]]> INTRODUCCIÓN
El empleo de microorganismos para la investigación o la producción no es posible sin el suministro de cultivos viables, auténticos y seguros. Las colecciones de cultivo son las encargadas de preservar las fuentes microbianas y garantizar su disponibilidad. En estas se conservan las cepas de interés por métodos adecuados para que mantengan la pureza, viabilidad y estabilidad genética (Smith 2014 y Simões et al. 2016).
La Federación Mundial de Colecciones de Cultivo (WFCC, por sus siglas en inglés) es la organización que representa las colecciones de cultivo y traza los lineamientos para su establecimiento y organización (WFCC 2010 y Wu et al. 2017). También existen organizaciones regionales como la Federación Latinoamericana de Colecciones de Cultivos (FELACC), cuya fundación tuvo lugar en 2004 con el objetivo de establecer acciones de interés para las colecciones de América Latina y el Caribe, y promover la preservación ex situ de la diversidad microbiana en la región (Floccari 2005 y FELACC 2015).
En Cuba, existen más de 35 colecciones de cultivos microbianos de diferentes organismos, en su mayoría asociadas a la Sección de Colecciones Cubanas de Cultivos Microbianos y otros materiales biológicos, constituida en 2002 (Iglesias et al. 2006) y perteneciente a la Asociación de Técnicos Azucareros de Cuba (ATAC). La mayoría de estas colecciones están vinculadas a la salud humana, la industria alimenticia y el control ambiental (Del Puerto et al. 2009, Iglesias et al. 2010 y Del Puerto-Sardiñas et al. 2016). En la agroindustria las colecciones existentes garantizan el suministro de cepas para la producción de biofertilizantes, controles biológicos y vacunas y anticuerpos para la salud animal (Montes de Oca et al. 2008).
La alimentación animal constituye preocupación a nivel nacional por la carencia de materias primas y sus elevados costos. Por ello, se buscan alternativas y dentro de estas una de las más novedosas es la producción de alimentos y aditivos por vía biotecnológica, donde se utilizan los microorganismos o sus productos como principios activos (García y García 2015 y Galindo et al. 2017). El aislamiento, identificación, caracterización y conservación de estos microorganismos se convierten en eslabones fundamentales para la obtención de productos agropecuarios por vías biotecnológicas.
El Instituto de Ciencia Animal (ICA) cuenta con colecciones de microorganismos con potencialidades de uso en la alimentación animal. Sin embargo, el acelerado desarrollo de la biotecnología en la rama agropecuaria y el aislamiento de nuevas cepas, exige la organización de las colecciones existentes en una colección única y la implementación de procedimientos que garanticen su correcto funcionamiento. El objetivo del presente trabajo fue establecer en el Instituto de Ciencia Animal la metodología para la organización y el manejo de la colección de microorganismos con potencialidades como aditivos en la nutrición animal.
MATERIALES Y MÉTODOS
El establecimiento de la Colección de Cultivos Microbianos del ICA se desarrolló en tres etapas, que comprendieron el diseño de la estructura de la colección, la definición de los métodos de conservación para cada tipo de microorganismo y la elaboración de la documentación.
Para la organización y operación de esta colección se utilizaron los lineamientos de la Federación Mundial de Colecciones de Cultivo (WFCC 2010), las regulaciones de seguridad biológica (CE 1999 y CITMA 2000, 2004), los requisitos de los sistemas de calidad (NC ISO 9001: 2015) y los requisitos para la competencia de los laboratorios (NC-ISO/IEC 17025: 2006).
]]> Diseño de la colección. El diseño de la estructura de la colección comprendió la selección del material biológico a conservar, la recopilación de la información existente de cada cepa y la definición de las subcolecciones. Se utilizaron como criterios de selección la correcta identificación del microorganismo y los resultados que demostraran su potencial para incrementar la productividad animal. Estos principios se establecieron como base en las políticas para aceptar nuevas cepas que se integran a la colección.Conservación de microorganismos. Para la conservación a corto plazo se definió el método de las siembras periódicas para todas las cepas. Como método de preservación a largo plazo se estableció la congelación y se diseñaron tres metodologías de trabajo, al tener en cuenta el tipo de microorganismo:
a) Conservación de bacterias ácido lácticas por congelación con leche extracto de levadura (LEL) y glicerol como crioprotector (Saab et al. 2001 y Belmonte et al. 2008).
b) Conservación de hongos filamentosos por congelación con glicerol al 10 % (López-Lastra et al. 2001 y Gutiérrez et al. 2017).
c) Conservación de levaduras por congelación con glicerol al 20 % (Bond 2007 y Kurtzman et al. 2011).
Elaboración de la documentación. Los Procedimientos Normalizados de Operación (PNO) para la correcta operación de la colección de microorganismos se redactaron sobre la base de la bibliografía especializada en la temática y los procedimientos generales del Sistema de Gestión de la Calidad del Instituto de Ciencia Animal.
Se elaboró el catálogo de la colección con el objetivo de promocionar los productos y servicios que derivan de la colección. Para diseñar, estructurar y organizar el contenido se realizaron búsquedas de información que mostraron catálogos con objetivos similares.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Diseño de la colección. Se definió que la colección estaría formada por tres subcolecciones: levaduras, bacterias ácido lácticas y hongos filamentosos (figura 1).
]]> La subcolección de levaduras (tabla 1) está compuesta por cepas aisladas del rumen de vacas que consumieron un producto fermentado rico en levaduras (Marrero et al. 2005). Todas las levaduras se identificaron por pruebas bioquímicas y moleculares (Marrero et al. 2011, 2013).
Las cepas conservadas estimulan la fermentación ruminal en animales que consumen dietas con alto contenido en fibra (Marrero et al. 2012, 2014, 2015). Se demostró su efecto en la reducción de las poblaciones de bacterias metanógenicas y la producción de metano (Galindo et al. 2010). Con su inclusión en la dieta de rumiantes se observaron aumento de bacterias y hongos celulolíticos (Marrero et al. 2006).
La subcolección de hongos (tabla 2) la conforman siete cepas altas productoras de enzimas lignocelulolíticas aisladas de materiales vegetales contaminados y una cepa de Aspergillus oryzae procedente de la colección del Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar (ICIDCA).
El empleo de estos microorganismos en procesos fermentativos favorece la degradación del sustrato e incrementa la disponibilidad de nutrientes contenidos en el alimento (Valiño et al. 2004, 2015a,b). En el caso de A. oryzae se demostró su efecto en la estimulación de la fermentación ruminal de sustratos fibrosos (Sosa et al. 2010b). Con su inclusión incrementaron las poblaciones de bacterias totales, celulolíticas y hongos del rumen y consecuentemente las concentraciones de ácidos grasos de cadena corta (Sosa et al. 2010a).
Por último, la subcolección de bacterias ácido lácticas (tabla 3) la integran cepas aisladas del tracto gastrointestinal de pollos de ceba alimentados con dieta basada en soya y maíz (García-Hernández et al. 2012). Todos los aislados se identificaron por pruebas bioquímicas y secuenciación del gen 16S ARN ribosomal (García-Hernández et al. 2016).
]]>
La inclusión de estos microorganismos a la dieta de pollos y cerdos en etapa de crecimiento ejerce efectos beneficiosos en indicadores morfo-fisiológicos, mejora la salud intestinal, incrementa indicadores productivos y en el caso de las aves, aumenta el rendimiento cárnico (Ayala et al. 2014 y García-Hernández et al. 2016).
Para cada subcolección se designaron los curadores, teniendo en cuenta al personal con mayor experiencia y conocimientos no sólo de los propios microorganismos y la taxonomía básica, sino también de sus condiciones de crecimiento y preservación, sus propiedades y potenciales aplicaciones.
Las secuencias de todos los microorganismos que conforman la colección se encuentran depositadas en el GenBank del Centro Mundial de Datos de Microorganismos (WDCM, por sus siglas en inglés) (WDCM 2015). La colección se registró en la FELACC y en el WDCM. Los curadores y personal vinculado a los trabajos de investigación son miembros de la Sección de Colecciones Cubanas de Cultivos Microbianos. El ICA posee la membresía institucional en la FELACC y en la WFCC. Lo anterior facilita el intercambio con otras instituciones y la superación en temas relacionados con el trabajo de la colección.
Conservación de microorganismos. La conservación de microorganismos a largo plazo por congelación, se utiliza ampliamente en diferentes especies microbianas y garantiza la estabilidad genética de los microorganismos. Sin embargo, el éxito de este método depende de factores como el tipo de materiales y la elección del crioprotector (Singh y Baghela 2017).
a) Conservación de bacterias ácido lácticas por congelación con LEL–glicerol como crioprotector
Las bacterias se sembraron en placas Petri con Agar De Man, Rogosa y Sharpe (MRS) (De Man et al. 1960) y se incubaron a 37 ºC por 24 horas, se pasaron a caldo MRS y se incubaron a 37 ºC por 24 horas. El cultivo se pasó a tubos Falcon de 50 mL de capacidad y se centrifugó a 4000 rpm por 10 minutos en centrífuga Neofuge 15R (Heal Force, China), se decantó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 16 mL de solución de leche extracto de levadura (LEL) y glicerol.
b) Conservación de hongos filamentosos por congelación con glicerol al 10 %
Los hongos se sembraron en erlenmeyer que contenían 30 mL de Agar Papa Dextrosa (PDA) y se incubaron a 30 ºC durante siete días. Se adicionó a cada erlenmeyer 60 mL de solución de agua destilada y glicerol al 10 %. Se realizó arrastre de la superficie esporulada y se filtró la suspensión de esporas por lana de vidrio.
c) Conservación de levaduras por congelación con glicerol al 20 %
]]> Las levaduras se sembraron en placas Petri con Agar Extracto de Levadura-Peptona-Glucosa (YPG) y se incubaron a 30 ºC por 24 horas, se pasaron a caldo YPG y se incubaron a 30 ºC por 24 horas. El cultivo se pasó a tubos Falcon de 50 mL de capacidad y se centrifugó a 4000 rpm por 10 minutos, se decantó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 40 mL de solución de medio fresco y glicerol al 20 %.En todos los casos se distribuyó 1 mL de cultivo con crioprotector en eppendorff de 2 mL de capacidad, se congelaron gradualmente y se almacenaron en congelador (MDF-C8V1, Sanyo, Japón) a -80 ºC. Se tomaron muestras para determinación de la concentración de células viables de los cultivos conservados.
Los métodos seleccionados coinciden con los que utilizaron otros autores para estos grupos microbianos. La conservación por congelación con LEL-glicerol como crioprotector se utilizó en cepas de bacterias ácido lácticas para la industria alimenticia (Zamora 2003). El método que se utilizó para la conservación de hongos filamentosos, se emplea ampliamente en la preservación de hongos patógenos (Gutiérrez et al. 2009, 2017). En el caso de la levaduras, Gujjari et al. (2010) demostraron la efectividad de la congelación para mantener la integridad genética de las cepas que se conservan por este método.
Elaboración de la documentación. La colección dispone de un PNO en el que se declaran las funciones, responsabilidades y los objetivos fundamentales de la colección, en correspondencia con las regulaciones vigentes y el sistema de Calidad del ICA. En este documento se establecieron los pasos a seguir para la recepción de las cepas, preparación y conservación de los bancos primarios y de trabajo, y los controles a realizar a estos bancos. Se definió la documentación oficial de la colección que comprendió: Registros de entrada y salida del material biológico, control de cepas conservadas y registro cepa. Este último incluye los datos de fecha de aislamiento; hospedero/sustrato; localidad, provincia, país; medio de cultivo en el cual se aisló; fecha, lugar y método de identificación y el método de preservación. La información relativa al origen y el estado de la cepa garantizan la fiabilidad para su empleo en la investigación y la producción, pues en ambos casos es imprescindible la verificación de la identidad, conservación, estabilidad y protección del microorganismo (Boundy-Mills et al. 2016).
En otro grupo de procedimientos se describieron las metodologías para la conservación de los diferentes grupos microbianos y las determinaciones de viabilidad, pureza y estabilidad genética de los cultivos. Se desarrollaron protocolos de investigación que permitieron seleccionar el método óptimo de preservación para cada cepa, el tiempo de conservación y el número máximo de subcultivos que garantizan la estabilidad de los microorganismos.
Como parte fundamental de la documentación se cuenta con el catálogo de la colección. Se definió la frecuencia anual de actualización de la edición. Presenta en la portada el título que lo identifica, el departamento, la institución y el año en curso. En la sección “Inicio”, detalla el origen del producto, el objetivo y otros elementos descriptivos que avalan la confiabilidad de la oferta. El contenido del catálogo se agrupa en una tabla para visualizar mejor la oferta de información. Las partes que ofrece el catálogo son las siguientes:
1. Cepario (descripción de cada cepa, método de conservación, aplicaciones y curador)
2. Regulaciones
3. Artículos científicos de referencia
4. Servicios disponibles
]]> 5. Modelo de solicitud de pedido6. Contacto
Se eligió el medio de comunicación Internet para su publicidad y el formato pdf para soportar el producto informativo. De esta manera el catálogo quedó preparado para insertar en la página web de la institución y en otros espacios identificados estratégicamente para el mercado.
El catálogo permitirá la difusión de los resultados de la ciencia con fines comercializables al fomentar el uso de microorganismos con potencialidades para la alimentación animal en la producción local e industrial de alimentos y aditivos. Aporta a la actividad de divulgación y negociación de la institución con la oferta de un producto que promueve la venta o intercambio de cepas, así como, asesorías y servicios científico-técnicos relacionados con el aislamiento, identificación y conservación de cultivos microbianos. Facilita la comunicación directa con los responsables de las colecciones de cepas, lo cual viabiliza el intercambio científico.
Se concluye que el establecimiento de la colección de microorganismos del Instituto de Ciencia Animal, con métodos de conservación adecuados para cada grupo microbiano, garantiza la disponibilidad de cepas para la docencia, investigación y la obtención de aditivos para la alimentación animal.
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Recibido: 22/11/2017
Aceptado: 13/1/2018
Areadne Sosa, Instituto de Ciencia Animal, Apdo 24. San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. Email: asosa@ica.co.cu