INTRODUCCIÓN
La Organización Internacional de Epizootias (OIE 2014) trabaja por introducir en los sistemas de producción animal nuevos productos y tecnologías para la obtención de alimentos sanos, que permitan altas producciones con adecuada sostenibilidad económica y con garantía biológica para proteger a los animales y al hombre. Entre estos productos se encuentran los aditivos zootécnicos con efecto probiótico, que representan un avance terapéutico potencialmente significativo y seguro (Pérez et al. 2015, 2016).
Teniendo en cuenta la importancia de los aditivos zootécnicos con efecto probiótico en nuestros días, debido a la creciente eliminación del uso de los antibióticos como promotores del crecimiento (APC) en la producción animal (Furtula et al. 2013, Torres et al. 2013 y Pérez et al. 2015), la FAO y WHO (2002) definieron un grupo de requisitos y una metodología a seguir para obtener cepas de microorganismos que fueran reconocidas como seguras GRAS y que pudieran ser usadas en la elaboración de probióticos.
El establecimiento de estos criterios de selección de cepas con fines probióticos se considera una prioridad por la rápida incorporación de estos productos en el mercado. La mayor parte de las cepas que se utilizan para la elaboración de aditivos zootécnicos pertenecen al género Lacto Bacillus spp., Bifidobacterium, las levaduras, fundamentalmente las del género Saccharomyces y Bacillus spp. en forma esporulada (García y Carcassés 2012 y Milián et al. 2014). Esta concepción está dada por el efecto probiótico que brindan en el balance de la microbiota intestinal, la activación del sistema inmune, la mejora de la fisiología digestiva y por ende, en los rendimientos productivos (Ayala et al. 2014, Milián et al. 2014 y Rodríguez 2015).
Investigaciones realizadas por Milián et al. (2014) demostraron la capacidad que tienen diferentes productos probióticos, obtenidos a partir de cepas autóctonas de Bacillus subtilis, para actuar en los procesos de recambio y mantenimiento celular, metabólico y microbiano, en el tracto gastrointestinal, principalmente a nivel del ciego.
Se conoce la existencia de la comercialización de productos elaborados a partir de cepas de B. licheniformis, B. subtilis y sus endosporas (BioPlus 2B®, Biostart®, Toyocerin®, Liqualife®, Biosporin®, CenBiot® y SUBTILPROBIO®), con efecto probiótico en cerdos, aves, terneros y peces. Sin embargo, no se conoce la existencia de metodologías biológicamente seguras para la obtención de estos productos. Por ello, se propone una metodología para el aislamiento, identificación y selección de cepas de Bacillus spp. para la elaboración de aditivos zootécnicos.
]]>MATERIALES Y MÉTODOS
La metodología propuesta tiene tres etapas de trabajo, la que se concibe desde el aislamiento de cepas de diferentes ambientes (tabla 1) y las evaluación en condiciones in vitro e in vivo en aves.
La primera etapa de trabajo cuenta de tres experimentos: aislamiento, identificación y la caracterización y selección de las cepas en condiciones in vitro. La segunda etapa recoge toda la investigación realizada para demostrar la capacidad de crecimiento y producción de endosporas comparado con el medio tradicional (MT) y un nuevo medio de cultivo para Bacillus spp. (McBs), a partir de recursos nacionales de bajo costo, así como, el estudio que demuestra la seguridad y calidad biológica de las cepas trabajadas como de los aditivos zootécnicos obtenidos y la tercera etapa expone el estudio in vivo en aves para demostrar la efectividad de la metodología propuesta. Se describe el procedimiento en la figura 1.
Para el desarrollo de estas etapas, se utilizaron diferentes medios de cultivo para el crecimiento de las cepas. Asimismo, se aplicaron métodos de análisis microbiológico, químico y estadístico:
• Medios de cultivo
• Cultivo y conteo de los microorganismos
• Conservación de las cepas
• Procesamiento estadístico
Medios de cultivo. Para llevar a cabo los estudios de aislamiento, evaluación de la actividad probiótica, obtención de los aditivos zootécnicos y conteos a nivel del ciego, se trabajó con los medios de cultivo agar y caldo nutriente (BIOCEN).
]]> La composición del medio tradicional de caldo nutriente (BIOCEN) por litro utilizado es la siguiente: peptona bacteriológica (5 g), extracto nutritivo (1 g), extracto de levadura (2 g) y cloruro de sodio (5 g). El medio sólido se elaboró con la adición de 15 g. L-1 de agar bacteriológico.Cultivo y conteo de microorganismos. Las muestras se recolectaron y procesaron durante la investigación y se resuspendieron posteriormente en solución salina estéril. Se eliminaron las formas vegetativas por tratamiento térmico a 71 ºC durante 15 min (Pérez 2000). Se hicieron diluciones seriadas (Stanier 1996) y se sembraron en placas con agar nutriente (BIOCEN). La incubación se realizó a 37 ºC durante 24 h en incubadora INNOVA NBS en condiciones de aerobiosis.
El conteo de microorganismos se realizó mediante el número de unidades formadoras de colonias (UFC). Se determinó por conteo visual de colonias en placas con agar nutriente (Pelczar et al. 1966).
Conservación de las cepas. Las cepas aisladas e identificadas se conservaron en sílica gel a temperatura de 4 ºC, mediante liofilización, con un programa que varió la temperatura de -20 ºC en tiempo cero hasta 15 ºC a las 48 h.
Velocidad específica de crecimiento. Con los datos obtenidos se confeccionaron las curvas de crecimiento. Mediante la aplicación de la línea de ajuste se obtuvieron los polinomios correspondientes y los valores de la velocidad específica de crecimiento (µ). Estos procedimientos se ejecutaron mediante la hoja de cálculo Microsoft Excel.
Tiempo de duplicación. El tiempo de duplicación se calculó según la fórmula descrita por Madigan et al. (1997).
td = µ/Log 2
donde:
td = tiempo de duplicación
µ = velocidad específica de crecimiento
]]> Log 2 = 0,301Procesamiento estadístico. Para el análisis de los datos se utilizó el sistema INFOSTAT, Versión 1 (Di Rienzo et al. 2001). Los análisis de varianza se realizaron para verificar diferencias entre las medias, con nivel de significación de P < 0.05. La Prueba Duncan (1955) se aplicó para realizar las comparaciones múltiples entre las medias. Los conteos de microorganismos viables se transformaron según Log N para garantizar las condiciones de normalidad en la curva de crecimiento. Para el análisis, se aplicó la fórmula (K+N).10x, donde:
K es la constante que representa el logaritmo de la dilución, en la cual se inoculó el microorganismo
N es el logaritmo del número de UFC
10 es la base de los logaritmos
X es la dilución a la que se efectuó la inoculación.
En caso de que el conteo fuera igual a cero se sumó una constante (x + 0.375).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la evaluación de la metodología propuesta se obtuvieron 100 cepas. De ellas, 48 exhibieron características del género Bacillus. Todas presentaron células de forma bacilar Gram positivas y presencia de endosporas, características que coinciden con lo descrito por Stanier (1996), Madigan et al. (1997) y Mayea et al. (1997).
]]> Los ambientes seleccionados para el aislamiento de las cepas están en correspondencia con estudios realizados por González et al. (2003), quienes aislaron cepas de Lactobacillus bulgaris y Bacillus subtilis, procedentes de jugo de tomate alterado, con el propósito de elaborar un biopreparado probiótico destinado la salud animal. Sosa et al. (2004) aislaron 52 cepas esporuladas, pertenecientes al género Bacillus spp. de diferentes muestras de heces de gallina (19 %), caprinos (12 %), vacunos, porcinos y equinos (7 %).De las 48 cepas de Bacillus spp. evaluadas ante los tres pH ácidos (1, 2 y 3) que se simularon in vitro durante tres horas, fueron capaces de soportar a pH-1, 33.3 %; pH-2, 55 % y pH-3, 96 %. Es necesaria la capacidad de las cepas para resistir niveles bajos de pH, ya que cuando se utiliza un cultivo microbiano como probiótico por vía oral, se tiene que someter a la acción de la barrera ácida del estómago durante su tránsito por el tracto digestivo, donde el pH puede alcanzar valores de 2 (Milián et al. 2013). De ahí la importancia de que los microorganismos sobrevivan a esta barrera química para que puedan alcanzar las partes bajas del tracto, donde van a desarrollar su acción probiótica.
Por los resultados obtenidos en el proceso de selección, se decide seleccionar las cepas C-31, C-34 y E-44 para continuar su evaluación como posibles microorganismos con actividad probiótica en condiciones in vitro.
Los resultados del experimento II de la Etapa 1, que corresponden a la identificación por métodos tradicionales (tabla 2, 3 y 4), evidencian que las tres cepas evaluadas son positivas a los estudios bioquímicos, mientras que todas fueron negativas al crecimiento en condiciones de anaerobiosis. Con la utilización de la clave Fields (1978) y los resultados logrados, se ubica a estas cepas como pertenecientes a la especie Bacillus subtilis (Blackwood).
Cuando se aplicó el Test de Galería API 50 CH, específico para Bacillus, se corroboró que las cepas en estudio pertenecen al género Bacillus y a la especie subtilis con 99.7; 99.5 y 99.3 % de confiabilidad, respectivamente. El resultado que se obtuvo al aplicar técnicas avanzadas de biología molecular, específicamente la reacción en cadena de la polimerasa (RCP), mostraron 100 % de identidad con esa especie. Esto permite confirmar la vigencia y viabilidad de los métodos tradicionales, al confirmarse la identificación por el método tradicional, los perfiles de fermentación de carbohidratos y la RCP (Milián et al. 2014).
Los estudios realizados para verificar la eficiencia de la metodología en la primera etapa, experimento III, demuestran que las cepas C-31, C-34 y E-44 poseen alta capacidad de crecimiento y producción de endosporas, y que exhiben las mejores características en cuanto a la actividad antimicrobiana ante 15 cepas de microorganismos Gram positivos y Gram negativos. En estudios con 25 antibióticos mostraron ser sensibles, por lo que se puede afirmar que las cepas seleccionadas (C-31, C-34 y E-44) de Bacillus subtilis muestran in vitro características potenciales para su utilización como probióticas.
La segunda etapa de la metodología recoge las investigaciones relacionadas con la evaluación de la capacidad de crecimiento, producción de endosporas y estabilidad de las cepas en un nuevo medio de cultivo, formulado con componentes nacionales y de bajo costo (tabla 5 y 6).
Los resultados obtenidos mostraron que las cepas C-31, C-34 y E-44 en el nuevo medio de cultivo (figuras 2, 3 y 4; tablas 8, 9 y 10) para Bacillus subtilis (McBs) aumentaron la dinámica de crecimiento y su velocidad, así como el tiempo de duplicación (tabla 7).
]]> Los mejores resultados referentes a la velocidad de crecimiento de las cepas C-31, C-34 y E-44 fueron en el nuevo medio de crecimiento para Bacillus subtilis (McBs). Esto está dado por dos elementos: el bajo costo de su obtención y la composición del nuevo medio de cultivo formulado con componentes nacionales: miel final como fuente de carbono, que aporta glucosa, fructosa y sacarosa (Pérez 2000) y el hidrolizado de crema de levadura de destilería de alcohol, como fuente de nitrógeno, que proporciona oligosácaridos de glucanos (1.30 mg. mL-1) y mananos (0,86 mg. mL-1), proteínas, aminoácidos y vitaminas del complejo B y K (Pérez et al. 2016). La peptona bacteriológica que se usó en el medio incorporó ácidos nucleicos, minerales, vitaminas, carbohidratos y proteínas, lo que lo hace un medio rico y viable para el crecimiento de los microorganismos (Herrera et al. 2014). Estos nutrientes permiten el crecimiento acelerado de cultivos de Bacillus subtilis en las primeras horas de cultivo y elevada producción de endosporas a partir del alto crecimiento microbiano (Milián 2009 y Rodríguez 2010).
Los biopreparados esporulados, obtenidos a nivel de laboratorio, mostraron estabilidad hasta los 180 d, a temperatura ambiente y en refrigeración. El estudio de calidad microbiológica demostró que los biopreparados, en ambos métodos de conservación, estaban libres de contaminantes, tales como el recuento de coliformes fecales y totales, Pseudomonas auruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus y Salmonella spp.
En la tercera etapa de la metodología se propone la evaluación de la actividad probiótica de los diferentes aditivos zootécnicos en aves. Estos se suministraron durante un período de 42 d y mostraron resultados positivos en el balance microbiano en el ciego de pollos, lo que se refleja por el incremento en la población de Lactobacillus, endosporas y anaerobios totales, así como por la reducción en el grupo coliformes, incremento de los contenidos de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) totales y fraccionados y de ácido láctico, con disminución en los niveles de pH intestinal. Se lograron mejorar indicadores relacionados con la respuesta inmunológica de las aves, como el tamaño de la bolsa de Fabricio y del bazo, así como los títulos de HI para la vacuna de Newcastle; además de los niveles de hemoglobina, hematocrito, albúmina, globulina y proteínas totales. Esto se traduce en incremento del peso vivo, menor consumo, mejor conversión y mayor eficiencia alimentaria.
Finalmente, se comprobó que la metodología propuesta para el aislamiento, identificación y selección de cepas de Bacillus spp., destinadas a la elaboración de aditivos zootécnicos a partir de los cultivos C-31, C-34 y E-44 de Bacillus subtilis y sus endosporas se pueden usar en Cuba, ya que ganan un gran espacio como mejoradores del balance microbiano y de las respuestas inmunológicas, fisiológicas y productivas. Permiten además, obtener nuevos biopreparados con actividad probiótica que, en los momentos actuales, son una alternativa prometedora ante el empleo de antibióticos como promotores del crecimiento, si se tiene en cuenta que los mismos se obtienen a partir de materias primas nacionales que provienen de la industria azucarera y por ende, tienen bajo costo. Además, poseen la característica de esporular, que es intrínseca de los Bacillus, lo que las hace un producto tentador, dada las condiciones de producción intensiva en Cuba.
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Recibido: 21/2/2017
Aceptado: 1/11/2017
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Grethel Milián Florido, Universidad de Matanzas. Autopista Varadero km 3 ½, Matanzas, Cuba. Email: grethel.milian@umcc.cu