Modelo cinático para la producción de celulasas por una cepa de aspergillus niger en fermentación sólida

Kinetic model for the production of cellulases by a strain of aspergillus niger in solid-state fermentation

Luis Beltrán Ramos-Sánchez^1*, Gualberto Leon-Revelo¹, Mario César Cujilema-Quitio¹, Linnet Baryolo¹, Ernesto Rosero Delgado² y Jesús Córdova³

¹ Departamento de Ingeniería Química, Universidad de Camagüey Ignacio Agramonte Loynaz, Circunvalación Norte km 5 ½, Camagüey, Cuba.

² Universidad Técnica de Manabí. Av. Urbina y Che Guevara, Manabí, Ecuador.

³ Departamento de Química. Universidad de Guadalajara. Av. Juárez 976 y América,

*Autor para la correspondencia: Luis Beltrán, Email: luis.ramos@reduc.edu.cu

RESUMEN

En este trabajo se presenta una propuesta de modelo cinético para describir la producción de celulasas en un proceso de fermentación sólida de una cepa de Aspergillus niger. La validación del modelo fue realizada a cinco temperaturas: 20; 25; 30; 35 y 40°C. En la validación fueron identificados los parámetros característicos del modelo haciendo uso de datos dinámicos generados a temperatura constante. Dentro de las variables respuestas descritas por el modelo se encuentran: la concentración de biomasa del hongo expresada como proteína verdadera, las concentraciones de: azúcares reductores, fibra bruta, actividades de PFasa, CMCasa y proteasas en el medio. Para la identificación de los parámetros fue programado el modelo del proceso en MATLAB y el procedimiento de ajuste no lineal de sus parámetros. Los resultados indican que el modelo es perfectamente aplicable para describir la cinética de la producción de celulasas en estas condiciones. Las temperaturas donde se observó una mayor producción de celulasas fueron 30°C y 35°C. Los niveles experimentales de PFasa y CMCasa son significativos pues se alcanzan máximos de PFasa de 60 UI g_MS^-1 y de CMCasa de 50 UI g_MS^-1 en un tiempo que oscila entre 24 y 30 horas. Los parámetros identificados se ven fuertemente asociados a la temperatura.

Palabras clave: celulasas; modelación; cinética; Aspergillus niger; fermentación sólida.

ABSTRACT

In this work a kinetic model proposal is presented for describing cellulase production in a solid-state fermentation process of an Aspergillus niger strain. The validation of the model was carried out at five temperatures: 20, 25, 30, 35 and 40°C. In the validation the characteristic parameters of the model were identified using a dynamic data generated at constant temperature. The response variables described by the model are: concentration of biomass of fungus measured as true protein, total reducing sugars, crude fiber, FPase activity, CMCase activity and the activity of proteases in the medium. For parameters identification the process model was programmed in MATLAB. The results indicate that the model is perfectly capable describing the cellulase production kinetics under these conditions. The temperatures where cellulase production was higher were 30°C and 35°C. The experimental levels of FPase and CMCase are significant because maxim values of FPase of 60 UI g_DW^-1 and of CMCase of 50 UI g_DW^-1 are reached in a fermentation time ranging from 24 to 30 hours. The identified parameters are strongly associated to temperature.

INTRODUCCIÓN

Durante las últimas dos décadas, el uso de celulasas ha aumentado considerablemente por sus amplias aplicaciones en diferentes industrias (Oulad y col., 2009). La fermentación en estado sólido (FES) tiene el potencial para volverse un método económicamente competitivo en la producción de celulasas, por las ventajas que presenta (Flodman y  Noureddini, 2013). La FES usa preferentemente hongos filamentosos como organismos productores, siendo el género Aspergillus ampliamente empleado (Ahamed y Vermette, 2008; Santos y col., 2011).

Los modelos cinéticos para la producción de celulasas son escasos en la amplia literatura consultada por los autores. En particular, se reporta un modelo propuesto para el cultivo sumergido de una cepa de Trichoderma viride (Velkovska y col., 1997). Resulta interesante en este modelo que el término de acumulación de enzima aparece no asociado al crecimiento y el término de desactivación enzimática se asocia con la concentración de la enzima. Shahriarinour y col. (2011) proponen el desarrollo de ecuaciones para explicar la síntesis de celulasas en cultivo sumergido, basadas en el modelo de Luedeking-Piret(Piret., 1959); pero, los autores no analizaron la síntesis y el consumo de azúcares, ni el crecimiento microbiano.Lo y col., (2010) proponen un modelo simplificado para la producción continua de celulasas en cultivo sumergido, usando polisacáridos inductores, pero no expusieron la parte del modelo dedicado a la síntesis de las enzimas. Por su parte, Hosseini y Shah (2011) estudiaron la hidrólisis enzimática, ofreciendo una profunda interpretación de la interacción de las enzimas con el sustrato lignocelulósico. Dimian y Bildea (2008) desarrollaron ecuaciones sobre la hidrólisis de la celulosa basadas en la inhibición competitiva de la glucosa, la celobiosa y la xilosa sobre las celulasas, así como la dependencia de los parámetros cinéticos con la temperatura. No se reportan trabajos que modelen la cinética de la producción de celulasas por fermentación sólida. No obstante, los trabajos antes referidos sirven de base para representar este proceso durante la fermentación sólida. La temperatura juega un papel muy importante en la producción de celulasas (Dubey y col., 2015). Se ha reportado que el óptimo de temperatura para la producción de celulasas se encuentra en un rango bastante amplio de: 20 a 50 ºC (Brijwani y  Vadlani., 2011; Colina y col., 2009; Dubey y col., 2015; Falkoski y col., 2013; Gamarra y col., 2010). La búsqueda de un modelo cinético que sirva a los fines prácticos del diseño debe ser capaz de representar el comportamiento de la actividad microbiana en un intervalo amplio de temperaturas alrededor de los niveles más favorable para el proceso. Por lo cual, es de sumo interés el estudio de la temperatura en la validación de un candidato a modelo del proceso.

Esta investigación tiene por objetivo validar la propuesta de un nuevo modelo cinético para la producción de celulasas, a diferentes temperaturas, en el cultivo de una cepa del hongo Aspergillus niger en procesos de fermentación en estado sólido.

MATERIALES Y MÉTODOS

2.1.1. Microorganismo y preparación de inóculo

Se utilizó la cepa UC33 de Aspergillus niger de la colección del grupo científico de Desarrollo de Bioprocesos de la Universidad de Camagüey. Las cepas se conservaron en un medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA), a temperatura de 4±1°C.

La propagación del inóculo se realizó mediante el método propuesto por Mossawi y col. (2016). El microorganismo se cultivó en placas Petri con 10 mL de un medio con extracto de levadura (10 g/L), peptona (10 g/L), dextrosa (20 g/L), agar (15 g/L). Se inoculó siguiendo la técnica de estriado. Después de 72 horas de incubación a 30°C, se cosecharon los conidios, los que fueron arrastrados con agua destilada estéril. Esta suspensión de conidios se inoculó en una concentración de 1x10⁷ conidios/mL en un medio líquido, extracto de levadura (10 g/L), peptona (10 g/L) y miel final de caña (43 g/L). La producción de micelio se realizó, incubando a 30°C y 150 rpm de agitación por 30 horas.

2.1.2. Material lignocelulósico inductor y su pretratamiento

Se utilizó un medio no reportado por la literatura rico en fuentes de carbono y nitrógeno. Este medio consta de, afrecho cervecero proporcionado por la cervecería Tínima y la cáscara de arroz procedente de una fábrica de pienso local, ambas localizadas en la provincia de Camagüey. Las materias primas fueron secadas a 70°C durante 24 h y se guardaron en bolsas plásticas hasta su posterior uso (León-Revelo., 2017).

A la cáscara de arroz se le realizó un pretratamiento con ácido sulfúrico al 1% durante 2h, a temperatura ambiente (Galbe y  Zacchi., 2007). Al afrecho cervecero, sin embargo, se decidió no realizarle procedimiento alguno, ya que éste, al ser un residuo de la fabricación de cerveza, ha recibido pretratamientos térmicos y enzimáticos durante el proceso de maceración de la cebada haciendo factible para el ataque de las enzimas celulolíticas.

2.1.3. Fermentación en Estado Sólido (FES)

2.1.4. Extracción del crudo enzimático

Para extraer las celulasas fue necesario suspender el material fermentado en agua destilada en una relación de 1:9 y agitarlo a 200 rpm por 1h a temperatura ambiente. Seguidamente, el material suspendido y la biomasa fúngica fueron separados por centrifugación (10000 rpm durante 15 min). El sobrenadante filtrado fue usado como fuente para la determinación de las enzimas en estudio y los azúcares.

2.2. Técnicas analíticas

2.2.1. Concentración de la biomasa del hongo como proteína verdadera

La biomasa del hongo es muy difícil calcularla directamente pues penetra y se adhiere fuertemente en el sólido durante su crecimiento. Es por ello que se utiliza un método indirecto. Se determina el contenido de proteína verdadera, la que es proporcional a la biomasa del microorganismo (Farinas y col., 2011). La concentración de proteína verdadera fue determinada mediante el método Berstein (Winton y  Winton., 1944) en el medio sólido fermentado. La muestra fue lavada previamente para retirar el nitrógeno soluble, proteico y así dejar en el sólido al residuo lignocelulósico y la biomasa fúngica que se encuentra fijada al material. El resultado contiene la proteína de la biomasa del hongo junto con la proteína insoluble presente en el afrecho cervecero. Las concentraciones de proteína se consideran constante por estar ligada a la estructura lignocelulósica de este material. En cambio, la proteína total del hongo crece con el tiempo al incorporar éste el nitrógeno proteico y no proteico suministrado con el medio de cultivo. En estas condiciones algunos parámetros del modelo asociados a la biomasa del hongo tendrán valores algo superiores respecto a si se midiera sólo la biomasa del hongo. De cualquier modo, los resultados servirán a los efectos del diseño del proceso para este medio.

2.2.2. Análisis de la actividad enzimática PFasa y CMCasa

2.2.3. Análisis de la actividad proteasa

La actividad proteasa se determinó por el método descrito por Shang-Shyng y Jan-Yi (1999), que utiliza como sustrato a la caseína. Una unidad de actividad de proteasas se definió como la cantidad de enzima que produjo una absorbancia a 280 nm equivalente a un 1 µmol de péptidos obtenidos de la hidrólisis de la caseína (sustrato) en un minuto, bajo las condiciones del ensayo.

2.2.4. Análisis de los azúcares reductores totales (ART)

La concentración de ART  fue medida con el método del DNS, según Chaplin (1986). La concentración fue expresada en (g ART/kg de masa sólida seca).

2.3. Diseño experimental

Se escogieron cuatro niveles de temperatura (20; 25; 30 y 35 ºC) de incubación y cinco niveles de tiempo (6; 12; 18; 24 y 30 horas) para medir la dinámica de las variables (León-Revelo., 2017). El experimento se replicó dos veces y las mediciones se realizaron por triplicado. Se midieron en cada caso las variables respuestas: humedad del sólido, el pH, los ART, la actividad papel filtro (PFasa), la actividad carboximetilcelulasa (CMCasa), la actividad proteasa, el contenido de fibra bruta y el contenido de proteína verdadera como medida del crecimiento celular.

2.4. Modelo matemático del proceso

2.4.1. Modelo cinético de la actividad del hongo en el medio celulósico

Se considera que las hifas tienen como actividad fundamental crecer, excretar enzimas, así como, adquirir por diferentes mecanismos de transporte molecular, aminoácidos, azúcares derivados de la actividad de las celulasas sobre la fibra lignocelulósica, así como otros nutrientes inicialmente presentes en el medio sólido (Figura 1). Las celulasas por su parte actúan en forma combinada como ya se ha explicado antes (Castro., 2010; Mathew y col., 2008) sobre las regiones  cristalina y amorfa de la celulosa, produciendo azúcares más simples con la b-glucosidasa (Figura 1).

Las proteasas tienen una actividad de recuperación, para el consumo del hongo, de compuestos proteicos existentes inicialmente en el medio o, colocados allí por la actividad metabólica del hongo, como es el caso del complejo celulolítico. Esta actividad limita en cierta forma la actividad celulolítica global del proceso. El modelo matemático de la cinética se expone en la tabla 1. Las ecuaciones (1) y (2) describen la velocidad de crecimiento celular. Se consideró que la velocidad de muerte celular era despreciable en el corto intervalo de tiempo que duró el proceso. La velocidad específica de crecimiento fue descrita por el modelo Logístico, ecuación (1). El consumo de sustrato para la síntesis de biomasa fúngica, el mantenimiento celular y la síntesis de las enzimas: PFasa y proteasas se describen por las ecuaciones (3) y (5). En este término no se incluye la CMCasa, pues la PFasa contiene el efecto combinado de todas las celulasas.

La cinética de la producción de las enzimas está basado en el modelo propuesto por Piret (1959) y se encuentra representado en las ecuaciones (6) a la (8). La síntesis de estas enzimas está asociada al crecimiento celular (Bhat y  Bhat, 1997; Mathew y col., 2008), por lo que la velocidad de síntesis es proporcional a la velocidad de producción de la biomasa fúngica. Adicionalmente, se postuló la existencia de un término negativo asociado a la concentración de biomasa, o sea, un término no asociado al crecimiento. En la fermentación sólida el área superficial, aunque grande, es limitada. Por observaciones previas, durante la optimización del medio de cultivo utilizado, se pudo constatar que el hongo crece muy intensamente en apenas 30 horas. Esto hizo suponer que la falta de espacio vital podría afectar la producción específica de las enzimas por unidad de biomasa (UI/g_PV). Adicionalmente, este término negativo podría contener, al mismo tiempo, los efectos de la desnaturalización de la enzima debida a reacciones irreversibles en el medio (Ximenes y col., 2011). La presencia del término Xv (concentración de la biomasa del hongo) podría estar describiendo la asociación de este mecanismo con el tiempo, en el cual Xv crece. En la velocidad neta de síntesis de las enzimas celulolíticas (ecuaciones (6) a la (8)), se consideró la existencia de una reacción adversa al aumento de su concentración. Esta es la hidrólisis de estas enzimas, catalizada por las proteasas existentes en el medio y producidas por el propio hongo.

Como resultado de la actividad celulolítica se producen azúcares que son consumidos por el hongo en su crecimiento. Para este proceso, se propuso un modelo (ecuación (9)) que describe la síntesis de los azúcares proporcional a la velocidad de síntesis de la enzima PFasa y para el consumo de estos azúcares se consideró serían proporcionales a la velocidad de síntesis de la biomasa fúngica.

Donde: m_S – Coeficiente de mantenimiento celular (g_FBh^-1 g_PV^-1); r_ART - Velocidad neta de síntesis de ART (g_ART h^-1); r_CMC - Velocidad de síntesis de la enzima CMCasa (UI h^-1 kg_MS^-1); r_pf - Velocidad de síntesis de la enzima PFasa (UI h^-1 kg_MS^-1); r_prot - Velocidad de síntesis de la enzima proteasa (UI h^-1 kg_MS^-1); r_Sm - Velocidad de consumo de nutrientes para el mantenimiento celular (g_FBh^-1 kg_MS^-1); r_Sp - Velocidad de consumo de sustrato para la síntesis de enzimas (g_FB h^-1 g); r_Sx - Velocidad de consumo de fibra bruta para la síntesis de células (g_FB h^-1 kg_MS^-1); r_Xv - Velocidad de síntesis de biomasa

La identificación de las constantes cinéticas servirá como evidencia sobre lo adecuado del modelo para representar el comportamiento real del sistema.

2.4.2. Balances de masa en la fase sólida

El balance de masa considera que el proceso de fermentación es discontinuo en la fase sólida (Tabla 2). En la fase sólida se tuvieron en cuenta la concentración de la biomasa fúngica, la concentración de la fibra bruta (como medida de la disponibilidad de fuente de carbono), las actividades: PFasa, CMCasa y proteasa, así como la concentración neta de azúcares reductores totales.

2.5. Identificación de los parámetros cinéticos a diferentes temperaturas

El modelo del proceso de fermentación sólida expuesto en la tabla 1 y en la tabla 2 fue programado usando la plataforma de cálculo MATLAB, versión: 8.1.0.604 (R2013a). Para la identificación de los parámetros cinéticos se hizo uso de una herramienta de ajuste no lineal multifactorial: lsqcurvefit. Esta función usa algoritmos para resolver el problema de optimización en el que se minimiza la suma de cuadrados dada por:

 

El ajuste de las dinámicas del proceso a diferentes temperaturas se hizo con las ecuaciones de la tabla 1 y tabla 2. La variable independiente es el tiempo y la temperatura un parámetro en cada dinámica. Las variables respuestas en el ajuste de las dinámicas vienen dadas por el vector de la concentración de biomasa, de fibra bruta, de ART y de las actividades enzimáticas: PFasa, CMCasa y de las proteasas, obtenidas a diferentes tiempos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 Ajuste del crecimiento fúngico

El modelo Logístico describe la cinética del crecimiento y se ajusta a los datos experimentales de producción de biomasa proteica. Esto coincide con lo reportado por Julián-Ricardo (2008). El modelo considera que el sustrato no es una limitante para el crecimiento, mientras que X_max es la que describe el límite del crecimiento en el proceso_. Según este modelo, la inhibición del crecimiento se produce por la reducción del espacio vital, al ocupar el micelio el espacio intrapartícula e inter-partícula del sólido. Los coeficientes de determinación calculados para el ajuste del modelo logístico en cada temperatura (tabla 3) muestran altos valores, lo que corroboran la correspondencia observada entre datos calculados y observados. Esta correlación se aprecia en la figura 2 para dos temperaturas, 30°C y 35°C.

Los valores calculados de velocidad específica de crecimiento máxima de la biomasa proteica son altos para el crecimiento en un proceso celulolítico, lo que demuestra la calidad del medio para promover el crecimiento fúngico. Los resultados indican que en el rango de temperatura de 30 a 35 ºC se maximizan µ_max y X_max. En este intervalo, µ_max llega a alcanzar niveles superiores a 0,15 h^-1; mientras que, X_max alcanzó niveles por encima de los 110 g_pv/kg_MS. Estos resultados son superiores a los reportados por varios autores como: (Saithi y col., 2016; Shahriarinour y col., 2011; Velkovska y col., 1997). En el caso de Xmax debe recordarse que no todo su valor pertenece a la biomasa del hongo pues el propio medio tiene una pequeña cantidad inicial que no ha sido restada.

Por los altos niveles de proteína finalmente alcanzados en el sólido, reflejados en los valores de X_max (tabla 3), el residuo de esta fermentación podría ser utilizado después de la extracción de las enzimas, como posible alimento para rumiantes, aprovechando el rico contenido proteico y su capacidad para estimular el crecimiento de la flora microbiana existente en el rumen de animales. De ser posible esta solución, aumentaría la factibilidad económica del proceso de la producción de celulasas.

3.2. Ajuste de la actividad enzimática

Se puede observar que el modelo propuesto predice el comportamiento de los datos experimentales desde el punto cualitativo y cuantitativo para las tres enzimas medidas: actividad PFasa, CMCasa, así como la actividad de las proteasas. Prueba de ello son los niveles del coeficiente de determinación del ajuste que, en la mayoría de, los casos es superior al 0,90 y oscila entre 0,88 y 0,98; en los datos mostrados en la figura 2. El buen ajuste del modelo se observa también para el resto de las variables respuestas analizadas: fibra bruta y ART.

Nótese en esta figura que los niveles de actividad PFasa alcanzados a 30°C oscilan entre 40 y 60 UI g_MS^-1 a las 24 horas, resultado éste importante para lograr un futuro proceso competitivo desde el punto de vista económico. La actividad CMCasa presenta un comportamiento semejante en ambas temperaturas y exhibe buenos niveles para esta enzima, los que oscilan entre 40-50 UI g_MS^-1. La actividad proteasa presentó comportamiento semejante a la CMCasa en las temperaturas mostradas pero, para todas las enzimas analizadas, temperaturas por debajo o por encima de estos dos valores afectan su actividad.

3.3. Ajuste de la dinámica de la fibra bruta y los ART

La dinámica de la fibra bruta en la figura 2 muestra que su conversión o degradación enzimática osciló entre 15-20% en las 30 horas de estudio, para las dos temperaturas mostradas, en la que se obtuvieron los mejores resultados de los cinco niveles analizados. Este resultado de conversión puede considerarse adecuado debido a los significativos resultados de actividad celulolítica alcanzados en ese tiempo.

3.4. Otros parámetros del modelo ajustado

En la tabla 4se muestra la   interpretación de la dependencia de los  parámetros cinéticos con la temperatura, que permitirá esclarecer aspectos importantes para el diseño del proceso de producción de celulasas  en las condiciones indicadas. Por otra parte, la tabla 5 ofrecen todas las constantes cinéticas ajustadas a cada dinámica experimental obtenida para cada temperatura de cultivo. En estas dos tablas se observa que la temperatura ofrece una significativa influencia sobre los valores de estos parámetros. Dado que los parámetros cinéticos se modifican con la temperatura, sería conveniente para el diseño del proceso, identificar modelos matemáticos adicionales que sean capaces de predecir la dependencia de estos datos con la temperatura.

En la vasta literatura consultada se encontraron pocos trabajos sobre cinética de producción de celulasas con hongos filamentosos, por lo que se considera que el modelo propuesto en este trabajo es de interés para futuras investigaciones.

CONCLUSIONES

1.   El modelo cinético propuesto consiguió representar adecuadamente los datos experimentales generados en cada cultivo de Aspergillus niger a las diferentes temperaturas.

2.   Las dinámicas experimentales indican que las temperaturas más adecuadas para la producción de celulasas están en el rango de 30 a 35°C.

3.   En las condiciones estudiadas se alcanzaron actividades PFasa de 60 UI g_MS^-1 y de CMCasa de 50 UI g_MS^-1, en un tiempo que va de 24 a 30 horas, resultados que se consideran muy productivos.

AGRADECIMIENTOS

REFERENCIAS

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Recibido: Noviembre 10, 2016
Revisado: Agosto 29, 2017
Aceptado: Octubre 27, 2017