0034-7515 0034-7515 S0034-75151996000100001 00 04 1996 00 04 1996 30 1 0 0

Artículos Originales Planta de Hemoderivados. Ciudad de La Habana

Utilización de la ultrafiltración en la producción de las inmunoglobulinas

María Esther Castellano Becerrill,1 Armando Cádiz Lahens,2 Lorenzo Sánchez Gallardo1 y Héctor Borrero Larger3

1 Especialista A en Producción de Hemoderivados.
2 Investigador Auxiliar.
3 Investigador Aspirante.

RESUMEN

Se presentan las experiencias de sustitución de la liofilización por ultradiafiltración como etapa intermedia para la eliminación del etanol, sales y contaminantes proteicos de peso molecular inferior al cut-off del módulo usado (100 kd), en la producción de inmunoglobulinas obtenidas por el método de fraccionamiento de alcohol en frío. Se evalúan las ventajas del uso ultrafiltro desde el punto de vista económico por el aumento de rendimientos, y la factibilidad de obtener un producto libre de polímeros, lo que aumenta la calidad del preparado. Se compara el sistema de membranas planas con los cartuchos de fibra hueca en cuanto a flujo de trabajo.

Palabras clave: ULTRAFILTRACION; LIOFILIZACION; POLIMEROS; INMUNOGLOBULINAS.

INTRODUCCION

La aplicación de la ultrafiltración en el proceso de fraccionamiento de las proteínas plasmáticas data de 1975, donde se empezaron a obtener productos estables mediante la aplicación de este método en sustitución de la liofilización, con el objetivo de eliminar el etanol y las sales de los preparados, fundamentalmente de la albúmina.1

A partir de la década del 80 esta técnica tomó gran importancia pudiéndose lograr concentraciones terapéu-ticas de inmunoglobulinas al 16 % de concentración a pesar de su alta viscosidad, lo cual fue facilitado por el uso de las membranas planas.2

En el momento actual se utiliza esta tecnología como paso intermedio para eliminar el alcohol y las sales durante el proceso de producción de las inmunoglobulinas intravenosas (IGIV),3,4 dejando la liofilización solamente para la formulación de aquellos productos que no son estables en estado líquido y necesitan para su almacenamiento la forma liofilizada.5-7

La ultrafiltración no sólo elimina el agente precipitante o sales del sistema, sino también puede eliminar otras proteínas con pesos moleculares inferiores al cut-off del módulo utilizado pudiendo concentrar la inmunoglobulina al nivel deseado en la formulación final.

Las preparaciones de inmunoglobulinas son más viscosas que las de la albúmina, lo cual hace más difícil su concentración. Es por ello que se debe tener especial cuidado en la selección en el sistema de ultrafiltración.

El objetivo de este trabajo es demostrar las ventajas de la ultrafiltración sobre la liofilización como etapa intermedia para la eliminación del etanol en la producción de las inmunoglobulinas obtenidas por el método de Cohn,8 analizando también la formación de polímeros por ambos métodos. Dada la alta viscosidad del preparado quisimos comprobar si existían diferencias en cuanto al uso de las membranas planas y la fibra hueca.

MATERIAL Y METODO

Utilizamos pastas II provenientes del fraccionamiento alcohólico de Cohn8 modificado (Cádiz A. Modificaciones tecnológicas al método de Cohn. Primer Forum Nacional de Energía. Libro Resúmenes. La Habana, 1984:57.), obtenidas en la Planta de Hemoderivados de Ciudad de La Habana. Estas se restituyeron 10 veces peso/volumen con agua apirogénica realizándole una filtración previa a la ultrafiltración por cartuchos Sartorius de 0,2 m de poro. ]]> La ultradiafiltración se llevó a cabo en 7 lotes, para lo cual se utilizó un Sartocon mini de la Sartorius con placas de flujo tangencial y 0,5 m2 de superficie. Dos lotes se procesaron con un equipo de la Amicon con cartuchos de fibra hueca de una superficie total de 4,2 m2.

En la etapa de ultrafiltración el lote se llevó del volumen inicial restituido hasta un volumen 5 veces menor. El permeado se analizó durante todo el proceso con vistas a detectar fugas de inmunoglobulinas.

La diafiltración se llevó a cabo mediante el intercambio de 5 volúmenes de agua apirogénica por volumen del ultrafiltrado.

Posterior a la diafiltración, el granel obtenido se ajusta en su concentración proteica, para lo cual se siguió el mismo esquema de producción de las inmunoglobulinas en la Planta de Hemoderivados.

El estudio cromatográfico se realizó con la utilización de una columna de Supherose 6 HR (10/30) acoplada a un sistema FPLC.

RESULTADOS

En la tabla 1 se observan las características fundamentales de las mem-branas de ultrafiltración utilizadas. La alta resistencia a la presión de los ultrafiltros de membrana plana permite concentrar a valores mucho mayores que los de fibra hueca en tiempos menores de trabajo.
TABLA 1. Características de las membranas de ultrafiltración utilizadas

Tipo de membrana Características Fabricante

Planas - Excelente resistencia a la presión Sartorius

- Alta capacidad de concentración de proteínas

- Pequeños volúmenes muertos ]]> - Tiempos cortos de ultrafiltración

Fibra hueca - Resistencia moderada a la presión Amicon

- Menor capacidad de concentración de proteínas

- Pequeños volúmenes muertos

- Tiempos largos de ultrafiltración

La tabla 2 presenta los resultados de la ultradiafiltración en 7 lotes de inmunoglobulinas con la utilización del sistema de membranas planas.

TABLA 2. Resultado de la ultradiafiltración por membranas planas. (Sartorius)

 

No. de lote 

 ]]> Concentración proteínas de inicial
Concentración proteínas de inicial
Volumen final
Volumen de intercambio
Presión de entrada
Flujo promedio
Flujo promedio
 
(L)
(%)
(%)
 ]]> (L)
(bar)
(L/h/0,1 m)
(L/h/m)
1
18
2,54
14,5
20
0,8
1,15
 ]]> 11,5
2
20
2,00
15,0
20
0,8
1,09
10,9
3
20
2,54
 ]]> 15,0
20
0,8
1,17
11,7
4
20
2,40
15,5
20
0,8
 ]]> 1,01
10,1
5
20
2,30
14,5
20
0,8
1,09
10,9
6
20
 ]]> 2,47
15,0
20
0,8
1,04
10,4
7
20
2,90
15,0
20
 ]]> 1,2
1,26
12,6
_
19,7
2,45
14,9
20
0,86
1,12
11,2
Nota: Módulo usado: 100 kd; temperatura: 8 EC; solución proteica: Pasta II (IgG) método Cohn modificado por Cádiz et al. ]]> Puede observarse cómo se alcanzan concentraciones de proteína del 15 % con flujos promedios de 10-12 L/h/m2. Comparado con el sistema de fibra hueca (tabla 3), la concentración de proteína alcanzada fue del 30 % menor, entre 9-10 g %, y el flujo promedio fue aproximadamente de 2,2 L/h/m2, o sea, unas 5 veces menos eficiente que el sistema de membrana plana.
TABLA 3. Resultado de la ultradiafiltración por fibra hueca. (Amicon)
No. de lote
Concentración de proteínas inicial
Concentración de proteínas inicial
Volumen final
Volumen de intercambio
Presión de entrada
Flujo promedio
Flujo promedio
  ]]> (L)
(%)
(%)
(L)
(bar)
(L/h/0,1 m)
(L/h/m)
1
100
1,84
10,45
 ]]> 100
1,0
3,26
2,33
2
100
2,40
9,50
100
1,0
3,00
 ]]> 2,14
_
100
2,12
10,00
100
1,0
3,13
2,24
Nota: Módulo usado: 100 kd; temperatura: 8 EC; solución proteica: Pasta II (IgG) método Cohn modificado por Cádiz et al.

La tabla 4 demuestra las ventajas de la ultrafiltración sobre la liofilización ya que no se generan polímeros de IgG durante el proceso, mientras que en la liofilización la agregación puede tomar valores de hasta el 4 %.

TABLA 4. Polímeros en lotes ultrafiltrados y liofilizados
]]>
No. de lote
Equipo utilizado
Monómero + dímero
Polímeros
1
Sartocon
100
0
2
 ]]> Sartocon
100
0
3
Sartocon
100
0
4
Sartocon
100
 ]]> 0
5
Sartocon
100
0
6
Sartocon
100
0
7
 ]]> Sartocon
100
0
1
Amicon
100
0
2
Amicon
100
 ]]> 0
01031
Liofilización
95,65
4,35
02031
Liofilización
95,36
4,64
05031
 ]]> Liofilización
97,64
2,36
10031
Liofilización
97,40
2,60
03021
Liofilización
98,06
 ]]> 1,94

DISCUSION

La ultrafiltración es una filtración molecular. Esta discrimina entre moléculas de diferentes tamaño y, por lo tanto, entre moléculas de diferentes pesos moleculares.

Las ventajas de la ultrafiltración sobre otros procesos de separación son:9

- No introduce cambios de fase.
- Bajo costo energético.
- Equipamiento sencillo.
- No se usan sistemas de calentamiento.
- Requiere un mínimo de trabajo.

La liofilización introduce cambios importantes en la molécula de IgG, que pueden ir desde la activación espontánea de la filtración de complemento hasta la producción de quininas biológicamente activas, éstas son productoras del efecto hipotensor en los pacientes que reciben el producto.10,11

La utilización de un cut-off de 100 kd en el sistema de ultrafiltración permite también eliminar contaminantes proteicos de peso molecular menor a esta cifra. Especial importancia posee la eliminación de la ceruloplasmina y la albúmina de este preparado que se confunden con la fracción de monómeros en los productos liofilizados dada su concentración tan baja.12

En los ensayos realizados por ultrafiltración comparados con la liofilización se demuestra un aumento de rendimientos de aproximadamente 1g/L de plasma procesado (Castellano ME, Borrero H, Sánchez L, Cádiz, A. Sustitución de la liofilización por la ultrafiltración en la producción de hemoderivados. VIII Forum de Ciencias y Técnica. La Habana, 1993.) ]]> Entre los 2 sistemas de ultrafiltración que hemos utilizado existen diferencias que son importantes a la hora de escoger uno u otro para este tipo de producción específicamente (tabla 1). El sistema de membranas planas presenta una excelente resistencia a la presión y es capaz de llegar a altas concentraciones de proteínas (tabla 2). El sistema de fibra hueca resiste menos presión y disminuye su capacidad de ultrafiltración grandemente al aumento de concentración de proteínas (tabla 3).

En el caso especial de las inmunoglobulinas, éstas forman una capa coloidal que no incrementa simplemente su concentración en la superficie de la membrana al paso del tiempo, sino que tiende a formar una membrana secundaria conocida como membrana gelatinosa.9

También se encuentran diferencias significativas en el nivel de polímeros entre los productos ultrafiltrados y liofilizados. En las inmunoglobulinas ultrafiltradas no se observan polímeros mientras que con la liofilización se producen alrededor del 2-4 % de éstos (tabla 4).

Existen 2 fenómenos que apoyan estos resultados. Es conocido desde hace muchos años que la presión retarda la desnaturalización de las proteínas aun en presencia de etanol en concentraciones superiores a 0,3 molar,13 y la ultrafiltración trabaja con presiones positivas. Sin embargo, en el proceso de liofilización es necesario aplicar alto vacío y calor. Las pastas de IgG liofilizadas siguen una cinética de desnaturalización que resulta fenomenológicamente de primer orden, la cual se incrementa con la temperatura (Gutiérrez AM. Estudio de la conservación de albúmina y gammaglobulina liofilizadas. Tesis para obtener el título en Master en Ciencias Técnicas. Centro Nacional de Investigaciones Científicas. La Habana, 1995:23-32).

Concluyendo, podemos decir que la ultrafiltración presenta ventajas sobre la liofilización, lográndose productos de mayor calidad. Dada la alta viscosidad que alcanzan las soluciones de inmunoglobulinas incrementada por la baja temperatura de trabajo, es que preferimos los sistemas de membranas planas a los fibra hueca para la ultradiafiltración en este tipo de producción.

SUMMARY

The authors present the experiences in substituting the freeze-drying with the ultrafiltration, as an intermediate stage for the elimination of ethanol, salts and protein contaminants of inferior molecular weight to the cut-off of the used modulus (100 kd) in the production of immunoglobulins obtained through the cold alcohol fractionation method. The advantages of using the ultrafilter are evaluated from an economical point of view, due to the increase in yielding, and the feasibility of obtaining a polymers-free product, which increases the quality of the preparation. The plain membrane system is compared with empty fiber cartridges, with reference to the work flow.

Key words: ULTRAFILTRATION; FREEZE-DRYING; POLYMERS; IMMUNOGLOBULINS.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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    5. ]]>
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Recibido: 29 de junio de 1995. Aprobado: 27 de octubre de 1995. ]]> Lic. María Esther Castellano Becerril. Calle 122 No. 7101 entre 71 y 71A, Marianao, Ciudad de La Habana, Cuba. ]]> 1980 223-38 1986 1993 15-36 1987 83 4A 4A 46-51 1992 217-38 1986 8 374-81 1986 8 382-90 1986 476-506 1992 62 S82-6 1993 239-48 july ,1 99 1965 41