpus vaginalis). An amount of 20 isolates were conducted in order to identify them as rhizobia and determine their morphocultural and staining characteristics. Nodules were macerated and its content was cultivated in specific media. Likewise, plantlets of Macroptilium atropurpureum were inoculated for identifying isolates. From them, 11 were identified as rhizobia due to their genotype and their ability to form nodules in M.atropurpureum. Three groups of colonies with different morphological characteristics were formed, all of them with slow or very slow growth, as well as with alkali production in the medium, except an isolate that produced an acid and four without reaction. It can be concluded that the 11 isolates that formed three groups of slow growth belonged to the Bradyrhizobiaceae family. However, isolates of Alysicarpus vaginalis and Indigofera mucronata showed no characteristics as rhizobia. Most of the isolates come from Centrosema virginianum and it was observed that growth in all groups was slow or very slow. Nevertheless, colony diameter, acid or alkali production and gum formation had a sensitive variation among formed groups. It is suggested to carry out assays of phenotype and genotype, in order to determine more exactly their taxonomical position up to species level.  

Key words: forage legumes, phenotype, Bradyrhizobium

INTRODUCCIÓN

Las leguminosas son ricas como fuente de proteínas para la alimentación humana y para el ganado. La producción de plantas leguminosas depende, en gran medida, de la fijación de nitrógeno molecular que realiza en simbiosis con especies específicas de rizobios. Existen aproximadamente 19.000 especies de leguminosas, y la mayoría aún no se aprovechan por el hombre. Solo se conocen los simbiontes para aproximadamente 1 % de las leguminosas que forman nódulos fijadores de nitrógeno(Villanueva y Quintana 2012).

La provincia de Holguín, Cuba, presenta  45 % del área agrícola con suelos poco productivos o muy poco productivos. En estos últimos incide la compactación, la salinización, la sequía, la acidez y el drenaje deficiente (Turruelles y Daley 2009). Según Oquendo et al. (2013), estos factores limitantes, y otros de carácter climático y fisiográfico, inciden negativamente en el fomento y la explotación de pastizales en esa región. Los rizobios, que constituyeron microsimbiontes de las leguminosas pratenses prospectadas en la zona de estudio, para poder sobrevivir en las condiciones estresantes de sequía desarrollaron un sistema de adaptación, por lo que su caracterización y posterior selección agronómica, constituyen un paso obligado para explotar su potencial fisiológico como inductores de tolerancia al estrés hídrico en las plantas (Vanderlinde et al. 2010, Fitouri et al. 2012). 

La caracterización fenotípica de rizobios adaptados a condiciones estresantes en los suelos constituye una de las primeras etapas para la obtención de un inoculante efectivo, que permita un mejor establecimiento de las leguminosas y con ello, incrementar la producción de alimentos y reducir el empleo de fertilizantes nitrogenados. A pesar de la amplia utilización de técnicas de biología molecular en la caracterización de estas bacterias, se mantienen muchos de los análisis fenotípicos tradicionales, pues estos evalúan las funciones fisiológicas y ecológicas de la célula, lo que favorece su ubicación taxonómica (Bécquer 2002).

El objetivo de este trabajo fue identificar y evaluar las características morfoculturales y tintoriales de rizobios aislados de leguminosas forrajeras de un ecosistema ganadero árido de Holguín, Cuba, con el propósito de utilizarlos en un futuro en la práctica agrícola en condiciones estresantes.

MATERIALES Y MÉTODOS

Sitio de colecta de nódulos. Se realizó la colecta de nódulos en la zona conocida por “Monte Alto”, perteneciente al municipio Calixto García, provincia de Holguín, en condiciones de ganadería semintensiva. Esta región se halla ubicada a una longitud de 73.3740 y latitud de 20.4410 (UTM).

Características de clima en el sitio de colecta. Se caracteriza por escasas precipitaciones, aunque la humedad relativa es alta (tabla 1). En el período específico de colecta (2da decena de Julio), la lluvia total constituye casi  50 % de la del mes, lo que pudo favorecer, de cierta forma, la nodulación de las leguminosas.

Prospección de nódulos. Se tomaron para un muestreo representativo entre 15–20 submuestras al azar en un patrón de W o zig-zag. Para evitar desecamiento de los nódulos, se tomaron al mismo tiempo suelo y raíces (Pérez et al. 2011). Se seleccionaron plantas vigorosas, en estadio fenológico de inicios de floración, sin indicios de ataques de plagas o presencia de enfermedades. La extracción de los nódulos de las raíces de leguminosas y su conservación posterior se realizó según Somasegaran y Hoben (1994), para lo que se cortó con una pala una sección de suelo a no menos de 15.0 cm alrededor de la planta y, al menos, a 20.0 cm de profundidad. Los nódulos, conjuntamente con las raíces, se preservaron en recipientes con CaCl₂, para su conservación y traslado. 

Aislamiento de rizobios. Los rizobios se aislaron  según el método de Date y Halliday (Date 1982). Se esterilizaron en etanol 95 % (30 s), hipoclorito de sodio 4-6 % (2-3 min) y se enjuagaron en agua destilada estéril. Se les aislaron las cepas a partir de una compresión hecha con un macerador de vidrio estéril para extraer su contenido. La siembra se efectuó en medio sólido levadura-manitol con rojo congo (RC) (Vincent 1970) y se incubó a 28 ºC durante 10 d. Se seleccionaron aquellas colonias con características culturales semejantes a los rizobios, que no absorbieran rojo congo, y se realizaron pases sucesivos de ellas en el medio antes descrito hasta obtener un cultivo puro. Posteriormente, se conservaron en cuñas de este mismo medio a 4 ºC. La pureza de los cultivos, así como sus características tintoriales y morfología de las células, se determinaron mediante la tinción de Gram (Somasegaran y Hoben 1994, Parker 2012).

Identificación de los aislados. La identidad de los rizobios se confirmó por su capacidad de provocar la nodulación en Macroptilium atropurpureum (Vincent 1970) en tubos de ensayos de 150 x 25 cm, que contenían solución nutritiva agarizada Hoagland libre de nitrógeno, según lo descrito por Bécquer (2002), con arreglos en la fuente de Fe al utilizar Fe₂Na₂EDTA en lugar de FeC₆H₅O₇.H₂O. Para ello se emplearon inóculos frescos de cada una de las cepas aisladas, con título aproximado de 10⁸ células/mL, del cual se añadió 1.0 mL a cada tubo. Las semillas se esterilizaron con hipoclorito de sodio (2.5 %) (Somasegaran y Hoben 1994) y se escarificaron en agua caliente a 80-90 ºC (2-3 min) antes de la siembra. Las plántulas crecieron en una cámara de condiciones controladas Fitotron (Korea), con periodicidad luminosa de 16 h-luz (300 µE/m²/s) a 26 ºC durante el día y 22 ºC durante la noche. La humedad relativa fue de 75/85 %. Después de pasadas dos semanas, las plántulas se examinaron para comprobar la nodulación. Asimismo, se evaluó el crecimiento en peptona-glucosa-agar, según metodología de Somasegaran y Hoben (1994).

Morfología y crecimiento de las colonias en medio sólido levadura-manitol. Estas variables se evaluaron mediante la observación de la forma y crecimiento de las colonias en medio sólido levadura-manitol a 30 ºC hasta 10 d. El cambio de coloración del medio de cultivo para determinar la producción ácido-álcali, así como la absorción de rojo congo (Vincent 1970) se llevó a cabo con azul de bromotimol (ABT) (5.0 mL/L, pH 6.8) (tabla 4).

Cepas comerciales utilizadas en las evaluaciones. Se utilizaron diferentes cepas comerciales que sirvieron de testigo en las diferentes evaluaciones de identificación y caracterización (tabla 3).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los macrosimbiontes de los que se colectaron los nódulos radicales pertenecen a los géneros Desmodium, Centrosema, Alysicarpus e Indigofera. Estas leguminosas se encontraban en un ecosistema ganadero árido, con escasas precipitaciones en julio (tabla 1). La distribución de las plantas muestreadas en el área fue dispersa, aunque con buen desarrollo fenológico.

Aún con indicios de ser efectivos, los nódulos que se colectaron de algunas leguminosas fueron predominantemente escasos y, en algunos casos, de tamaño pequeño e inefectivos, indicadores en los que pudieron influir la carencia de humedad del suelo, así como el bajo contenido de fósforo, alto contenido de potasio (K) (tabla 2) y tenores débiles de sal.

Se sabe que la escasa salinidad el suelo pudiera no tener implicaciones severas en plantas y bacterias y el potasio es el catión más abundante en el citoplasma, con un efecto importante en la conformación y regulación de la actividad de las enzimas, cuando hay exceso de este elemento hay una posible interacción con la absorción y disponibilidad fisiológica de Mg y Ca en las plantas (Marschner 1986). No obstante, las interacciones entre las leguminosas y las rizobacterias son particularmente importantes cuando estas derivan en la tolerancia a condiciones ambientales extremas, como la sequía severa, elevadas temperaturas y salinidad (Moschetti et al. 2005).

También se encontraron nódulos en número de 10-50, tamaño mediano (2-5 mm) y con un color interno predominante, que varió de rojo a marrón, excepto los nódulos colectados de Indigofera y Alysicarpus, los que presentaron un color que varió de blanco a verde (tabla 4). La mayor localización se encontró en las raíces secundarias (figura 1). Al respecto, Sharma et al. (2012) consideran que los nódulos que se forman en las raíces principales son más eficientes que los que constituyen en las raíces secundarias. En el caso de los nódulos de Alysicarpus e Indigofera, su color verde o blanco indica que no eran efectivos (Somasegaran y Hoben 1994). La vegetación acompañante fue, fundamentalmente, de gramíneas pratenses, con abundancia de Dichantiumsp y Paspalumnotatum.También se encontraron cactáceas, con desarrollo fenológico avanzado, lo que corrobora las características áridas de la zona.Los nódulos que se colectaron se consideraron, en general, desmoideos, con hábito de crecimiento definido, de forma oblonga, y meristemo esférico (Bergersen 1982).

Se observó que los géneros Centrosema y Desmodium predominaron entre los macrosimbiontes en la prospección. Se conoce que Olivera et al. (2008) hallaron a Centrosema ampliamente diseminado en tres provincias orientales de Cuba. Gómez et al. (2010), en prospecciones de leguminosas realizadas en el Valle del Cauto, Cuba, encontraron que C. plumieri presentó altos índices de nodulación natural.

Se hicieron 11 aislamientos de rizobios a partir de nódulos radicales de Centrosema virginianum, Desmodium cannum y D. triflorum en áreas ganaderas áridas del municipio Calixto García, Holguín. Los aislamientos que se realizaron en Alysicarpus vaginalis e Indigofera mucronata no se confirmaron como rizobios, al mostrar crecimiento exuberante en medio sólido peptona-glucosa y absorción de rojo congo en medio sólido levadura-manitol, con características morfoculturales no típicas para rizobios (Vincent 1970). Es posible que, vinculado a este resultado, los nódulos de estos dos macrosimbiontes no fueron efectivos, por su coloración verde o blanca(Somasegaran y Hoben 1994).

En la tabla 5 se muestran los aislados y su macrosimbionte natural. Nótese que la mayor parte de los aislados proceden de Centrosema virginianum, lo que pudiera estar vinculado a las características de este macrosimbionte.

Con el aislamiento que se realizó en la mayor parte de los macrosimbiontes que se prospectaron, se obtuvieron colonias con características morfológicas típicas para la familia Bradyrhizobiaceae (Weir 2016). Se comprobó su identidad como rizobios por sus características de Gram (-), al producir nódulos en plántulas in vitro de Macroptilium atropurpureum, con poco o nulo crecimiento en peptona-glucosa-agar. Tampoco hubo absorción de rojo congo en el medio antes referido (tabla 6, 7, 8, 9, 10 y 11). Estos resultados no son sorprendentes, ya que según Doyle (2011), Fonseca et al. (2012), Koppell y Parker (2012) y Parker y Rousteau (2014), las bacterias pertenecientes al género Bradyrhizobium interactúan con la más amplia diversidad de leguminosas y se asocian con grupos formadores de nódulos que representan ramificaciones tempranas de clados en cada una de las tres subfamilias de leguminosas.

Se identificaron tres grupos de crecimiento. El primero fue el de crecimiento lento, con aparición de colonias a partir del sexto día, 3-4 mm de diámetro, blancas, gomosas, semitranslúcidas, circulares, convexas, con bordes enteros y cinco aislados (tres aislados de Centrosema virginianum: Ho2, Ho7 y Ho8, así como dos de Desmodium canum: Ho9 y Ho10). De estos, cuatro produjeron álcali y uno no mostró reacción aparente en medio sólido levadura-manitol con azul de bromotimol (figura 2a, tabla 6, tabla 7).

El segundo grupo fue de crecimiento lento, con aparición de colonias a partir del séptimo día, 1-3 mm de diámetro, blancas, gomosas, semiopacas, circulares, con bordes enteros, convexas y tres aislados (C.virginianum: Ho1, Ho12 y Ho13) (figura 2b, tabla 8, tabla 9). No hubo reacción aparente de los mismos en medio sólido levadura-manitol con azul de bromotimol.

El tercer grupo fue de muy lento crecimiento, con aparición de colonias a partir del séptimo día, < 0.5 mm de diámetro, colonias blancas, secas, opacas, circulares con bordes enteros y punctiformes, convexas y tres aislados (D. triflorum: Ho4, Ho5 y Ho6) (figura 2c, tabla 10, tabla 11). Dos de los aislados produjeron álcali, y uno produjo ácido en medio sólido levadura-manitol con azul de bromotimol. En este grupo se incluye también USDA 110, cepa testigo perteneciente a Bradyrhizobium japonicum, género representativo de los rizobios de lento crecimiento, con las características antes descritas.Según Pires et al. (2010), normalmente, los aislados de rápido crecimiento no forman colonias secas.

Las cepas testigo, excepto USDA 110, tuvieron aparición de colonias a los tres-cinco días, de diámetro entre 2 y 3 mm, con formación de goma y producción de ácido en azul de bromotimol, excepto la cepa ATCC 9930 (Sinorhizobium meliloti) que no tuvo reacción. Ninguna de estas cepas absorbió rojo congo del medio. Este grupo, evidentemente, se diferenció en gran medida de los tres grupos anteriores que se formaron por los nuevos aislados.

Los aislados pertenecientes a esos tres grupos, a pesar de su alta variación morfológica, podrían ser considerados representantes del género Bradyrhizobium (Bradyrhizobiumsp.), por su crecimiento, morfología y producción ácido-álcali(Young 1996). La cepa USDA 110 (B. japonicum), que se usó como testigo, correspondió también a estas características, sobre todo a las del tercer grupo, con producción de álcali y colonias de <0.5 mm de diámetro. Resulta evidente que el crecimiento en todos los grupos fue lento o muy lento. Sin embargo, el diámetro de las colonias, así como la formación de goma, varió sensiblemente entre los grupos formados, lo que demuestra la diversidad morfológica de estas bacterias(Granda et al. 2013).

Es de destacar también que uno de los aislados (tercer grupo, D. triflorum) produjo ácido en el medio correspondiente, lo que contradice las características de los bradyrizobios, que generalmente presentan reacción alcalina (Jordan 1982). No obstante, Bécquer (2002) informó bradyrizobios que se aislaron de leguminosas forrajeras de la provincia Sancti Spíritus, con reacción ácida. Odee et al. (1997) encontraron cepas productoras de ácido en colonias de rápido crecimiento de Bradyrhizobiumsp. Es posible que los aislados productores de ácido pudieran ser originarios de áreas con características alcalinas, y que la mutación producida en los aminoácidos por factores ambientales diferentes no haya incidido aún en su expresión fenotípica (Stanier et al. 1979).Nótese que el pH del suelo donde se colectaron los nódulos no es ácido, sino neutro (7.35) (tabla 2), por lo que no hubo influencia del medio en la secreción de álcali. Rojas et al. (2009) encontraron que una cepa de Bradyrhizobiumsp., que creció en medio sólido levadura-manitol más azul de bromotimol, acidificó el medio de cultivo. Esta característica que algunos rizobios presentan puede ser una ventaja competitiva que les permite sobrevivir a condiciones adversas, y no se puede tomar como carácter taxonómico exclusivo de estos microorganismos (Moreno 2010).

Se concluye que 11aislados, que formaron tres grupos de lento crecimiento, pertenecen a la familia Bradyrhizobiaceae. Sin embargo, los aislados de Alysicarpus vaginalis e Indigofera mucronata no presentaron características como rizobios. La mayor parte de los aislados proceden de Centrosema virginianum. Se observó que el crecimiento en todos los grupos fue lento o muy lento. Sin embargo, el diámetro de las colonias, la producción de ácido o álcali y la formación de goma, varió sensiblemente entre los grupos. Se recomienda realizar ensayos de fenotipo y genotipo para determinar de forma más exacta su posición taxonómica hasta el nivel de especie.

Bécquer, C. J. 2002. Caracterización y selección de rizobios, aislados de leguminosas nativas de Sancti Spíritus, Cuba. Ph.D. Thesis, Universidad de La Habana, La Habana, Cuba, 140 p.

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Recibido: 13/1/2015

Aceptado: 9/11/2016

C. J. Bécquer. Instituto de Investigaciones de Pastos y Forrajes. Email: pastossp@enet.cu