RESUMEN

Se evaluaron las potencialidades de la técnica de producción de gas in vitro como método para predecir las relaciones que existen entre el nivel de consumo simulado e indicadores de la fermentación. Los niveles de consumo simulados  in vitro fueron de 1.9, 2.1, 2.2 y 2.5 % peso vivo. Las dietas se conformaron con cantidades fijas de harina de maíz y pasto, mientras varió la cantidad de harina de caña de azúcar (equivalente a 0; 6.0, 10.0 y 20.0 g kg^-1 PV). A las 24 h se determinó la degradabilidad de la materia seca y el nitrógeno, la producción de gas y ácidos grasos de cadena corta (totales e individuales), eficiencia de síntesis de biomasa microbiana y concentración de NH₃. Se empleó un diseño experimental de bloques al azar, se determinaron los índices de correlación de Pearson entre las variables estudiadas y se realizaron regresiones lineales múltiples para estudiar la relación funcional entre el nivel de consumo simulado  (variable respuesta) y las variables de la degradabilidad de la materia seca, producción de gas, ácidos grasos de cadena corta totales y eficiencia de síntesis de biomasa microbiana (variables predictoras). La correlación de Pearson entre el nivel de consumo simulado  e indicadores de la fermentación mostraron alta correlación positiva para producción de gas, ácidos grasos de cadena corta (acético, butírico y totales) y eficiencia de síntesis de biomasa microbiana (P < 0.05). Hubo alta correlación negativa con la degradabilidad de la materia seca y el nitrógeno (P < 0.01). Las ecuaciones de regresión lineal múltiple mostraron que mejoró R² al incrementar de 2 a 3 las variables predictoras. La degradabilidad de la materia seca mostró los mayores valores de R² parcial, aunque al excluirla la producción de gas a las 24 h explicó 65.7 % de la variabilidad. Los resultados obtenidos permiten sugerir que se pueden predecir los niveles de consumo voluntario que se simularon in vitro a partir de los datos de degradabilidad de la materia seca y la producción de gas, mientras que la inclusión de los ácidos grasos de cadena corta totales  y la eficiencia de síntesis de biomasa microbiana como variables predictoras incrementaron el coeficiente de determinación de los modelos obtenidos.

Palabras clave: degradabilidad, fermentación, caña de azúcar, predicción, modelos

ABSTRACT

The potentialities of the in vitro gas production technique were evaluated as a method to predict the relations between the simulated intake level and fermentation indicators. The in vitro simulated intake levels were 1.9, 2.1, 2.2 and 2.5% live weight. The diets were made with fixed amounts of maize meal and grass, while the amount of sugarcane meal varied (equivalent to 0; 6.0, 10.0 and 20.0 g kg^-1 LW). At 24 h, the degradability of dry matter and nitrogen, the gas production and short chain fatty acids (total and individual), synthesis efficiency of microbial biomass and NH₃ concentration were determined. An experimental randomized block design was used, the Pearson correlation indexes were determined among the studied variables and multiple linear regressions were performed to study the functional relation between the simulated intake level (response variable) and the variables of the degradability of dry matter, gas production, total short chain fatty acids and synthesis efficiency of microbial biomass (predictor variables). The Pearson correlation between the simulated intake level and fermentation indicators showed a high positive correlation for gas production, short chain fatty acids (acetic, butyric and totals) and synthesis efficiency of microbial biomass (P <0.05). There was high negative correlation with the degradability of dry matter and nitrogen (P <0.01). The multiple linear regression equations showed that R² improved when the predictor variables increased from 2 to 3. The dry matter degradability showed the highest values of partial R², although when excluding the gas production at 24 h explained 65.7% of the variability. The obtained results suggest that the voluntary intake levels that were simulated in vitro from the data of dry matter degradability and gas production can be predicted, while the inclusion of total short chain fatty acids and the synthesis efficiency of microbial biomass as predictor variables increased the determination coefficient of the obtained models.

Key words: degradability, fermentation, sugar cane, prediction, models

Los pastos constituyen el alimento natural de los rumiantes y representan la fuente alimentaria de mayor abundancia y de menor costo. Sin embargo, cuando se estabulan los animales en la noche se limita el consumo en pastoreo y se impone la necesidad de brindar una fuente de alimento alternativo que compense el pasto no consumido durante las horas de estabulación, pues se conoce que las variaciones en el consumo y modificaciones en los patrones de alimentación determinan la eficiencia productiva y afectan la ganancia individual de los animales (Iraola et al. 2013).

Existen numerosos modelos de predicción del consumo voluntario en rumiantes a partir de indicadores medidos in vivo (Pulina et al. 2013). Sin embargo, el estudio de la relación entre el nivel de consumo voluntario de alimento e indicadores fisiológicos o productivos, en condiciones de producción, tiene la limitación de que los tratamientos con menores niveles de consumo provocarían afectaciones económicas. Esto no hace recomendable el uso de diseños experimentales in vivo como método de rutina para estas investigaciones. Este problema plantea el reto de diseñar experimentos in vitro,  en los que se puedan simular niveles de consumo y determinar sus efectos en indicadores fisiológicos y bioquímicos de la fermentación e inferir a la postre posibles efectos  productivos.

La técnica de producción de gas es un procedimiento que se aplica de forma rutinaria para la evaluación de alimentos. También se ha empleado para predecir el consumo voluntario de alimentos in vivo (Blümmel y Becker 1997 y Blümmel et al. 1997, 2005). La técnica de producción de gas es un sistema in vitro en lote batch,  en el cual se van acumulando los productos de la fermentación. Normalmente, para la implementación de esta técnica se incuban cantidades iguales de materia seca (MS) o materia orgánica (MO) de los tratamientos a comparar. Los indicadores que se miden se expresan por unidad de MS o MO incubada.

Sin embargo, nunca se ha intentado simular diferentes niveles de consumo a partir de la incubación de diferentes cantidades de sustratos, además de evaluar su efecto en los indicadores de la fermentación in vitro que normalmente se miden. Para simular diferentes niveles de consumo en este sistema in vitro habría que incubar las diferentes cantidades de las dietas que se quieren evaluar, de forma que las cantidades de sustrato a fermentar sean un reflejo de los niveles de consumo a simular. Posteriormente se expresan los indicadores medidos en unidades absolutas, y no por unidad de MS o MO incubada, como se hace normalmente.

Para alcanzar nuevos avances en las investigaciones son necesarios estudios que utilicen múltiples metodologías de investigación para abordar sistemas complejos y medir múltiples variables (McNamara et al. 2016). Por ello, el objetivo de este trabajo fue evaluar la técnica de producción de gas in vitro, como método para predecir las relaciones que existen entre el nivel de consumo simulado (NCS) e indicadores de la fermentación, cuando se representaron varias situaciones prácticas de alimentación de animales en un sistema de estabulación nocturna.

MATERIALES Y MÉTODOS

Procedimiento experimental. Para diseñar los NCS a evaluar in vitro, se partió de un grupo de supuestos. Se estableció que el tratamiento control era la dieta que cubría los requerimientos de MS de animales machos en fase de preceba, con peso vivo promedio de 270 kg (PV), que hacen un consumo voluntario de 5.9 kg de MS, el 2.2 % de su PV (Martín 1981). La dieta control estaría conformada por tres elementos: 1.0 kg de harina de maíz (25 % del total del requerimiento de MS), 10 g de harina de caña de azúcar por kg de peso vivo de los animales (40 % del total del requerimiento de MS) y el resto pastos de una mezcla de gramíneas y leguminosas herbáceas (45 % del total del requerimiento de MS). Manteniendo las proporciones obtenidas de cada elemento de la dieta, se conformó la mezcla a evaluar in vitro para el tratamiento control. Estos elementos se mezclaron en base seca, después de secados y molidos. De la misma forma, se conformaron otras tres dietas, con la diferencia que en estas se mantuvo en cantidades absolutas la cantidad de MS que aportaba la harina de maíz y la mezcla de pastos, mientras varió la cantidad de harina de caña de azúcar incluida en la dieta (el equivalente a 0; 6.0 y 20.0 g kg^-1 PV).

En la tabla 1 se muestra la composición final de las dietas y los diferentes niveles de consumo simulados en el sistema in vitro.

Todo el material vegetal se recolectó a finales del período poco lluvioso, en las áreas experimentales de la finca de ceba bovina en pastoreo “Cebadero Ayala” del Instituto de Ciencia Animal, con suelo pardo con carbonato (Hernández et al. 2015). El pasto se recolectó de un cuartón de 0.75 ha, con mezcla de gramíneas (Cynodon nlemfuensis y pastos naturales) y varias leguminosas herbáceas con Neonotonia wightii  y Pueraria phaseoloides como especies predominantes, según procedimiento de muestreo de pastizales con marco de 50 x 50 cm. La caña de azúcar se recolectó en área de forraje y se molió fresca en molino forrajero. En ambos casos, se realizó un único muestreo y se recolectaron aproximadamente 5 kg de cada material vegetal. El pasto y la caña fresca molida se secaron a 60 ºC durante 72 h. Luego, se molieron en molino de martillo a tamaño de partícula de 1 mm.

Para el estudio de la fermentación ruminal se utilizó la técnica in vitro de producción de gas (Theodorou et al. 1994). Se realizaron cuatro incubaciones (réplicas en el tiempo), se utilizaron cuatro botellas de vidrio por tratamiento y 4 botellas blancos, sin sustrato. La producción de gas se midió cada 3 h hasta la hora 24.

Análisis químico. Para la estimación del efecto del NCS en los indicadores del metabolismo del nitrógeno se estimó la degradabilidad del nitrógeno según el procedimiento propuesto por Rodríguez et al. (2014), que se basa en la determinación del N-NH₃ y la producción de gas. En este procedimiento, la degradabilidad in vitro del nitrógeno se estimó como el cociente entre el nitrógeno solubilizado y el contenido de nitrógeno total de los tratamientos. Además, se tomó la pendiente de los modelos generados por este método, como un índice relacionado con la eficiencia de síntesis de biomasa microbiana (ESBM, mg mL^-1). Los análisis de NH₃ se realizaron según Chaney y Marbach (1962).

A los sustratos que conformaron la dieta experimental y a los residuos de la fermentación in vitro, se les determinó la MS y contenido de nitrógeno (AOAC 2016). La fibra detergente neutro (FDN) se obtuvo mediante el procedimiento descrito por Van Soest et al. (1991). La degradabilidad de la MS (DegMS) se determinó por gravimetría, como la diferencia entre la MS incubada y el contenido de FDN en el residuo sólido de la fermentación, dividido por la MS incubada en cada botella (Blümmel et al. 1997).

Para determinar la concentración de los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) individuales en las muestras preservadas, se centrifugaron los viales a 14 200 x g (Centrifuga ECEN-205, MRC Ltd., Hagsvish, Israel) durante 8 min. Posteriormente se analizaron por cromatografía de gases, de acuerdo con las condiciones analíticas descritas por Rodríguez et al. (2014). Los AGCC totales se obtuvieron por suma algebraica de los AGCC individuales. Se calculó el cociente de la concentración de ácido acético y propiónico (Relación Ac/Pp).

Diseño experimental y estadístico. Se empleó un diseño experimental de bloques al azar. Se realizaron cuatro incubaciones o réplicas (bloques). Como unidad experimental se tomó la media de producción de gas de las botellas empleadas por tratamiento en cada réplica. Se utilizó el índice de correlación de Pearson para determinar la relación lineal entre NCS e indicadores medidos o estimados en el estudio. Además, se realizaron regresiones lineales múltiples para estudiar la relación funcional entre el NCS (variable respuesta) y las variables DegMS, producción de gas, AGCC total y ESBM (variables predictoras), y de esa forma evaluar las posibilidades de predecir los NCS a partir de indicadores de la fermentación in vitro.

Para estudiar la importancia relativa de los indicadores de la fermentación en la predicción de los NCS, se determinaron los coeficientes de determinación (R²) parcial, dado que R² es una medida de la capacidad predictora del modelo obtenido y R² parcial es una medida de la capacidad predictora de cada variable incluida en el modelo. Para ello, a partir del análisis de varianza de suma de cuadrados Tipo I (suma de cuadrados secuenciales) se estimaron los R² parcial, como el cociente de la suma de cuadrado de cada variable predictora y la suma de cuadrados total.

En todos los casos se utilizó el paquete estadístico InfoStat (Di Rienzo et al. 2010).

Los resultados para las variables en estudio se publicaron previamente (Rodríguez et al. 2016). Estos fueron corroborados con los de un estudio in vivo, en el que se evaluó el efecto del nivel de consumo voluntario en la ganancia de peso media diaria de animales, con pesos al inicio del experimento similares a los asumidos en este trabajo (Iraola et al. 2016).

En la tabla 2 se muestran los resultados del análisis de correlación de Pearson entre NCS e indicadores de la fermentación. Hubo correlación positiva alta entre NCS y producción de gas (r=0.811, P< 0.001). Al simular el incremento en NCS a partir de un aumento en la cantidad de sustrato incubado en el sistema in vitro, era de esperar que aumentara la producción de gas expresada en mL, y no en mL por unidad de sustrato incubado. De igual forma, se observó correlación positiva alta entre NCS y producción de ácido acético (r=0.833), ácido butírico (r=0.810) y AGCC totales (r=0.761) (P < 0.05). En un tiempo de incubación de 24 h, todo el sustrato celular soluble se debe haber fermentado, el incremento en producción de gas y AGCC totales se podría asociar a las cantidades crecientes de harina de caña incubadas, lo que aumentó la disponibilidad de azúcares de fácil fermentación para los microorganismos.

La correlación positiva de los NCS con las producciones de gas y AGCC se corresponde con la relación directamente proporcional que existe entre la producción de gas in vitro y la de AGCC (Getachew et al. 2002,  2004). Sin embargo, el incremento en el NCS no estuvo correlacionado con la relación acético/propiónico (r=-0.308, P >0.05), debido a que todos los tratamientos se ajustaron a un patrón de fermentación de tipo acético y el sustrato utilizado para simular el consumo (caña de azúcar) es también un alimento fibroso con este tipo de patrón de fermentación.

Hubo correlación negativa alta entre NCS y la degradabilidad de la MS (r=-0.732) y del nitrógeno (r=-0.921) (P < 0.001). Sin embargo, Van Soest et al. (1978), al determinar la degradabilidad in vitro de 187 forrajes de consumo voluntario conocido, observaron que el consumo y la digestibilidad in vitro mostraba una correlación positiva y su mayor coeficiente de correlación se registró a las 6 h de incubación, mientras que la degradabilidad a las 48 h solo era capaz de explicar 20 % de la variabilidad del consumo voluntario de materia seca.

En este estudio, la disminución de la degradabilidad al incrementar el NCS se debió a que se utilizó la harina de caña de azúcar para incrementar la cantidad de sustrato a fermentar. Este alimento es de menor degradabilidad que los otros dos sustratos utilizados (pastos y harina de maíz), por lo que la degradabilidad de la dieta total disminuyó en la medida que el nivel de inclusión de la harina de caña se incrementó. Sin embargo, si para simular incremento del nivel de consumo se hubiera empleado un suplemento de mejor digestibilidad que la dieta base, se podría haber esperado que la correlación entre el NCS y la degradabilidad fuera positiva (Reis et al. 2016).

El NCS también mostró alta correlación positiva con ESBM (r= 0.938; P < 0.001), estimada como la pendiente (mg mL^-1) del modelo utilizado, cuando se incubaron los tratamientos, solos o con 500 mg de almidón de maíz. El incremento de este indicador con el incremento del NCS no se corresponde con lo observado por Blümmel y Lebzien (2001), quienes no informaron relación significativa entre el consumo voluntario in vivo de MS y la eficiencia de síntesis in vitro. Sin embargo, estos autores también reconocen que existe mucha variación en la estimación de la eficiencia de síntesis microbiana, debido, en gran medida, a la falta de técnicas de laboratorio que permitan medir la eficiencia microbiana de una forma sencilla y exacta.

Al respecto, se conoce que la eficiencia de síntesis de biomasa microbiana in vivo es mayor para las dietas con más contenido de nitrógeno disponible por unidad de materia orgánica fermentada (Blümmel y Lebzien 2001). Sin embargo, al utilizar la harina de caña de azúcar para incrementar los NCS, su baja contribución en proteínas hace que disminuya el contenido de nitrógeno de la dieta total, pero los resultados obtenidos evidencian que la eficiencia de síntesis microbiana demostró correlación positiva.

Hubo baja correlación negativa entre el NCS y la concentración de NH₃ (r=-0.115, P >0.05). Esta baja correlación pudo estar dada por las propias características de la solución de incubación utilizada, que se diseñó para garantizar la presencia de N en el medio, de manera que no fuera un factor limitante. Esto sugiere que en futuros estudios se debe de evaluar también medios de incubación pobres en nitrógeno, que permitan evitar este inconveniente.

En cuanto a los coeficientes de correlación de Pearson entre los diferentes indicadores de la fermentación, la alta correlación entre la producción de gas y la degradabilidad de la MS coincide con lo obtenido por Getachew et al. (1998) para estas variables. Sin embargo, estos autores obtuvieron que dicha correlación fue positiva. El hecho de que dicha relación fuera negativa, se debió al uso de la caña de azúcar para incrementar los niveles de consumo. Por tanto, en la medida que aumentó el NCS disminuyó la degradabilidad, pero también se incrementó la producción de gas porque aumentó la proporción de carbohidratos fácilmente fermentables. Al respecto, Getachew et al. (2004) observaron que hubo correlación positiva entre el nivel de carbohidratos no fibrosos y los indicadores de producción de gas a las 6, 24 y 48 h de incubación, así como con el parámetro cinético potencial de producción de gas in vitro. El coeficiente de correlación entre la producción de gas y los AGCC totales fue mucho menor al informado por Getachew et al. (2002, 2004).

Los coeficientes de determinación mejoraron al incrementar de dos a tres variables predictoras incluidas en el modelo. Al incluir la degradabilidad de la MS como variable predictora, esta mostró los mayores valores de R² parcial y por tanto, fue la variable que explicó la mayor proporción de la variabilidad total de los datos de NCS. Al excluirla,  la producción de gas aportó la mayor R² parcial, al explicar 65.7 % de la variabilidad. Aunque la producción de gas refleja la cantidad de sustrato utilizado para la producción de AGCC, también se conoce que se relaciona también positivamente con el consumo (Blümmel y Ørskov 1993).

Al realizar regresiones lineales múltiples, Blümmel y Becker (1997) observaron estrecha relación entre los parámetros de la producción de gas in vitro y el consumo voluntario in vivo de alimentos. A su vez, Blümmel et al. (2005) plantearon que los datos de producción de gas al complementarse con determinaciones de degradabilidad del sustrato mejoraban las posibilidades de predicción del consumo voluntario de alimentos.

Por su parte, al incluir otras variables predictoras mejoró la R² del modelo de predicción del NCS, aunque su R² parcial dependió de si se asociaron con la variable degradabilidad de la MS o no. Las variables predictoras AGCC totales y ESBM, al asociarse con la variable degradabilidad de la MS, explicaron el 17.2 y 12.5 % de la variabilidad total; mientras que al asociarlas con la producción de gas a las 24 h explicaron el 33.8 y 21.8 %, respectivamente.

La técnica de producción de gas se ha usado como una medida de la degradación ruminal de los alimentos y como indicador del consumo de MS digestible. De hecho, la tasa fraccional de degradación ha sido un medio para predecir el consumo voluntario de rumiantes (López et al. 1998). No obstante, en los intentos realizados para relacionar las tasas de digestión in vitro con el consumo de MS, las correlaciones han sido bajas, porque las variables claramente importantes en regular el consumo tales como el estado fisiológico, el nivel de producción y las condiciones ambientales no son tenidas en cuenta (Pell et al. 1997). Probablemente esto mismo suceda en el caso de las variables predictoras AGCC totales y ESBM.

Este es un estudio preliminar donde se pretendió simular diferentes niveles de consumo voluntario mediante la incubación in vitro de diferentes cantidades de sustratos de una dieta basada en base de pastos y una suplementación con harina de maíz. Aunque los índices de correlación de Pearson y los modelos de regresión lineal múltiple indican que las variables medidas se podrían utilizar para predecir los niveles de consumo, se requieren otros estudios in vitro en los que los niveles de consumo se simulen con la inclusión de suplementos igual o más degradables que la dieta base, y estudios in vivo para poder establecer correlaciones entre estos y los resultados in vitro.

Se concluye que las correlaciones de Pearson y las regresiones lineales múltiples permiten sugerir que se pueden predecir los NCS que se simularon in vitro, a partir de los datos de degradabilidad de la MS y producción de gas, a las 24 h de incubación, mientras que la inclusión de AGCC totales y ESBM como variables predictoras incrementó el coeficiente de determinación de los modelos lineales obtenidos.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece a la Dra. Yoleisy García, del Instituto de Ciencia Animal, por su ayuda en la comprensión y determinación de la contribución parcial de las variables predictoras al coeficiente de determinación de los modelos lineales múltiples.

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Recibido: 24/11/2016

Aceptado: 30/12/2017

R. Rodríguez, Instituto de Ciencia Animal, Apartado Postal 24, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. Email: rrodríguez@ica.co.cu