0034-75150034-7515S0034-75151996000100003000419960004199630100 Purificación de antígeno de Candida albicans para pruebas cutáneas: estudio preliminar Miriam Díaz, Isis García,1 Isabel Giraldino,2 Zuleyka López,3 y Miriam García,21 Licenciada en Farmacia. Investigadora Agregada. 2 Licenciada en Microbiología. 3 Licenciada en Bioquímica. Investigadora Agregada. 4 Licenciada en Bioquímica.
RESUMEN
La evaluación de la inmunidad celular mediante la respuesta producida por los linfocitos T, que son estimulados por la presencia de un antígeno determinado, es de sumo interés para el tratamiento de diversas enfermedades infecciosas que se producen durante el transcurso de quemaduras, lesiones, traumatismos, etcétera, por lo que la obtención de antígenos purificados para su uso en pruebas cutáneas que se emplean para dicha evaluación es de gran importancia. En nuestro trabajo nos dimos a la tarea de desarrollar un método de purificación para la obtención de uno de estos antígenos, a partir de la Candida albicans. El método utilizado fue el descrito por Buckley et al., al cual se le realizaron modificaciones. Se encontró que la metodología era adecuada y reproducible, pues el antígeno obtenido tenía características similares al antígeno de referencia.
Palabras clave: ANTIGENOS/aislamiento y purificación; CANDIDA ALBICANS/aislamiento y purificación. INMUNIDAD CELULAR; LINFOCITOS T; TEST CUTANEOS.
INTRODUCCION
En las últimas décadas el desarrollo de la inmunología ha permitido determinar las alteraciones en la respuesta inmune mediada por células ante agresiones, como: traumas, desnutrición, sepsis, entre otras, por lo que es de gran interés para la clínica el diagnóstico rápido y confiable de estas alteraciones para aplicar la terapia adecuada en dependencia de la afección específica.
Numerosas técnicas han sido utilizadas para el estudio de la inmunidad celular,1 una de ellas es el test de pruebas cutáneas que evalúa la hipersensibilidad cutánea retardada debido a la respuesta producida por los linfocitos T, que al ser estimulados por la presencia de un antígeno específico, llevan a cabo esta respuesta alrededor del antígeno.2
Este test se realiza por multipuntura de diferentes antígenos que se infiere que han estado en contacto con el paciente previamente, como son: Candida, Tricophyton, Clostridium tetani y Tuberculina.
Como mencionamos anteriormente uno de los antígenos utilizados para el test de pruebas cutáneas3 es el de la Candida la cual puede causar grandes infecciones en el hombre, como son las infecciones cutáneas de las mucosas intestinales y broncopulmonares,4 de ahí la importancia de su valoración.
El objetivo de este trabajo lo constituyó la evaluación de un método de purificación del antígeno proteico de Candida albicans para el test de pruebas cutáneas, de forma tal que sea posible lograr la adecuada disminución de las reacciones adversas e interferencias, optimizándose la respuesta inmunológica durante el ensayo.
MATERIAL Y METODO
Se elaboraron 3 lotes experimentales según la metodología siguiente:
Cultivo ]]>
La obtención de las masa celular se realizó a partir de un cultivo agitado de la cepa Candida albicans ATCC 10331 en medio Saboraud a una temperatura de 25 o C durante 7 días. Después de comprobar la pureza y viabilidad, el cultivo se centrifugó y el pellet se lavó con acetona; de esta forma se obtuvo la masa celular seca.5
Purificación
Se realizó una extracción con agua destilada a razón de 15 mL/g de célula seca. Se agitó durante 3 h y se centrifugó a 12.000 g durante 20 min a 4 o C. El volumen de sobrenadante se concentró 3 veces con polietilenglicol G-4 000 al 21 % (P/V). A las muestras concentradas se le añadió sulfato de amonio al 100 % de saturación con el objetivo de precipitar la proteína.6 Se dejó reposar 16 h a 4 o C; una vez transcurrido este tiempo se centrifugó a 20.000 g durante 20 min a 4 o C.
El precipitado obtenido se dializó contra agua destilada.
METODOS DE CONTROL DEL PROCESO DE PURIFICACION
El antígeno obtenido se comparó con un antígeno de Candida albicans de producción nacional (CENSA).
Se le determinó el pH.
Para la determinación del punto de máxima absorción se realizó un barrido en un espectrofotómetro Pye Unicam en el rango entre 200-500 nm
La concentración proteica se determinó según la técnica de Lowry.7
Para la determinación de carbohidratos se utilizó una técnica colorimétrica que emplea la 3-5 dinitrosalicilato.
Para la inmunoelectroforesis las placas se prepararon en agarosa al 1 % con buffer de fuerza iónica 0,025. Se utilizó amido negro como colorante para visualizar la reacción antígeno-anticuerpo y se empleó un antisuero de Candida albicans de producción nacional (CENSA).
RESULTADOS
En la tabla 1 se relacionan los valores obtenidos de pH de los 3 lotes experimentales.
TABLA 1. Determinación de pH
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Lotes
Valores de pH
Lote 1
5,18
Lote 2
5,19
Lote 3
5,27
Los resultados obtenidos de la medición espectrofotométrica en el rango entre 200 y 500 nm de los lotes ensayados, se pueden ver la tabla 2, comparados con el antígeno de producción nacional.
TABLA 2. Determinación del espectro de absorción
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Lotes
Valores del espectro de absorción en un rango de 200-500 nm (máximo de absorción)
Lote 1
260
Lote 2
260
Lote 3
260
Antígeno de producción nacional
]]>
(CENSA)
258
En la tabla 3 se presentan las concentraciones proteicas para cada lote por el método de Lowry.
TABLA 3. Determinación de la concentración de proteínas
Lotes
Valores de la concentración (m g/mL)
Lote 1
29,4
Lote 2
38,9
]]>
Lote 3
28,5
En la tabla 4 se comparan los valores de concentración de carbohidratos del cultivo antes y después de purificado.
TABLA 4. Determinación de carbohidratos
Lotes
Antes de purificar (mol/L)
Después de purificar (mol/L)
Lote 1
0,232
0,004
Lote 2
0,323
0,004
Lote 3
]]>
0,300
0,004
DISCUSION
Si analizamos lo valores de pH de cada lote y se comparan con el valor reportado en la bibliografía que es entre 4-6, vemos que existe correspondencia.
Por los resultados obtenidos luego de realizar la medición espectrofotométrica de los lotes de antígenos ensayados y compararlos con el antígeno de producción nacional, podemos comprobar que el máximo de absorción es similar, igual en todos los casos, lo mismo ocurre con las concentraciones proteicas, por lo que se aprecia una consistencia entre los lotes purificados.
Además existe una diminución de la concentración de carbohidratos en los lotes purificados, tal como se esperaba, durante el proceso.
Al analizar la inmunoelectroforesis se observa la línea de la reacción antígeno-anticuerpo específica, cuando se enfrentaron las muestras de antígeno purificado frente al antisuero de producción nacional, al igual que sucede con el antígeno de producción nacional, lo que demuestra la identidad del antígeno absorbido, por lo que el proceso de purificación planteado es adecuado.
CONCLUSIONES
Los cambios introducidos en nuestro trabajo a la técnica planteada por Buckley et al. para la obtención del antígeno de Candida albicans, los cuales fueron: la utilización del medio Sabouraud para el cultivo y el empleo de Polietilenglicol G 4 000 al 21 %, para la concentración del antígeno, fueron adecuados.
El método con las modificaciones propuestas a la técnica de Buckley et al., es reproducible por los resultados obtenidos, como primer paso en el proceso de obtención del antígeno Candida albicans.
SUMMARY
The assessment of cellular immunity by means of the response produced by T-lymphocytes stimulated by the presence of a determined antigen, is of great interest in the treatment of several infectious diseases during the course of burns, lesions, traumas, etc., and due to this it is very important to obtain purified antigens for their usage in the skin tests used in such assessment. The authors developed a purification method to obtain one of these antigens, from Candida albicans. They carried out modifications on the method described by Buckley et al., and found that the methodology was adequate and reproducible, since the antigen obtained had similar characteristics to those of the reference antigen.
Key words: ANTIGENS/isolation and purification; CANDIDA ALBICANS/isolation and purification; IMMUNITY, CELLULAR; T-LYMPHOCYTES; SKIN TESTS.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Knop J, Malorny U. Selection of the delayed hypersensitivity "T" effector and "T" suppresor cell response by antigen presenting macrophages. Immunobiology 1984;168:246-59.
Johnson C, Walls RS, Ruwoldt A. Delayed hypersensitivy to tetanus toxoid in man in vivo and in vitro. Studie Pathology 1983;15:369-72.
Jowetz E, Melnich J, Adelberg E. Manual de microbiología médica. La Habana: Editorial Pueblo y Educación, 1984:273-89.
Esch RE, Buckley CE. Candida albicans skin test antigen. J Biol Stand 1988;16:33-43.
Buckley III CE. Delayable hypersensitivy skin testing. Manual of Clinical Inmunology 3ed. Washington D.C.: American Society for Microbiology, 1986:260-73.
Lowry OH, Rosebrough NJF. Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem 1951;193:265-8.
Recibido: 13 de abril de 1994. Aprobado: 14 de septiembre de 1995.
Lic. Miriam Díaz. Concepción 759 entre 15 y 16, Lawton, Ciudad de La Habana, Cuba. ]]>198372487--901984168246-59198315369-721984273-8919881633-4319863ed260-731951193265-8